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Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

University of Leicester

G &#x86CB;&#x767D;&#x5076;&#x8054;&#x53D7;&#x4F53;&#x7684;&#x6D3B;&#x52A8;&#x662F;&#x901A;&#x8FC7;&#x8D85;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x4E0B;&#x5217;&#x6FC0;&#x52A8;&#x5242;&#x523A;&#x6FC0;&#x53D7;&#x89C4;&#x7BA1;&#x3002;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x5728;&#x76D1;&#x7BA1;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x7684;&#x666E;&#x904D;&#x6027;&#x8D28;&#xFF0C;&#x53D7;&#x4F53;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7684;&#x751F;&#x7406;&#x5F71;&#x54CD;&#x4ECD;&#x7136;&#x5F88;&#x5DEE;&#x7814;&#x7A76;&#x3002;&#x4E3A;&#x4E86;&#x89E3;&#x51B3;&#x8FD9;&#x4E00;&#x95EE;&#x9898;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x751F;&#x6210;&#x8868;&#x793A; M (3) &#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7F3A;&#x5931;&#x682A;&#x7684;&#x6572;&#x95E8;&#x58F0;&#x4E2D;&#x9F20;&#x6807;&#x5E94;&#x53D8;-&#x6BD2;&#x8548;&#x78B1;&#x53D7;&#x4F53;&#x3001; &#x539F;&#x578B; G(q/11) &#x8026;&#x5408;&#x53D7;&#x4F53;&#x3002;&#x6B64;&#x7A81;&#x53D8;&#x5C0F;&#x9F20;&#x54C1;&#x7CFB;&#x6B64;&#x5904;&#x7528;&#x4E8E;&#x8C03;&#x67E5;&#x7684; M (3) &#x4F5C;&#x7528;-&#x6BD2;&#x8548;&#x78B1;&#x53D7;&#x4F53;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x8C03;&#x8282;&#x7684;&#x4ECE;&#x80F0;&#x5C9B;&#x5206;&#x6CCC;&#x80F0;&#x5C9B;&#x7D20;&#x3002;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x4E0D;&#x8DB3;&#x53D7;&#x4F53;&#x8026;&#x5408;&#x5230; G(q/11) &#x4FE1;&#x53F7;&#x901A;&#x8DEF;&#xFF0C;&#x4F46;&#x4ECE;&#x4F9D;&#x8D56;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7684;&#x8FDB;&#x7A0B;&#xFF0C;&#x4F8B;&#x5982;&#x53D7;&#x4F53;&#x5185;&#x90E8;&#x5316;&#x548C; &beta;-arrestin &#x62DB;&#x8058;&#x89E3;&#x8026;&#x3002;&#x6572;&#x95E8;&#x58F0;&#x5728;&#x5C0F;&#x9F20;&#x663E;&#x793A;&#x53D7;&#x635F;&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x8010;&#x91CF;&#x53CA;&#x80F0;&#x5C9B;&#x7D20;&#x5206;&#x6CCC;&#xFF0C;&#x8868;&#x660E; M (3)-&#x8868;&#x793A;&#x5BF9;&#x80F0;&#x5C9B;&#x7684;&#x6BD2;&#x8548;&#x78B1;&#x53D7;&#x4F53;&#x8C03;&#x8282;&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x7A33;&#x6001;&#x901A;&#x8FC7;&#x53D7;&#x4F53;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;-/ arrestin &#x4F9D;&#x8D56;&#x7684;&#x4FE1;&#x53F7;&#x3002;&#x673A;&#x5236;&#x5BF9;&#x6D3B;&#x5316;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x6FC0;&#x9176; D1&#xFF0C;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x8BBE;&#x6709;&#x4E0B;&#x6E38;&#x7684;&#x62DB;&#x52DF;&#x5230;&#x78F7;&#x9178;&#x5316; M (3) &beta;-arrestin-&#x6BD2;&#x8548;&#x78B1;&#x53D7;&#x4F53;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x652F;&#x6301;&#x72EC;&#x7279;&#x7684;&#x6982;&#x5FF5; (3) M-&#x6301;&#x7EED;&#x7684;&#x80F0;&#x5C9B;&#x7D20;&#x91CA;&#x653E;&#x6BD2;&#x8548;&#x78B1;&#x53D7;&#x4F53;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x589E;&#x52A0;&#x5F88;&#x5927;&#x7A0B;&#x5EA6;&#x4E0A;&#x72EC;&#x7ACB;&#x4E8E; G &#x86CB;&#x767D;&#x5076;&#x8054;&#xFF0C;&#x4F46;&#x6D89;&#x53CA;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;-/ arrestin &#x4F9D;&#x8D56;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x6FC0;&#x9176; D1 &#x53D7;&#x4F53;&#x7684;&#x8026;&#x5408;&#x3002;

M3 &#x6BD2;&#x8548;&#x78B1;&#x53D7;&#x4F53;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x80F0;&#x5C9B;&#x7D20;&#x91CA;&#x653E;&#x901A;&#x8FC7;&#x86CB;&#x767D;&#x6FC0;&#x9176; D1 &#x53D7;&#x4F53;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;/arrestin &#x4F9D;&#x8D56;&#x7684;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x3002;

The activity of G protein-coupled receptors is regulated via hyper-phosphorylation following agonist stimulation. Despite the universal nature of this regulatory process, the physiological impact of receptor phosphorylation remains poorly studied. To address this question, we have generated a knock-in mouse strain that expresses a phosphorylation-deficient mutant of the M(3)-muscarinic receptor, a prototypical G(q/11)-coupled receptor. This mutant mouse strain was used here to investigate the role of M(3)-muscarinic receptor phosphorylation in the regulation of insulin secretion from pancreatic islets. Importantly, the phosphorylation deficient receptor coupled to G(q/11)-signaling pathways but was uncoupled from phosphorylation-dependent processes, such as receptor internalization and Î²-arrestin recruitment. The knock-in mice showed impaired glucose tolerance and insulin secretion, indicating that M(3)-muscarinic receptors expressed on pancreatic islets regulate glucose homeostasis via receptor phosphorylation-/arrestin-dependent signaling. The mechanism centers on the activation of protein kinase D1, which operates downstream of the recruitment of Î²-arrestin to the phosphorylated M(3)-muscarinic receptor. In conclusion, our findings support the unique concept that M(3)-muscarinic receptor-mediated augmentation of sustained insulin release is largely independent of G protein-coupling but involves phosphorylation-/arrestin-dependent coupling of the receptor to protein kinase D1.

M3-muscarinic receptor promotes insulin release via receptor phosphorylation/arrestin-dependent activation of protein kinase D1.

L&#39;activit&eacute; de G protein-coupled receptors est r&eacute;gl&eacute;e par l&#39;interm&eacute;diaire d&#39;apr&egrave;s la stimulation agoniste hyper-phosphorylation. Malgr&eacute; le caract&egrave;re universel de ce processus de r&eacute;glementation, l&#39;impact physiologique de la phosphorylation du r&eacute;cepteur reste mal &eacute;tudi&eacute;. Pour r&eacute;pondre &agrave; cette question, nous avons g&eacute;n&eacute;r&eacute; une souche de souris knock-in qui exprime un mutant de phosphorylation d&eacute;ficient de la M (3)-r&eacute;cepteurs muscariniques, un prototype r&eacute;cepteur coupl&eacute; aux G(q/11). Cette souche de souris mutante a &eacute;t&eacute; utilis&eacute;e ici pour &eacute;tudier le r&ocirc;le de M (3)-la phosphorylation du r&eacute;cepteur muscarinique dans la r&eacute;gulation de la s&eacute;cr&eacute;tion d&#39;insuline des &icirc;lots pancr&eacute;atiques. Important, le r&eacute;cepteur d&eacute;ficient de phosphorylation coupl&eacute;e &agrave; des voies de signalisation de G(q/11) mais a &eacute;t&eacute; d&eacute;coupl&eacute; de processus de phosphorylation d&eacute;pendants, tels que l&#39;internalisation du r&eacute;cepteur et de la &beta;-arrestine recrutement. Les souris knock-in a montr&eacute; avec facult&eacute;s affaiblies de la s&eacute;cr&eacute;tion d&#39;insuline et de la tol&eacute;rance glucose, indiquant que M (3) - r&eacute;cepteurs muscariniques exprim&eacute;es sur les &icirc;lots pancr&eacute;atiques r&eacute;gulent l&#39;hom&eacute;ostasie du glucose par l&#39;interm&eacute;diaire de la phosphorylation du r&eacute;cepteur- / arrestine-d&eacute;pendante de signalisation. Les centres de m&eacute;canisme sur l&#39;activation de la prot&eacute;ine kinase D1, qui op&egrave;re en aval du recrutement de la &beta;-arrestine aux M phosphoryl&eacute;e (3)-r&eacute;cepteur muscarinique. En conclusion, nos r&eacute;sultats appuient le concept unique que M (3) - augmentation de m&eacute;di&eacute;e par les r&eacute;cepteurs muscarinique de la lib&eacute;ration d&#39;insuline soutenue est largement ind&eacute;pendante de la prot&eacute;ine G raccord mais implique la phosphorylation- / couplage du r&eacute;cepteur de prot&eacute;ine kinase D1 arrestine-d&eacute;pendante.

R&eacute;cepteur muscarinique M3 favorise la lib&eacute;ration d&#39;insuline par l&#39;interm&eacute;diaire de l&#39;activation du r&eacute;cepteur &Eacute;PC-arrestine-phosphorylation de la prot&eacute;ine kinase D1.

Die Aktivit&auml;t von G-Protein-gekoppelter Rezeptoren ist &uuml;ber hyper-Phosphorylierung folgende Agonist Stimulierung reguliert. Trotz der universellen Natur dieser Regulierungsprozess bleibt die physiologische Auswirkungen der Rezeptor Phosphorylierung schlecht studierte. Um diese Frage zu l&ouml;sen, haben wir einen Knock-in Maus-Stamm, der eine Phosphorylierung-defizienten Mutante des M (3) dr&uuml;ckt erzeugt-muskarinische Rezeptoren, ein prototypisches G(q/11)-gekoppelter Rezeptor. Diese mutierte Maus-Sorte wurde hier verwendet, um die Rolle von M (3) untersuchen-muskarinische Rezeptoren Phosphorylierung bei der Regulierung der Insulin-Sekretion von Pankreas Inselchen. Wichtig ist, der Phosphorylierung mangelhaft Rezeptor gekoppelt mit G(q/11)-Signalisierung Wege aber war abgekoppelt von Phosphorylierung-abh&auml;ngige Prozesse wie Rezeptor Internalisierung und &beta;-arrestin Rekrutierung. Die Knock-in-M&auml;use zeigte beeintr&auml;chtigt Glukose Toleranz und Insulin-Sekretion, der angibt, dass M (3) - muskarinische Rezeptoren auf Pankreas Inselchen ausgedr&uuml;ckt regulieren Glukose Hom&ouml;ostase &uuml;ber Rezeptor-Phosphorylierung- / arrestin-abh&auml;ngige zu signalisieren. Die Mechanismus-Centers auf der Aktivierung der Proteinkinase D1, die stromabw&auml;rts betreibt der Rekrutierung von &beta;-arrestin phosphorylierten m (3)-muskarinische Rezeptoren. Abschlie&szlig;end unsere Erkenntnisse unterst&uuml;tzen das einzigartige Konzept, dass M (3) - muskarinische Rezeptoren vermittelt Vermehrung des anhaltend Insulin-Freisetzung besteht weitgehend unabh&auml;ngig von G-Protein-Kupplung sondern Phosphorylierung- / arrestin-abh&auml;ngige Ankopplung von der Proteinkinase D1-Rezeptor.

M3-muskarinische Rezeptoren f&ouml;rdert Insulin-Freisetzung &uuml;ber-Phosphorylierung/arrestin-abh&auml;ngige Aktivierung der Proteinkinase D1.

L&#39;attivit&agrave; dei recettori accoppiati a proteine G &egrave; regolata tramite stimolazione agonista seguito iper-fosforilazione. Nonostante la natura universale di questo processo normativo, l&#39;impatto fisiologico di fosforilazione del recettore rimane scarsamente studiato. Per rispondere a questa domanda, noi abbiamo generato un ceppo di topo knock-in che esprime un mutante di fosforilazione-carenti di M (3)-recettore muscarinico, un recettore accoppiato G(q/11) prototipo. Questo ceppo mutante del mouse &egrave; stato qui utilizzato per indagare il ruolo di M. (3)-fosforilazione del recettore muscarinico nella regolazione della secrezione di insulina da isolotti pancreatici. Soprattutto, il recettore carenti di fosforilazione accoppiato alla G(q/11)-signaling pathways ma fu staccato da processi di fosforilazione-dipendente, come internalizzazione del recettore e &beta;-arrestin reclutamento. I topi knock-in ha mostrato ridotta secrezione insulina e la tolleranza di glucosio, che indica che M (3) - recettori muscarinici espressi su isole pancreatiche regolano l&#39;omeostasi del glucosio tramite la fosforilazione del recettore- / segnalazione arrestin-dipendente. I centri di meccanismo sull&#39;attivazione della chinasi di proteina D1, che opera a valle del reclutamento di &beta;-arrestin fosforilata m (3)-recettore muscarinico. In conclusione, i nostri risultati supportano il concetto unico che M (3) - augmentation mediata dal recettore muscarinico del rilascio di insulina sostenuta &egrave; in gran parte indipendenti da G proteina-accoppiamento ma coinvolge la fosforilazione- / accoppiamento del recettore a chinasi di proteina D1 arrestin-dipendente.

Recettore muscarinico M3 promuove il rilascio di insulina tramite attivazione di recettori fosforilazione/arrestin-dipendente della chinasi di proteina D1.

G &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x5171;&#x5F79;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x306F;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D1;&#x30FC; &#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x6B21;&#x30A2;&#x30B4;&#x30CB;&#x30B9;&#x30C8;&#x523A;&#x6FC0;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x898F;&#x5236;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x898F;&#x5236;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306E;&#x666E;&#x904D;&#x7684;&#x306A;&#x6027;&#x8CEA;&#x306B;&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3001;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x306E;&#x751F;&#x7406;&#x7684;&#x5F71;&#x97FF;&#x60AA;&#x3044;&#x52C9;&#x5F37;&#x306E;&#x307E;&#x307E;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x554F;&#x984C;&#x306B;&#x5BFE;&#x51E6;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x6B20;&#x640D;&#x5909;&#x7570;&#x4F53; M (3) &#x8868;&#x73FE;&#x3059;&#x308B;&#x30CE;&#x30C3;&#x30AF;&#x30A4;&#x30F3; &#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x7DCA;&#x5F35;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;-&#x30E0;&#x30B9;&#x30AB;&#x30EA;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3001;G(q/11) &#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x539F;&#x578B;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x7DCA;&#x5F35;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x3053;&#x3067; M (3) &#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x305F;-&#x30E0;&#x30B9;&#x30AB;&#x30EA;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x5206;&#x6CCC;&#x81B5;&#x5CF6;&#x304B;&#x3089;&#x3002;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x306F;&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x6B20;&#x4E4F;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53; G(q/11) &#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x7D50;&#x5408;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x5185;&#x5728;&#x5316;&#x3068; &beta; &#x30A2;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C1;&#x30F3;&#x52DF;&#x96C6;&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x4F9D;&#x5B58;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x304B;&#x3089;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30CE;&#x30C3;&#x30AF;&#x30A4;&#x30F3; &#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x30B0;&#x30EB;&#x30B3;&#x30FC;&#x30B9;&#x8010;&#x6027;&#x3084;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x306E;&#x5206;&#x6CCC;&#x969C;&#x5BB3;&#x8005; M (3) - &#x81B5;&#x5CF6;&#x306E;&#x30E0;&#x30B9;&#x30AB;&#x30EA;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x30B0;&#x30EB;&#x30B3;&#x30FC;&#x30B9;&#x6052;&#x5E38;&#x6027;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3059;&#x308B;-/&#x30A2;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C1;&#x30F3;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E0B;&#x6D41;&#x3067;&#x52D5;&#x4F5C;&#x6A5F;&#x69CB;&#x30FB; &#x30BB;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC; D1&#x3001;&beta; &#x30A2;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C1;&#x30F3; &#x30EA;&#x30F3;&#x9178; m &#xFF08;3&#xFF09; &#x306E;&#x52DF;&#x96C6;-&#x30E0;&#x30B9;&#x30AB;&#x30EA;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3002;&#x7D50;&#x8AD6;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x8ABF;&#x67FB;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;&#x30E6;&#x30CB;&#x30FC;&#x30AF;&#x306A;&#x30B3;&#x30F3;&#x30BB;&#x30D7;&#x30C8;&#x3092;&#x30B5;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x305D;&#x306E; M (3) - &#x6301;&#x7D9A;&#x7684;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x5206;&#x6CCC;&#x306E;&#x30E0;&#x30B9;&#x30AB;&#x30EA;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x5897;&#x5F37;&#x306E; G &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x5927;&#x90E8;&#x5206;&#x304C;&#x72EC;&#x7ACB;&#x3067;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x3092;&#x4F34;&#x3044;&#x307E;&#x3059;-/&#x30A2;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C1;&#x30F3;&#x4F9D;&#x5B58;&#x578B;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC; D1 &#x306B;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

M3 &#x30E0;&#x30B9;&#x30AB;&#x30EA;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;/&#x30A2;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C1;&#x30F3;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC; D1 &#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x5206;&#x6CCC;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

G &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xACB0;&#xD569; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC758; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC740; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654; &#xD558;&#xC774;&#xD37C; &#xB2E4;&#xC74C; &#xAE38; &#xD56D; &#xC81C; &#xC790;&#xADF9;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xD1B5;&#xC81C; &#xB41C;&#xB2E4;. &#xC774; &#xADDC;&#xC81C; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xC758; &#xBCF4;&#xD3B8;&#xC801;&#xC778; &#xC131;&#xACA9;&#xC5D0;&#xB3C4; &#xBD88;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654;&#xC758; &#xC0DD;&#xB9AC; &#xC801; &#xC601;&#xD5A5; &#xB0A8;&#xC544; &#xC81C;&#xB300;&#xB85C; &#xACF5;&#xBD80;. &#xC774; &#xBB38;&#xC81C;&#xB97C; &#xD574;&#xACB0; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC6B0;&#xB9AC; M (3)&#xC758; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654; &#xBD88;&#xCDA9;&#xBD84; &#xD55C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xD45C;&#xD604; &#xD558;&#xB294; &#xB178;&#xD06C; &#xB9C8;&#xC6B0;&#xC2A4; &#xBCC0;&#xD615; &#xC0DD;&#xC131;-muscarinic &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;, &#xC6D0;&#xD615; G(q/11) &#xACB0;&#xD569; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;. &#xC774; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xB9C8;&#xC6B0;&#xC2A4; &#xAE34;&#xC7A5; &#xC5EC;&#xAE30; M (3)&#xC758; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xC870;&#xC0AC; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD55C;-&#xC778;&#xC290;&#xB9B0; &#xBD84; &#xBE44; &#xCDCC; &#xC7A5; &#xB3C5;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xADDC;&#xC81C;&#xC5D0;&#xC11C; muscarinic &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654;. &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xAC83;&#xC740;, &#xC778; &#xC0B0;&#xD654; &#xACB0;&#xD54D; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; G(q/11) &#xC2E0;&#xD638; &#xACBD;&#xB85C;&#xC5D0; &#xACB0;&#xD569; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xAD6D;&#xC81C;&#xD654; &#xBC0F; &beta;-arrestin &#xBAA8;&#xC9D1; &#xB4F1;&#xC758; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654; &#xC885;&#xC18D; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACB0;&#xD569; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB178;&#xD06C; &#xC950; &#xBD84; &#xD3EC;&#xB3C4; &#xB2F9; &#xD3EC;&#xC6A9; &#xB825;&#xACFC; &#xC778;&#xC290;&#xB9B0; &#xBE44;&#xB97C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xC7A5;&#xC560;&#xAC00; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0AC;&#xB2E4; M (3)-&#xCDCC; &#xC7A5; &#xB3C5;&#xB3C4; muscarinic &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC758; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xD3EC;&#xB3C4; &#xB2F9; &#xD56D;&#xC0C1;&#xC131; &#xC870;&#xC808;-arrestin &#xC885;&#xC18D; &#xC2E0;&#xD638; /. &#xD558;&#xB958;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; d 1&#xC758; &#xD65C;&#xC131;&#xD654;&#xC5D0; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998; &#xC13C;&#xD130; phosphorylated m (3) &beta;-arrestin&#xC758; &#xBAA8;&#xC9D1;-muscarinic &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;. &#xACB0;&#xB860;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xACB0;&#xACFC; &#xC9C0;&#xC6D0; &#xB3C5;&#xD2B9;&#xD55C; &#xAC1C;&#xB150; &#xADF8; M (3)-&#xC9C0;&#xC18D;&#xC801;&#xC778;&#xB41C; &#xC778;&#xC290;&#xB9B0; &#xB9B4;&#xB9AC;&#xC2A4;&#xC758; muscarinic &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;-&#xC911;&#xC7AC; &#xD655;&#xB300;&#xB294; G &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xACB0;&#xD569; &#xD06C;&#xAC8C; &#xBB34;&#xAD00; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654; &#xD3EC;&#xD568; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;-/ arrestin &#xC885;&#xC18D; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; d 1 &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC758; &#xCEE4;&#xD50C;&#xB9C1;.

M3 muscarinic &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; d 1&#xC758; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654;/arrestin &#xC885;&#xC18D; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xC778;&#xC290;&#xB9B0; &#xBC29;&#xCD9C; &#xCD09;&#xC9C4;.

La actividad de los receptores acoplados a prote&iacute;nas G se regula mediante la estimulaci&oacute;n de agonista siguientes hiper-fosforilaci&oacute;n. Pese al car&aacute;cter universal de este proceso de reglamentaci&oacute;n, los efectos fisiol&oacute;gicos de la fosforilaci&oacute;n del receptor sigue siendo mal estudiado. Para abordar esta cuesti&oacute;n, hemos generado una cepa de rat&oacute;n knock-in que expresa un mutante de la deficiencia de fosforilaci&oacute;n de la M (3)-receptor muscar&iacute;nico, un prototipo receptor acoplado a G(q/11). Esta cepa de rat&oacute;n mutante fue utilizada aqu&iacute; para investigar el papel de M (3)-fosforilaci&oacute;n de receptores muscar&iacute;nicos en la regulaci&oacute;n de la secreci&oacute;n de insulina de los islotes pancre&aacute;ticos. Lo importante, el receptor deficiente de fosforilaci&oacute;n junto a las v&iacute;as de se&ntilde;alizaci&oacute;n G(q/11) pero fue desacoplado de procesos de fosforilaci&oacute;n dependientes, como internalizaci&oacute;n del receptor &beta;-arrestin reclutamiento. Los ratones knock-in mostraron alteraci&oacute;n de la secreci&oacute;n de insulina y la tolerancia glucosa, lo que indica que M (3) - receptores muscar&iacute;nicos expresados en islotes pancre&aacute;ticos regulan la homeostasis de la glucosa por fosforilaci&oacute;n del receptor- / se&ntilde;alizaci&oacute;n arrestin-dependiente. El mecanismo se centra en la activaci&oacute;n de la prote&iacute;na quinasa D1, que opera en aguas abajo del reclutamiento de &beta;-arrestin fosforilada (m3)-receptor muscar&iacute;nico. En conclusi&oacute;n, nuestros resultados apoyan el concepto &uacute;nico que M (3) - aumento mediada por receptor muscar&iacute;nico de la liberaci&oacute;n de insulina sostenida es en gran parte independiente de G prote&iacute;na-acoplamiento pero implica fosforilaci&oacute;n- / arrestin-dependiente del acoplamiento del receptor a la prote&iacute;na quinasa D1.

Receptor muscar&iacute;nico m3 promueve la secreci&oacute;n de insulina mediante la activaci&oacute;n del receptor de la fosforilaci&oacute;n/arrestin-dependiente de la prote&iacute;na quinasa D1.

Sarah E. Munson

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