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Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in <em>Bacillus subtilis</em>

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

University of Michigan-Ann Arbor

Beta &#x5939;&#x662F;&#x6ED1;&#x52A8;&#x5939;&#x845B; DNA &#x5408;&#x6210;&#x6240;&#x9700;&#x57FA;&#x672C;&#x590D;&#x5236;&#x3002;Beta &#x5939;&#x4E5F;&#x662F;&#x5173;&#x952E;&#x7684;&#x51E0;&#x4E2A;&#x5176;&#x4ED6;&#x65B9;&#x9762;&#x7684; DNA &#x4EE3;&#x8C22;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC; DNA &#x9519;&#x914D;&#x4FEE;&#x590D; (MMR)&#x3002;&#x67AF;&#x8349;&#x82BD;&#x5B62;&#x6746;&#x83CC; dnaN5 &#x57FA;&#x56E0;&#x7F16;&#x7801;&#x4E00;&#x79CD;&#x7A81;&#x53D8;&#x5F62;&#x5F0F;&#x7684; beta &#x5939;&#x542B; G73R &#x66FF;&#x4EE3;&#x3002;DnaN5 &#x7B49;&#x4F4D;&#x57FA;&#x56E0;&#x4E0E;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6E29;&#x5EA6;&#x654F;&#x611F;&#x7684;&#x7F3A;&#x9677;&#x5728; 49 &#x5EA6; C&#x3001; DNA &#x590D;&#x5236;&#x800C;&#x589E;&#x957F;&#xFF0C;&#x5B83;&#x4EEC;&#x8868;&#x660E;&#xFF0C;&#x5B55;&#x4EA7;&#x5987;&#x6B7B;&#x4EA1;&#x7387;&#x5728;&#x7EB5;&#x5BB9;&#x6E29;&#x5EA6;&#x4E0B;&#x7684;&#x90E8;&#x5206;&#x7F3A;&#x9677;&#x5F15;&#x8D77;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x9891;&#x7387;&#x589E;&#x52A0;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x9009;&#x62E9;&#x4E86;&#x4E3A;&#x6551;&#x51FA;&#x6D3B;&#x529B;&#x5728; 49 &#x5EA6; C&#xFF0C;&#x4EE5;&#x786E;&#x5B9A;&#x662F;&#x5426;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5206;&#x79BB; DNA &#x590D;&#x5236;&#x7F3A;&#x9677;&#x7684; dnaN5 &#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x4ECE; MMR &#x7F3A;&#x9677;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5B64;&#x7ACB;&#x8FD8;&#x539F;&#x5728; nonpermissive &#x6E29;&#x5EA6;&#x7684;&#x589E;&#x957F;&#xFF0C;&#x540C;&#x65F6;&#x7EE7;&#x7EED;&#x7EF4;&#x6301;&#x5728;&#x7A81;&#x53D8;&#x9891;&#x7387;&#x7684;&#x589E;&#x52A0;&#x7684; dnaN5 &#x4E09;&#x4E2A;&#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x3002;&#x6240;&#x6709;&#x4E09;&#x4E2A; dnaN &#x7B49;&#x4F4D;&#x57FA;&#x56E0;&#x7F16;&#x7801; G73R &#x66FF;&#x6362;&#x4EE5;&#x53CA;&#x4E09;&#x4E2A;&#x65B0;&#x9519;&#x4E49;&#x7A81;&#x53D8;&#x4E4B;&#x4E00;&#x3002;&#x5B64;&#x7ACB;&#x7684;&#x9519;&#x4E49;&#x7A81;&#x53D8;&#x662F; S22P&#x3001; S181G&#x3001; E346K&#x3002;&#x5176;&#x4E2D;&#xFF0C;S181G &#x548C; E346K &#x4F4D;&#x4E8E;&#x758F;&#x6C34;&#x816D;&#x88C2;&#x7684; beta &#x7248;&#x5939;&#xFF0C;&#x88AB;&#x5360;&#x9886;&#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A; beta &#x5939;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5171;&#x540C;&#x7AD9;&#x70B9;&#x9644;&#x8FD1;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x51E0;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x663E;&#x793A;&#x4EA7;&#x751F;&#x7684;&#x6BCF;&#x4E2A; dnaN &#x7B49;&#x4F4D;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x9891;&#x7387;&#x7684;&#x589E;&#x52A0;&#x94FE;&#x63A5;&#x5230;&#x5B55;&#x4EA7;&#x5987;&#x6B7B;&#x4EA1;&#x7387;&#x7684;&#x7F3A;&#x9677;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0; S181G &#x548C; E346K &#x5141;&#x8BB8;&#x5728;&#x6E29;&#x5EA6;&#x5347;&#x9AD8;&#x7684;&#x589E;&#x957F;&#x5E76;&#x6CA1;&#x6709;&#x660E;&#x663E;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x7A81;&#x53D8;&#x9891;&#x7387;&#x65F6;&#x5206;&#x5F00; G73R&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#x67AF;&#x8349; beta &#x5939;&#x5177;&#x4F53;&#x6B8B;&#x7559;&#x53D8;&#x5316;&#x5206;&#x9694; beta &#x94B3;&#x4ECE;&#x5176;&#x5B55;&#x4EA7;&#x5987;&#x6B7B;&#x4EA1;&#x7387;&#x65B9;&#x9762;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684; DNA &#x590D;&#x5236;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

&#x82BD;&#x5B62;&#x6746;&#x83CC;&#x67AF;&#x8349; beta &#x5939;&#x5728;&#x5355;&#x72EC;&#x7684;&#x5176;&#x89D2;&#x8272;&#x4E0D;&#x5339;&#x914D;&#x4ECE; DNA &#x590D;&#x5236;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x4FEE;&#x590D;&#x3002;

The beta clamp is an essential replication sliding clamp required for processive DNA synthesis. The beta clamp is also critical for several additional aspects of DNA metabolism, including DNA mismatch repair (MMR). The dnaN5 allele of Bacillus subtilis encodes a mutant form of beta clamp containing the G73R substitution. Cells with the dnaN5 allele are temperature sensitive for growth due to a defect in DNA replication at 49 degrees C, and they show an increase in mutation frequency caused by a partial defect in MMR at permissive temperatures. We selected for intragenic suppressors of dnaN5 that rescued viability at 49 degrees C to determine if the DNA replication defect could be separated from the MMR defect. We isolated three intragenic suppressors of dnaN5 that restored growth at the nonpermissive temperature while maintaining an increase in mutation frequency. All three dnaN alleles encoded the G73R substitution along with one of three novel missense mutations. The missense mutations isolated were S22P, S181G, and E346K. Of these, S181G and E346K are located near the hydrophobic cleft of the beta clamp, a common site occupied by proteins that bind the beta clamp. Using several methods, we show that the increase in mutation frequency resulting from each dnaN allele is linked to a defect in MMR. Moreover, we found that S181G and E346K allowed growth at elevated temperatures and did not have an appreciable effect on mutation frequency when separated from G73R. Thus, we found that specific residue changes in the B. subtilis beta clamp separate the role of the beta clamp in DNA replication from its role in MMR.

Mutations in the Bacillus subtilis beta clamp that separate its roles in DNA replication from mismatch repair.

La pince b&#xEA;ta est une pince de r&#xE9;plication essentielle coulissant n&#xE9;cessaire &#xE0; la synth&#xE8;se d&#x26;#39;ADN processive. La pince beta est &#xE9;galement critique pour plusieurs autres aspects de m&#xE9;tabolisme de l&#x26;#39;ADN, y compris de r&#xE9;paration des m&#xE9;sappariements d&#x26;#39;ADN (MMR). L&#x26;#39;all&#xE8;le dnaN5 de Bacillus subtilis code pour une forme mutante de la pince b&#xEA;ta contenant la substitution G73R. Cellules avec l&#x26;#39;all&#xE8;le dnaN5 sont sensibles &#xE0; la temp&#xE9;rature de la croissance due &#xE0; un d&#xE9;faut de r&#xE9;plication de l&#x26;#39;ADN &#xE0; 49 degr&#xE9;s C, et ils montrent une augmentation de la fr&#xE9;quence de mutation caus&#xE9; par un d&#xE9;faut partiel de ROR &#xE0; des temp&#xE9;ratures permissives. Nous avons s&#xE9;lectionn&#xE9; pour des suppresseurs intrag&#xE9;niques de dnaN5 qui a sauv&#xE9; la viabilit&#xE9; &#xE0; 49 degr&#xE9;s C afin de d&#xE9;terminer si le d&#xE9;faut r&#xE9;plication de l&#x26;#39;ADN peuvent &#xEA;tre s&#xE9;par&#xE9;s du d&#xE9;faut MMR. Nous avons isol&#xE9; trois suppresseurs intrag&#xE9;niques de dnaN5 qui ont r&#xE9;tabli la croissance &#xE0; la temp&#xE9;rature non permissive, tout en maintenant une augmentation de la fr&#xE9;quence de mutation. Tous les trois all&#xE8;les DNAN cod&#xE9; la substitution G73R avec l&#x26;#39;une des trois mutations faux-sens nouveaux. Les mutations faux-sens ont &#xE9;t&#xE9; isol&#xE9;s S22P, S181G, et E346K. De ceux-ci, S181G et E346K sont situ&#xE9;s &#xE0; proximit&#xE9; de la fente hydrophobe de la pince b&#xEA;ta, un site occup&#xE9; par commune prot&#xE9;ines qui se lient la pince b&#xEA;ta. Utilisation de plusieurs m&#xE9;thodes, nous montrons que l&#x26;#39;augmentation de la fr&#xE9;quence de mutation r&#xE9;sultant de chaque all&#xE8;le DNAN est li&#xE9;e &#xE0; un d&#xE9;faut de ROR. En outre, nous avons constat&#xE9; que S181G et E346K permis une croissance &#xE0; des temp&#xE9;ratures &#xE9;lev&#xE9;es et n&#x26;#39;ont pas eu un effet appr&#xE9;ciable sur la fr&#xE9;quence de mutation lorsqu&#x26;#39;il est s&#xE9;par&#xE9; de G73R. Ainsi, nous avons trouv&#xE9; que les changements de r&#xE9;sidus sp&#xE9;cifiques dans la version b&#xEA;ta de B. subtilis pince s&#xE9;parer le r&#xF4;le de la pince b&#xEA;ta r&#xE9;plication de l&#x26;#39;ADN de son r&#xF4;le dans le ROR.

Des mutations dans la pince Beta Bacillus subtilis qui s&#xE9;parent ses r&#xF4;les dans la r&#xE9;plication d&#x26;#39;ADN &#xE0; partir de Mismatch Repair

Die Beta-Klemme ist eine wesentliche Replikation Gleitklemme f&uuml;r prozessualen DNA-Synthese ben&ouml;tigt. Die Beta-Klemme ist auch wichtig f&uuml;r einige zus&auml;tzliche Aspekte der DNA-Stoffwechsel, einschlie&szlig;lich DNA-Mismatch-Reparatur (MMR). Die dnaN5-Allel von Bacillus Subtilis codiert eine mutierte Form des Beta-Schelle, enth&auml;lt die G73R-Substitution. Zellen mit der dnaN5-Allel sind temperaturempfindlich f&uuml;r Wachstum durch einen Defekt in der DNA-Replikation bei 49 Grad C, und sie zeigen eine Erh&ouml;hung in Mutation Frequenz durch einen teilweise defekt in MMR bei permissive Temperaturen verursacht. Wir ausgew&auml;hlt f&uuml;r intragenic D&auml;mpfer der dnaN5, die Lebensf&auml;higkeit bei 49 Grad C zu bestimmen, ob der DNA-Replikation Fehler getrennt werden k&ouml;nnte gerettet aus der MMR-defekt. Wir isoliert drei intragenic D&auml;mpfer der dnaN5, das Wachstum der nonpermissive Temperatur und gleichzeitig eine Erh&ouml;hung der Mutation Frequenz wiederhergestellt. Alle drei DnaN Allele codiert die G73R Substitution zusammen mit einem der drei neuartige Missense-Mutationen. Die Missense-Mutationen, die isoliert wurden, S22P, S181G und E346K. Von diesen befinden sich S181G und E346K in der N&auml;he der hydrophoben Hasenscharte der Beta-Klammer, einem gemeinsamen Standort von Proteinen, die die Beta-Klammer binden besetzt. Mit verschiedenen Methoden, zeigen wir, dass der Anstieg der Mutation Frequenz jedes Allel DnaN infolge eines Mangels in MMR verkn&uuml;pft ist. Dar&uuml;ber hinaus fanden wir, dass S181G und E346K Wachstum bei erh&ouml;hten Temperaturen erlaubt und haben keine sp&uuml;rbare Auswirkung auf Mutation Frequenz von G73R getrennt. So fanden wir, dass bestimmte R&uuml;ckst&auml;nde &Auml;nderungen in der B. Subtilis-Beta-Klemme die Rolle der Beta-Klammer in der DNA-Replikation von ihrer Rolle in MMR trennen.

Mutationen in der Bacillus Subtilis Beta Klemme, die seine Rolle in der DNA-Replikation von Konflikt trennen reparieren.

La pinza beta &egrave; un&#39;essenziale replica morsetto di bloccaggio necessaria per la sintesi del DNA processive. Il morsetto beta &egrave; anche fondamentale per diversi aspetti aggiuntivi del metabolismo del DNA, compreso DNA mismatch repair (MMR). L&#39;allele dnaN5 di Bacillus subtilis codifica una forma mutante della pinza beta contenente la sostituzione G73R. Le cellule con l&#39;allele dnaN5 sono termosensibili per la crescita a causa di un difetto nella replicazione del DNA a 49 gradi C, e mostrano un aumento nella frequenza di mutazione causata da un difetto parziale di MMR a temperature permissive. Abbiamo selezionato per intragenic soppressori di dnaN5 che salv&ograve; vitalit&agrave; a 49 gradi C per determinare se il difetto di replica del DNA potrebbe essere separato dal difetto MMR. Abbiamo isolato tre intragenic soppressori di dnaN5 che ha restaurato la crescita alla temperatura di nonpermissive pur mantenendo un aumento nella frequenza di mutazione. Tutti i tre alleli dnaN codificato la sostituzione G73R insieme a uno dei tre mutazioni missenso romanzo. Le mutazioni missenso isolate sono stati S22P, S181G ed E346K. Di questi, S181G ed E346K si trovano vicino la schisi idrofoba del morsetto beta, un comune sito occupato da proteine che legano il morsetto di beta. Utilizzando diversi metodi, ci mostra che l&#39;aumento della frequenza di mutazione derivanti da ciascun allele dnaN &egrave; legata a un difetto nel MMR. Inoltre, abbiamo trovato che S181G ed E346K ha permesso la crescita a temperature elevate e non hanno un effetto rilevante sulla frequenza di mutazione quando separati da G73R. Cos&igrave;, abbiamo scoperto che i cambiamenti specifici residui nel morsetto b. subtilis beta separano il ruolo del morsetto beta nella replicazione del DNA dal suo ruolo nel MMR.

Mutazioni nel morsetto Bacillus subtilis beta che separano i suoi ruoli nella replicazione del DNA da mismatch repair.

&#x3B2;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x306F;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30C3;&#x30B7;&#x30D6;&#x306E;DNA&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x5FC5;&#x8981;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6B20;&#x306A;&#x8907;&#x88FD;&#x30B9;&#x30E9;&#x30A4;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x3067;&#x3059;&#x3002; &#x3B2;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x306F;&#x3001;DNA&#x30DF;&#x30B9;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C1;&#x4FEE;&#x5FA9;&#xFF08;MMR&#xFF09;&#x3092;&#x542B;&#x3080;DNA&#x4EE3;&#x8B1D;&#x306E;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x8FFD;&#x52A0;&#x306E;&#x5074;&#x9762;&#x304C;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x67AF;&#x8349;&#x83CC;&#x306E;dnaN5&#x5BFE;&#x7ACB;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306F;G73R&#x7F6E;&#x63DB;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3B2;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x578B;&#x3092;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; dnaN5&#x5BFE;&#x7ACB;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x7D30;&#x80DE;&#x306F;49&#x2103;&#x3067;&#x306E;DNA&#x8907;&#x88FD;&#x306E;&#x6B20;&#x9665;&#x306B;&#x8D77;&#x56E0;&#x3059;&#x308B;&#x6210;&#x9577;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6E29;&#x5EA6;&#x611F;&#x53D7;&#x6027;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306F;&#x8A31;&#x5BB9;&#x6E29;&#x5EA6;&#x3067;MMR&#x306E;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x306A;&#x6B20;&#x9665;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x983B;&#x5EA6;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;DNA&#x8907;&#x88FD;&#x6B20;&#x9665;&#x304C;MMR&#x306E;&#x6B20;&#x9665;&#x304B;&#x3089;&#x5206;&#x96E2;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x305F;&#x304B;&#x3069;&#x3046;&#x304B;&#x3092;&#x5224;&#x65AD;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;49&#x5EA6;C&#x3067;&#x751F;&#x5B58;&#x7387;&#x3092;&#x6551;&#x51FA;dnaN5&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5185;&#x6291;&#x5236;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x9078;&#x629E;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x983B;&#x5EA6;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x3092;&#x7DAD;&#x6301;&#x3057;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x3001;&#x975E;&#x8A31;&#x5BB9;&#x6E29;&#x5EA6;&#x3067;&#x306E;&#x6210;&#x9577;&#x3092;&#x5FA9;&#x5143;&#x3057;&#x305F;&#x3053;&#x3068;dnaN5&#x306E;3&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5185;&#x30B5;&#x30D7;&#x30EC;&#x30C3;&#x30B5;&#x30FC;&#x3092;&#x5358;&#x96E2;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;3&#x3064;&#x306E;dnaN&#x5BFE;&#x7ACB;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306F;3&#x3064;&#x306E;&#x65B0;&#x898F;&#x306E;&#x30DF;&#x30B9;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B9;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x3044;&#x305A;&#x308C;&#x304B;&#x306B;&#x6CBF;&#x3063;&#x3066;G73R&#x7F6E;&#x63DB;&#x3092;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x9694;&#x96E2;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30DF;&#x30B9;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B9;&#x5909;&#x7570;&#x306F;&#x3001;S22P&#x3001;S181G&#x3001;&#x3068;E346K&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x3046;&#x3061;&#x3001;S181G&#x3068;E346K&#x306F;&#x3001;&#x3B2;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x88C2;&#x3001;&#x758E;&#x6C34;&#x6027;&#x3001;&#x3B2;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5360;&#x6709;&#x3055;&#x308C;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306A;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306E;&#x8FD1;&#x304F;&#x306B;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x5404;dnaN&#x5BFE;&#x7ACB;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306B;&#x8D77;&#x56E0;&#x3059;&#x308B;&#x5909;&#x7570;&#x983B;&#x5EA6;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x306F;MMR&#x306E;&#x6B20;&#x9665;&#x306B;&#x30EA;&#x30F3;&#x30AF;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;S181G&#x3068;E346K&#x306F;&#x3001;&#x9AD8;&#x6E29;&#x3067;&#x306E;&#x6210;&#x9577;&#x3092;&#x8A31;&#x3055;G73R&#x304B;&#x3089;&#x5206;&#x96E2;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3068;&#x304D;&#x306B;&#x5909;&#x7570;&#x983B;&#x5EA6;&#x306B;&#x304B;&#x306A;&#x308A;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x308F;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x305D;&#x3053;&#x3067;&#x3001;MMR&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x305D;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x304B;&#x3089;&#x3001;DNA&#x8907;&#x88FD;&#x306E;&#x3B2;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x5206;&#x96E2;&#x3059;&#x308B;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x67AF;&#x8349;&#x83CC;&#x306E;&#x3B2;&#x5185;&#x306E;&#x305D;&#x306E;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x3092;&#x767A;&#x898B;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x30DF;&#x30B9;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C1;&#x4FEE;&#x5FA9;&#x304B;&#x3089;&#x306E;DNA&#x8907;&#x88FD;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x5206;&#x96E2;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x67AF;&#x8349;&#x83CC;&#x30D9;&#x30FC;&#x30BF;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x306E;&#x5909;&#x7570;

&#xBCA0;&#xD0C0; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504; processive DNA &#xD569;&#xC131;&#xC5D0; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; &#xC2AC;&#xB77C;&#xC774;&#xB529; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xBCF5;&#xC81C;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBCA0;&#xD0C0; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504; DNA &#xB300;&#xC0AC;, DNA &#xBD88;&#xC77C;&#xCE58; &#xBCF5;&#xAD6C; (MMR) &#xB4F1;&#xC758; &#xBA87; &#xAC00;&#xC9C0; &#xCD94;&#xAC00;&#xC801;&#xC778; &#xCE21;&#xBA74;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC774;&#xAE30;&#xB3C4; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC0C8; &#xADE0;&#xC758; subtilis dnaN5 &#xB300;&#xB9BD; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xD615;&#xD0DC;&#xC758; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504; G73R &#xB300;&#xCCB4; &#xD3EC;&#xD568; &#xC778;&#xCF54;&#xB529;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. DnaN5 &#xB300;&#xB9BD; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB97C; &#xAC00;&#xC9C4; &#xC138;&#xD3EC;&#xB294; &#xC628;&#xB3C4; 49&#xB3C4; C&#xC5D0;&#xC11C; DNA &#xBCF5;&#xC81C;&#xC5D0; &#xACB0;&#xD568; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xC131;&#xC7A5;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC740; &#xD5C8;&#xC6A9; &#xC628;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; MMR&#xC758; &#xBD80;&#xBD84;&#xC801;&#xC778; &#xACB0;&#xD568;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xB294; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBE48;&#xB3C4; &#xC99D;&#xAC00; &#xBCF4;&#xC5EC;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; DNA &#xBCF5;&#xC81C; &#xACB0;&#xD568; &#xBD84;&#xB9AC; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xACBD;&#xC6B0; &#xD655;&#xC778; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; 49&#xB3C4; C&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0DD;&#xC874; &#xB2A5;&#xB825;&#xC744; &#xAD6C;&#xCD9C; &#xD558;&#xB294; Dnan5&#xC758; intragenic &#xC9C4;&#xC555;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC120;&#xD0DD;&#xC5D0;&#xC11C; MMR &#xACB0;&#xD568;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xACE0;&#xB9BD; &#xBCF5;&#xC6D0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBE48;&#xB3C4;&#xC758; &#xC99D;&#xAC00; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558;&#xBA74;&#xC11C; nonpermissive &#xC628;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC131;&#xC7A5; &#xD558;&#xB294; Dnan5&#xC758; &#xC138; intragenic &#xC9C4;&#xC555;. &#xBAA8;&#xB4E0; 3 &#xAC1C;&#xC758; dnaN &#xB300;&#xB9BD; &#xD558;&#xB098; &#xC138; &#xC18C;&#xC124; missense &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xD568;&#xAED8; G73R &#xB300;&#xCCB4;&#xAC00; &#xC778;&#xCF54;&#xB529;&#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xACE0;&#xB9BD; &#xB41C; missense &#xBCC0;&#xC774; &#xD588;&#xB2E4; S22P, S181G, &#xBC0F; E346K. &#xC774;&#xB4E4; &#xC911;, S181G &#xBC0F; e346k&#xB294; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504;, &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC778; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC810;&#xB839;&#xC758; &#xC18C;&#xC218; &#xC131; &#xBD84;&#xC5F4; &#xADFC;&#xCC98;&#xC5D0; &#xC704;&#xCE58;. &#xC5EC;&#xB7EC; &#xAC00;&#xC9C0; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xAC01; dnaN &#xB300;&#xB9BD; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xB294; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBE48;&#xB3C4;&#xAC00; &#xC99D;&#xAC00; MMR&#xC758; &#xACB0;&#xD568;&#xC5D0; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB41C; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; S181G &#xBC0F; E346K &#xB192;&#xC740; &#xC628;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC131;&#xC7A5;&#xC744; &#xD5C8;&#xC6A9; &#xBC0F; g73r&#xC5D0;&#xC11C; &#xBD84;&#xB9AC; &#xB420; &#xB54C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC8FC;&#xD30C;&#xC218;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xAC10;&#xC9C0;&#xD560; &#xC218; &#xC5C6;&#xB294; &#xBC1C;&#xACAC;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, &#xD2B9;&#xC815; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; &#xBCC0;&#xD654; B. subtilis &#xBCA0;&#xD0C0; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504;&#xC5D0; MMR&#xC758; &#xC5ED;&#xD560;&#xC5D0;&#xC11C; DNA &#xBCF5;&#xC81C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504;&#xC758; &#xC5ED;&#xD560; &#xBD84;&#xB9AC;&#xB97C; &#xCC3E;&#xC558;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xBD88;&#xC77C;&#xCE58;&#xC5D0;&#xC11C; DNA &#xBCF5;&#xC81C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xADF8;&#xAC83;&#xC758; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xAD6C;&#xBD84; &#xD558;&#xB294; &#xC0C8; &#xADE0;&#xC758; subtilis &#xBCA0;&#xD0C0; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504;&#xC5D0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBCF5;&#xAD6C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

La pinza beta es una abrazadera de replicaci&#xF3;n esencial deslizante requerido para la s&#xED;ntesis de ADN procesiva. La pinza beta es tambi&#xE9;n un factor cr&#xED;tico para varios otros aspectos del metabolismo del ADN, incluyendo la reparaci&#xF3;n del ADN mismatch (MMR). El alelo dnaN5 de Bacillus subtilis codifica una forma mutante de la pinza beta que contiene la sustituci&#xF3;n G73R. Las c&#xE9;lulas con el alelo dnaN5 son sensibles a la temperatura para el crecimiento debido a un defecto en la replicaci&#xF3;n del ADN en 49 grados C, y muestran un aumento en la frecuencia de mutaci&#xF3;n causada por un defecto parcial en MMR a temperaturas permisivas. Se han seleccionado de los supresores de intragenic dnaN5 que rescataron viabilidad a 49 grados C para determinar si el defecto de replicaci&#xF3;n del ADN podr&#xED;a ser separado del defecto MMR. Se aislaron tres supresores intrag&#xE9;nicos de dnaN5 que restauraron el crecimiento a la temperatura no permisiva manteniendo al mismo tiempo un aumento en la frecuencia de mutaci&#xF3;n. Los tres alelos DNAn codificada la sustituci&#xF3;n G73R, junto con una de las tres nuevas mutaciones missense. Las mutaciones sin sentido aislados fueron S22P, S181G, y E346K. De &#xE9;stos, S181G y E346K est&#xE1;n situados cerca de la hendidura hidr&#xF3;foba de la pinza beta, un sitio com&#xFA;n ocupado por prote&#xED;nas que se unen la pinza beta. Usando varios m&#xE9;todos, nos muestran que el incremento en la frecuencia de mutaci&#xF3;n que resulta de cada alelo DNAn est&#xE1; vinculada a un defecto en MMR. Por otra parte, encontramos que S181G E346K y permiti&#xF3; el crecimiento a temperaturas elevadas y no tienen un efecto apreciable en la frecuencia de mutaci&#xF3;n cuando se separa de G73R. Por lo tanto, hemos encontrado que los cambios de residuos espec&#xED;ficos en la beta de B. subtilis abrazadera separar el papel de la pinza beta en la replicaci&#xF3;n del ADN de su papel en MMR.

Las mutaciones en la pinza de Bacillus subtilis que Beta separar sus funciones en la replicaci&#xF3;n del ADN de reparaci&#xF3;n de genes

&#x9519;&#x914D;&#x4FEE;&#x590D; (MMR) &#x7EA0;&#x6B63; DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x590D;&#x5236;&#x671F;&#x95F4;&#x53D1;&#x751F;&#x7684;&#x9519;&#x8BEF;&#x3002;MMR &#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x7EF4;&#x62A4;&#x81F3;&#x5173;&#x91CD;&#x8981;&#xFF0C;&#x5176;&#x635F;&#x5931;&#x589E;&#x52A0;&#x7A81;&#x53D8;&#x7387;&#x51E0;&#x4E2A;&#x51E0;&#x767E;&#x500D;&#x3002;&#x6700;&#x8FD1;&#x7684;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x8868;&#x660E;&#x4E0D;&#x5339;&#x914D;&#x8BC6;&#x522B;&#x86CB;&#x767D; MutS &#x548C;&#x590D;&#x5236; processivity &#x5939;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x662F;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x5B55;&#x4EA7;&#x5987;&#x6B7B;&#x4EA1;&#x7387;&#x5728;&#x67AF;&#x8349;&#x82BD;&#x5B62;&#x6746;&#x83CC;&#x3002;&#x4E3A;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x4E86;&#x89E3;&#x5982;&#x4F55;&#x5C06; MMR &#x8026;&#x5408;&#x5230; DNA &#x590D;&#x5236;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5BA1;&#x67E5;&#x4E86;&#x878D;&#x5408;&#x5728;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D; (GFP) &#x7684;&#x5B55;&#x4EA7;&#x5987;&#x6B7B;&#x4EA1;&#x7387;&#x548C; DNA &#x590D;&#x5236;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x4E9A;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5B9A;&#x4F4D;&#x540E;&#x589E;&#x52A0; DNA &#x590D;&#x5236;&#x9519;&#x8BEF;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BC1;&#x660E;&#x57FA;&#x672C; DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176; DnaE GFP &#x7076;&#x51CF;&#x5C11;&#x4E4B;&#x540E;&#x4E0D;&#x5339;&#x914D;&#x5C06;&#x7EB3;&#x5165;&#x548C;&#x635F;&#x5931; DnaE GFP &#x7076;&#x9700;&#x8981; MutS&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x663E;&#x793A; MutS &#x548C;&#x9521;&#x8BD5;&#x9A8C;&#x7ED1;&#x5B9A; DnaE &#x4F53;&#x5916;&#xFF0C;&#x6697;&#x793A; DnaE &#x518D;&#x52A0;&#x4E0A;&#x4FEE;&#x590D;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4E5F;&#x53D1;&#x73B0;&#x8FD9; DnaE GFP &#x7076;&#x51CF;&#x5C11;&#x4F53;&#x5185;&#x663E;&#x793A; DnaE GFP &#x75AB;&#x6E90;&#x5730;&#x7684;&#x635F;&#x5931;&#x9020;&#x6210;&#x7684;&#x6270;&#x52A8;&#x5230; DNA &#x590D;&#x5236;&#x7684; DNA &#x5408;&#x6210; DNA &#x635F;&#x4F24;&#x72EC;&#x7ACB;&#x62D8;&#x6355;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5EFA;&#x8BAE; MutS &#x76F4;&#x63A5;&#x63A5;&#x89E6;&#x7684; DNA &#x590D;&#x5236;&#x673A;&#x5236;&#xFF0C;&#x5BFC;&#x81F4; DnaE MMR &#x671F;&#x95F4;&#x5728;&#x590D;&#x5236;&#x53C9;&#x7684;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x4E2D;&#x7684;&#x52A8;&#x6001;&#x53D8;&#x5316;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7ED3;&#x679C;&#x5EFA;&#x7ACB;&#x5F15;&#x4EBA;&#x6CE8;&#x76EE;&#x548C;&#x4EB2;&#x5BC6; MMR &#x4E0E;&#x4F53;&#x5185;&#x590D;&#x5236;&#x7684; DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x590D;&#x5408;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x8FDE;&#x63A5;&#x3002;

&#x9519;&#x914D;&#x4FEE;&#x590D;&#x539F;&#x56E0;&#x57FA;&#x672C; DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x590D;&#x5236;&#x53C9;&#x4ECE;&#x52A8;&#x6001;&#x91CA;&#x653E;&#x3002;

Mismatch repair (MMR) corrects DNA polymerase errors occurring during genome replication. MMR is critical for genome maintenance, and its loss increases mutation rates several hundred fold. Recent work has shown that the interaction between the mismatch recognition protein MutS and the replication processivity clamp is important for MMR in Bacillus subtilis. To further understand how MMR is coupled to DNA replication, we examined the subcellular localization of MMR and DNA replication proteins fused to green fluorescent protein (GFP) in live cells, following an increase in DNA replication errors. We demonstrate that foci of the essential DNA polymerase DnaE-GFP decrease following mismatch incorporation and that loss of DnaE-GFP foci requires MutS. Furthermore, we show that MutS and MutL bind DnaE in vitro, suggesting that DnaE is coupled to repair. We also found that DnaE-GFP foci decrease in vivo following a DNA damage-independent arrest of DNA synthesis showing that loss of DnaE-GFP foci is caused by perturbations to DNA replication. We propose that MutS directly contacts the DNA replication machinery, causing a dynamic change in the organization of DnaE at the replication fork during MMR. Our results establish a striking and intimate connection between MMR and the replicating DNA polymerase complex in vivo.

Mismatch repair causes the dynamic release of an essential DNA polymerase from the replication fork.

De r&#xE9;paration des m&#xE9;sappariements (MMR) corrige les erreurs de l&#x26;#39;ADN polym&#xE9;rase qui se produisent pendant la r&#xE9;plication du g&#xE9;nome. MMR est essentiel pour l&#x26;#39;entretien du g&#xE9;nome, et sa perte augmente les taux de mutation plusieurs centaines de fois. Des travaux r&#xE9;cents ont montr&#xE9; que l&#x26;#39;interaction entre MutS inad&#xE9;quation des prot&#xE9;ines de reconnaissance et la pince de processivit&#xE9; de r&#xE9;plication est important pour le ROR chez Bacillus subtilis. Pour mieux comprendre comment le ROR est coupl&#xE9; &#xE0; la r&#xE9;plication d&#x26;#39;ADN, nous avons examin&#xE9; la localisation subcellulaire des prot&#xE9;ines de r&#xE9;plication MMR et l&#x26;#39;ADN fusionn&#xE9; la prot&#xE9;ine fluorescente verte (GFP) dans des cellules vivantes, suite &#xE0; une augmentation des erreurs de r&#xE9;plication d&#x26;#39;ADN. Nous d&#xE9;montrons que les foyers de l&#x26;#39;ADN polym&#xE9;rase incorporation essentielle DnaE-GFP diminution inad&#xE9;quation &#xE0; la suite et que la perte de DnaE-GFP foyers exige MutS. En outre, nous montrons que MutS et MutL bind DnaE in vitro, ce qui sugg&#xE8;re que DnaE est coupl&#xE9; &#xE0; r&#xE9;parer. Nous avons &#xE9;galement constat&#xE9; que DnaE-GFP diminution des foyers in vivo suite &#xE0; une dommages de l&#x26;#39;ADN-ind&#xE9;pendante arr&#xEA;t de la synth&#xE8;se d&#x26;#39;ADN montrant que la perte de DnaE-GFP foyers est caus&#xE9;e par des perturbations &#xE0; r&#xE9;plication de l&#x26;#39;ADN. Nous proposons que MutS directement en contact avec de la machinerie r&#xE9;plication de l&#x26;#39;ADN, provoquant un changement dynamique dans l&#x26;#39;organisation de DnaE &#xE0; la fourche de r&#xE9;plication au cours ROR. Nos r&#xE9;sultats &#xE9;tablissent un lien frappant et intime entre le ROR et le complexe r&#xE9;plication de l&#x26;#39;ADN polym&#xE9;rase in vivo.

Mismatch Repair provoque la lib&#xE9;ration dynamique d&#x26;#39;une ADN polym&#xE9;rase essentielle de la fourche de r&#xE9;plication

Fehlanpassung Reparatur (MMR) korrigiert St&ouml;rungen der DNA-Polymerase, die w&auml;hrend der Morphologie. MMR ist kritisch f&uuml;r Genom-Wartung, und seinen Verlust steigert die Mutation Raten mehrere hundert Falten. Die j&uuml;ngsten Arbeiten hat gezeigt, dass die Interaktion zwischen das Missverh&auml;ltnis Anerkennung Protein MutS und der Replikation Processivity Klemme wichtig f&uuml;r MMR in Bacillus Subtilis. Um noch besser zu verstehen, wie MMR DNA Reproduktion gekoppelt ist, haben wir die subzellulare Lokalisation der MMR und DNA Replikation-Proteine, die verschmolzen zu gr&uuml;n fluoreszierendes Protein (GFP) in lebenden Zellen, nach eine Zunahme der St&ouml;rungen der DNA-Replikation. Wir zeigen, dass die Brennpunkte der wesentliche DNA-Polymerase DnaE-GFP nach Missverh&auml;ltnis Aufnahme verringern und Verlust von DnaE-GFP-Foki MutS erfordert. Dar&uuml;ber hinaus zeigen wir, dass MutS und MutL DnaE in vitro darauf hindeutet binden, dass DnaE gekoppelt ist, um zu reparieren. Wir fanden auch, dass DnaE-GFP-Herde-Abnahme in-vivo nach einer DNA Sch&auml;den-unabh&auml;ngige Festnahme der DNA-Synthese, die zeigen, dass Verlust der DnaE-GFP-Foki Perturbationen DNA Replikation zur&uuml;ckzuf&uuml;hren ist. Wir schlagen MutS den DNA-Replikation-Maschinen, direkt Kontakte verursacht eine dynamische Ver&auml;nderung in der Organisation der DnaE an der Wiederholunggabel w&auml;hrend der MMR. Unsere Ergebnisse legen eine markante und intime Verbindung zwischen MMR und der replizierende DNA Polymerase-Komplex, der in-vivo.

Unpassender Reparatur Ursachen der dynamischen Ver&ouml;ffentlichung eine wesentliche DNA-Polymerase von der Wiederholunggabel.

Mismatch repair (MMR) corregge gli errori della polimerasi del DNA che si verificano durante la replicazione del genoma. MMR &egrave; fondamentale per il mantenimento del genoma, e la perdita aumenta i tassi di mutazione piega parecchie centinaia. Lavoro recente ha dimostrato che l&#39;interazione tra la proteina di riconoscimento mismatch MutS e il replica processivity morsetto &egrave; importante per MMR in Bacillus subtilis. Per capire ulteriormente come MMR &egrave; accoppiata alla replicazione del DNA, abbiamo esaminato la localizzazione subcellulare delle proteine replica MMR e DNA fuso a proteina fluorescente verde (GFP) in cellule vive, seguito di un aumento di errori di replicazione del DNA. Dimostriamo che fuochi della polimerasi del DNA essenziale DnaE-GFP diminuiscono a seguito di mancata corrispondenza incorporazione e che la perdita di foci DnaE-GFP richiede MutS. Inoltre, mostriamo che MutS e MutL legano DnaE in vitro, suggerendo che DnaE &egrave; accoppiato per riparare. Abbiamo anche trovato che diminuzione di foci DnaE-GFP in vivo dopo un arresto indipendente dal danno del DNA della sintesi del DNA che mostrano che la perdita di foci DnaE-GFP &egrave; causata da perturbazioni di replicazione del DNA. Proponiamo che i MutS contatti direttamente il macchinario di replicazione del DNA, causando un cambiamento dinamico nell&#39;organizzazione del DnaE presso la forcella di replicazione durante MMR. I nostri risultati stabilire un suggestivo e intima connessione tra MMR e il complesso di replicazione del DNA polimerasi in vivo.

Mancata corrispondenza di riparazione cause il rilascio dinamico di una polimerasi del DNA essenziale dalla forcella replica.

&#x30DF;&#x30B9;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C1;&#x4FEE;&#x5FA9;&#xFF08;MMR&#xFF09;&#x306F;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306E;&#x8907;&#x88FD;&#x4E2D;&#x306B;&#x767A;&#x751F;&#x3059;&#x308B;DNA&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x30A8;&#x30E9;&#x30FC;&#x3092;&#x4FEE;&#x6B63;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; MMR&#x306F;&#x3001;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x7DAD;&#x6301;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x640D;&#x5931;&#x306F;&#x3001;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x7387;&#x3092;&#x6570;&#x767E;&#x500D;&#x306B;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x8FD1;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x3001;&#x30DF;&#x30B9;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C1;&#x8A8D;&#x8B58;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;MutS&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x304C;&#x3001;&#x67AF;&#x8349;&#x83CC;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;MMR&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;MMR&#x306F;&#x3001;DNA&#x8907;&#x88FD;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x7406;&#x89E3;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;DNA&#x8907;&#x88FD;&#x30A8;&#x30E9;&#x30FC;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x306B;&#x7D9A;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x751F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x7DD1;&#x8272;&#x86CD;&#x5149;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08;GFP&#xFF09;&#x306B;&#x878D;&#x5408;&#x3057;&#x305F;MMR&#x3068;DNA&#x8907;&#x88FD;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x5C40;&#x5728;&#x3092;&#x8ABF;&#x3079;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x672C;&#x8CEA;&#x7684;&#x306A;DNA&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;DnaE-GFP&#x306E;&#x6E1B;&#x5C11;&#x5F8C;&#x306B;&#x4E0D;&#x4E00;&#x81F4;&#x306E;&#x53D6;&#x308A;&#x8FBC;&#x307F;&#x3068;DnaE-GFP&#x75C5;&#x5DE3;&#x306E;&#x305D;&#x306E;&#x640D;&#x5931;&#x306E;&#x7126;&#x70B9;&#x306F;&#x306E;MutS&#x304C;&#x5FC5;&#x8981;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306E;MutS&#x304A;&#x3088;&#x3073;in vitro&#x3067;&#x306E;MutL&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;DnaE&#x306F;&#x3001;DnaE&#x3092;&#x4FEE;&#x5FA9;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x307E;&#x305F;&#x3001;in vivo&#x3067;&#x306E;DnaE-GFP&#x75C5;&#x5DE3;&#x306E;&#x6E1B;&#x5C11;&#x304C;DnaE-GFP&#x75C5;&#x5DE3;&#x306E;&#x640D;&#x5931;&#x3092;&#x793A;&#x3059;DNA&#x5408;&#x6210;&#x306E;DNA&#x640D;&#x50B7;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x306A;&#x3044;&#x505C;&#x6B62;&#x304C;DNA&#x8907;&#x88FD;&#x306B;&#x6442;&#x52D5;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3001;&#x4EE5;&#x4E0B;&#x306E;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x308F;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x306F;&#x3001;MMR&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x8907;&#x88FD;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30AF;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;DnaE&#x306E;&#x7D44;&#x7E54;&#x5185;&#x306E;&#x52D5;&#x7684;&#x306A;&#x5909;&#x5316;&#x3092;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3057;&#x3001;DNA&#x306E;&#x8907;&#x88FD;&#x6A5F;&#x69CB;&#x306E;MutS&#x305D;&#x306E;&#x76F4;&#x63A5;&#x30B3;&#x30F3;&#x30BF;&#x30AF;&#x30C8;&#x3092;&#x63D0;&#x6848;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;MMR&#x304A;&#x3088;&#x3073;in vivo&#x3067;&#x306E;&#x8907;&#x88FD;DNA&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x5370;&#x8C61;&#x7684;&#x3067;&#x89AA;&#x5BC6;&#x306A;&#x63A5;&#x7D9A;&#x3092;&#x78BA;&#x7ACB;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30DF;&#x30B9;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C1;&#x4FEE;&#x5FA9;&#x8907;&#x88FD;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30AF;&#x304B;&#x3089;&#x5FC5;&#x8981;&#x306A;DNA&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x52D5;&#x7684;&#x653E;&#x51FA;&#x3092;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3059;

&#xBD88;&#xC77C;&#xCE58; &#xC218;&#xB9AC; (MMR) &#xAC8C;&#xB188; &#xBCF5;&#xC81C; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xB294; DNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC624;&#xB958;&#xB97C; &#xC218;&#xC815; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. MMR&#xC740; &#xAC8C;&#xB188; &#xC720;&#xC9C0; &#xAD00;&#xB9AC;&#xB97C; &#xC704;&#xD574; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xBC0F; &#xC190;&#xC2E4;&#xC744; &#xC99D;&#xAC00; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC694;&#xAE08; &#xBA87; &#xBC31; &#xBC30;. &#xCD5C;&#xADFC; &#xC791;&#xD488; &#xBD88;&#xC77C;&#xCE58; &#xC778;&#xC2DD; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; MutS &#xBCF5;&#xC81C; processivity &#xD074;&#xB7A8;&#xD504;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638;&#xC791;&#xC6A9;&#xC740; &#xC0C8; &#xADE0;&#xC758; subtilis&#xC5D0; MMR&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0AC;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. MMR&#xC758; DNA &#xBCF5;&#xC81C;&#xC758; &#xACB0;&#xD569; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xB354; &#xC774;&#xD574; &#xD558;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; DNA &#xBCF5;&#xC81C; &#xC624;&#xB958; &#xC99D;&#xAC00; &#xB530;&#xB77C; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xC140;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB179;&#xC0C9; &#xD615;&#xAD11; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (GFP)&#xB97C; &#xC735;&#xD569; &#xD558;&#xB294; MMR&#xACFC; DNA &#xBCF5;&#xC81C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; subcellular &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; &#xAC80;&#xC0AC;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; DNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; DnaE GFP foci &#xBD88;&#xC77C;&#xCE58; &#xC815; &#xAD00;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xAC10;&#xC18C; DnaE GFP foci&#xC758; &#xC190;&#xC2E4; MutS &#xD544;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; MutS MutL &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD560; &#xBC0F; &#xCCB4; &#xC678;, DnaE DnaE &#xBCF5;&#xAD6C;&#xB97C; &#xACB0;&#xD569; &#xD558; &#xC5EC; &#xC81C;&#xC548; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB610;&#xD55C; &#xADF8; DnaE GFP foci &#xAC10;&#xC18C;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC8FC;&#xB294; DnaE GFP foci&#xC758; &#xC190;&#xC2E4; &#xBB3C;&#xACB0; DNA &#xBCF5;&#xC81C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xB294; DNA &#xD569;&#xC131;&#xC758; DNA &#xC190;&#xC0C1;&#xC5D0; &#xAD00;&#xACC4; &#xC5C6;&#xC774; &#xCCB4;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xACAC;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; MutS &#xC9C1;&#xC811; &#xC5F0;&#xB77D;&#xCC98; DNA &#xBCF5;&#xC81C; &#xAE30;&#xACC4; MMR &#xB3D9;&#xC548; &#xBCF5;&#xC81C; &#xD3EC;&#xD06C;&#xC5D0; Dnae&#xC758; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB3D9;&#xC801; &#xBCC0;&#xD654;&#xB97C; &#xC77C;&#xC73C;&#xD0A4;&#xB294; &#xAC83;&#xC744; &#xC81C;&#xC548; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xB208;&#xC5D0; &#xB744;&#xB294; &#xC124;&#xC815; &#xD558;&#xBA70; &#xCE5C;&#xBC00; &#xD558; &#xAC8C; MMR&#xC640; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74; &#xBCF5;&#xC81C; DNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; &#xBCF5;&#xD569;&#xCCB4;&#xB97C; &#xC5F0;&#xACB0; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xBCF5;&#xC81C; &#xD3EC;&#xD06C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; DNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xB3D9;&#xC801; &#xC790;&#xB8CC;&#xB97C; &#xBCF5;&#xAD6C; &#xC6D0;&#xC778;&#xC5D0; &#xC77C;&#xCE58; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Reparaci&#xF3;n de apareamientos err&#xF3;neos (MMR) corrige errores en el ADN polimerasa que se producen durante la replicaci&#xF3;n del genoma. MMR es cr&#xED;tico para el mantenimiento del genoma, y &#x200B;&#x200B;su p&#xE9;rdida aumenta las tasas de mutaci&#xF3;n varios cientos de veces. Trabajos recientes han demostrado que la interacci&#xF3;n entre las prote&#xED;nas MutS desajuste reconocimiento y la abrazadera de replicaci&#xF3;n procesividad es importante para MMR en Bacillus subtilis. Para entender mejor como MMR se acopla a la replicaci&#xF3;n del ADN, se analiz&#xF3; la localizaci&#xF3;n subcelular de las prote&#xED;nas de replicaci&#xF3;n del ADN y la MMR fusionados a la prote&#xED;na verde fluorescente (GFP) en c&#xE9;lulas vivas, a ra&#xED;z de un aumento en los errores de replicaci&#xF3;n del ADN. Se demuestra que los focos de la polimerasa del ADN esencial dnaE-GFP incorporaci&#xF3;n desajuste disminuci&#xF3;n de seguir y que la p&#xE9;rdida de dnaE-GFP focos requiere MutS. Por otra parte, nos muestran que MutS y MutL unen dnaE in vitro, lo que sugiere que dnaE se acopla a la reparaci&#xF3;n. Tambi&#xE9;n se encontr&#xF3; que dnaE-GFP disminuci&#xF3;n de focos en vivo despu&#xE9;s de un da&#xF1;o en el DNA independiente de detenci&#xF3;n de la s&#xED;ntesis de ADN que muestra que la p&#xE9;rdida de dnaE-GFP focos es causada por perturbaciones en la replicaci&#xF3;n del ADN. Proponemos que MutS en contacto directo con la maquinaria de replicaci&#xF3;n del ADN, causando un cambio din&#xE1;mico en la organizaci&#xF3;n de dnaE en el tenedor de replicaci&#xF3;n durante la MMR. Nuestros resultados establecen una conexi&#xF3;n sorprendente e &#xED;ntimo entre la triple v&#xED;rica y el complejo de la polimerasa del ADN de replicaci&#xF3;n in vivo.

Article	Year
Mutations in the Bacillus subtilis beta clamp that separate its roles in DNA replication from mismatch repair. Journal of bacteriology\| PubMed ID: 20453097	2010
Mismatch repair causes the dynamic release of an essential DNA polymerase from the replication fork. Molecular microbiology\| PubMed ID: 21958350	2011

Justin S. Lenhart

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