in-vivo-detection-protein-protein-interactions-on-micro-patterned

<em>In-vivo</em> Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Johannes Kepler Universitat Linz

STIM1 &#x548C; ORAI1 &#xFF08;&#x4E5F;&#x79F0;&#x4E3A; CRACM1&#xFF09; &#x662F;&#x91CD;&#x8981;&#x7EC4;&#x6210;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x53E4;&#x5178;&#x9499;&#x91CA;&#x653E;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x9499;&#x7535;&#x6D41; &#xFF1B;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;STIM1 &#x5230;&#x9499;&#x91CA;&#x653E;&#x9499;/ORAI1 &#x901A;&#x9053;&#x4FE1;&#x606F;&#x7684;&#x4F20;&#x8F93;&#x673A;&#x5236;&#x76EE;&#x524D;&#x5C1A;&#x672A;&#x53EF;&#x77E5;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x5C55;&#x793A; F&ouml;rster &#x5171;&#x632F;&#x80FD;&#x91CF;&#x8F6C;&#x79FB;&#x955C;&#x52A8;&#x6001;&#x8026;&#x5408;&#x7684; STIM1 &#x548C; ORAI1&#xFF0C;&#x6700;&#x7EC8;&#x7ECF;&#x6761;&#x76EE;&#x7684;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x624D;&#x80FD;&#x5F97;&#x5230;&#x3002;F&ouml;rster &#x5171;&#x632F;&#x80FD;&#x91CF;&#x8F6C;&#x79FB;&#x7684;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6210;&#x50CF;&#x63D0;&#x4F9B;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x6B64;&#x7ECF;&#x5B58;&#x50A8;&#x8017;&#x5C3D;&#x3001; STIM1 multimerization &#x548C; STIM1 ORAI1 &#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7EC4;&#x6210;&#x7684;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x901A;&#x8DEF;&#x7684;&#x5173;&#x952E;&#x4E8B;&#x4EF6;&#x7684;&#x65F6;&#x95F4;&#x4F9D;&#x8D56;&#x6027;&#x3002;&#x52A0;&#x901F;&#x7684;&#x5B58;&#x50A8;&#x8017;&#x5C3D;&#x5141;&#x8BB8;&#x89E3;&#x51B3;&#x91CD;&#x5927;&#x76F8;&#x9694;&#x4E00;&#x6BB5;&#x65F6;&#x95F4; STIM1 STIM1 &#x548C; STIM1 ORAI1 &#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x5B58;&#x50A8;&#x52A0;&#x6C14;&#x626D;&#x8F6C; STIM1 multimerization &#x548C; STIM1 ORAI1 &#x4E92;&#x52A8;&#x3002;&#x6E38;&#x79BB;&#x7684; STIM1 C &#x603B;&#x7AD9;&#x672C;&#x8EAB;&#x662F;&#x80FD;&#x3001; &#x4F53;&#x5916;&#x4EE5;&#x53CA;&#x4F53;&#x5185;&#xFF0C;&#x4E0E; ORAI1 &#x76F8;&#x5173;&#x8054;&#xFF0C;&#x5E76;&#x523A;&#x6FC0;&#x901A;&#x9053;&#x529F;&#x80FD;&#xFF0C;&#x4F46;&#x6CA1;&#x6709; ORAI1 STIM1 &#x96C6;&#x7FA4;&#x5F62;&#x6210;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x5305;&#x62EC;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5047;&#x5B9A;&#x76D8;&#x7ED5;&#x7EBF;&#x5708;&#x57DF;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684; ORAI1 &#x7684; C &#x603B;&#x7AD9;&#x53D1;&#x751F;&#x52A8;&#x6001;&#x7684;&#x4EA4;&#x4E92;&#x3002;ORAI1 C &#x603B;&#x7AD9;&#x7F3A;&#x5931;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x548C;&#x7A81;&#x53D8; (L273S) &#x4E0E;&#x963B;&#x788D;&#x7684;&#x7EBF;&#x5708;&#x76D8;&#x7ED5;&#x57DF;&#x5F62;&#x6210;&#x7F3A;&#x4E4F;&#x4E92;&#x52A8;&#x548C; STIM1 &#x529F;&#x80FD;&#x6C9F;&#x901A;&#x4EE5;&#x53CA;&#x672A;&#x80FD;&#x751F;&#x6210;&#x7ECF;&#x5185;&#x5411;&#x94A0;&#x7535;&#x6D41;&#x3002;N &#x7EC8;&#x7AEF;&#x7F3A;&#x5931;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x7684; ORAI1 &#x4EE5;&#x53CA; ORAI1 R91W &#x7A81;&#x53D8;&#x94FE;&#x63A5;&#x81F3;&#x4E25;&#x91CD;&#x8054;&#x5408;&#x514D;&#x75AB;&#x7F3A;&#x9677;&#x7EFC;&#x5408;&#x5F81;&#x5728;&#x5F53;&#x524D;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x80FD;&#x591F;&#x4EA4;&#x4E92; STIM1 &#x540C;&#x6837;&#x53D7;&#x5230;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;C &#x7EC8;&#x7AEF;&#x76D8;&#x7ED5;&#x7EBF;&#x5708;&#x6BCD;&#x9898;&#x7684; ORAI1 &#x8868;&#x793A;&#x52A8;&#x6001;&#x8026;&#x5408;&#x5230; STIM1 &#x7684;&#x5173;&#x952E;&#x57DF;&#x3002;

&#x52A8;&#x6001;&#x8026;&#x5408;&#x7684;&#x5047;&#x5B9A;&#x76D8;&#x7ED5;&#x7EBF;&#x5708;&#x57DF;&#x7684; ORAI1 &#x4E0E; STIM1 &#x4ECB;&#x5BFC; ORAI1 &#x901A;&#x9053;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x3002;

STIM1 and ORAI1 (also termed CRACM1) are essential components of the classical calcium release-activated calcium current; however, the mechanism of the transmission of information of STIM1 to the calcium release-activated calcium/ORAI1 channel is as yet unknown. Here we demonstrate by FÃ¶rster resonance energy transfer microscopy a dynamic coupling of STIM1 and ORAI1 that culminates in the activation of Ca(2+) entry. FÃ¶rster resonance energy transfer imaging of living cells provided insight into the time dependence of crucial events of this signaling pathway comprising Ca(2+) store depletion, STIM1 multimerization, and STIM1-ORAI1 interaction. Accelerated store depletion allowed resolving a significant time lag between STIM1-STIM1 and STIM1-ORAI1 interactions. Store refilling reversed both STIM1 multimerization and STIM1-ORAI1 interaction. The cytosolic STIM1 C terminus itself was able, in vitro as well as in vivo, to associate with ORAI1 and to stimulate channel function, yet without ORAI1-STIM1 cluster formation. The dynamic interaction occurred via the C terminus of ORAI1 that includes a putative coiled-coil domain structure. An ORAI1 C terminus deletion mutant as well as a mutant (L273S) with impeded coiled-coil domain formation lacked both interaction as well as functional communication with STIM1 and failed to generate Ca(2+) inward currents. An N-terminal deletion mutant of ORAI1 as well as the ORAI1 R91W mutant linked to severe combined immune deficiency syndrome was similarly impaired in terms of current activation despite being able to interact with STIM1. Hence, the C-terminal coiled-coil motif of ORAI1 represents a key domain for dynamic coupling to STIM1.

Dynamic coupling of the putative coiled-coil domain of ORAI1 with STIM1 mediates ORAI1 channel activation.

STIM1 et ORAI1 (aussi appel&eacute;es CRACM1) sont des composantes essentielles du calcium classique &eacute;lectrique-activ&eacute;e calcium actuel ; Toutefois, le m&eacute;canisme de la transmission d&#39;informations de STIM1 sur le canal de sortie activ&eacute;e calcium/ORAI1 de calcium est encore inconnu. Nous d&eacute;montrons par microscopie &agrave; transfert F&ouml;rster resonance energy un couplage dynamique de STIM1 et ORAI1 qui aboutit &agrave; l&#39;activation de l&#39;entr&eacute;e de Ca(2+). Transfert d&#39;&eacute;nergie par r&eacute;sonance F&ouml;rster imagerie de cellules vivantes donn&eacute; un aper&ccedil;u de la d&eacute;pendance temporelle des &eacute;v&eacute;nements cruciaux de cette voie de signalisation comprenant la d&eacute;pl&eacute;tion de magasin Ca(2+), STIM1 multimerization et STIM1-ORAI1 interaction. &Eacute;puisement acc&eacute;l&eacute;r&eacute; de magasin a permis de r&eacute;soudre un d&eacute;calage important entre les STIM1-STIM1 et STIM1-ORAI1 des interactions. Magasin remplissage invers&eacute; les STIM1 multimerization et STIM1-ORAI1 interaction. Le terminus de STIM1 C cytosolique lui-m&ecirc;me a &eacute;t&eacute; en mesure, in vitro comme in vivo, &agrave; associer &agrave; ORAI1 et &agrave; stimuler la fonction du canal, mais sans formation de cluster ORAI1-STIM1. L&#39;interaction dynamique se produit par l&#39;interm&eacute;diaire de la partie C terminale de ORAI1 qui comprend une structure de domaine coiled-coil putatif. Un mutant de d&eacute;l&eacute;tion du terminus ORAI1 C comme un mutant (L273S) avec formation entrav&eacute; domaine coiled-coil manquait tant interaction que communication fonctionnelle avec STIM1 et n&#39;a pas pu g&eacute;n&eacute;rer des courants entrants Ca(2+). Un mutant de d&eacute;l&eacute;tion de N-terminal de ORAI1 ainsi que le syndrome d&#39;immunod&eacute;ficience combin&eacute;e li&eacute; &agrave; s&eacute;v&egrave;re mutant de ORAI1 R91W a &eacute;t&eacute; de m&ecirc;me avec facult&eacute;s affaiblie en termes d&#39;activation actuelle tout en &eacute;tant capables d&#39;interagir avec les STIM1. Par cons&eacute;quent, le motif C-terminal de coiled-coil de ORAI1 repr&eacute;sente un domaine cl&eacute; pour le couplage dynamique &agrave; STIM1.

Couplage dynamique du domaine coiled-coil putatif de ORAI1 avec STIM1 intervient dans l&#39;activation du canal ORAI1.

STIM1 und ORAI1 (auch CRACM1 genannt) sind wesentliche Bestandteile des klassischen Kalzium aktivierte Version Kalziums aktuelle; der Mechanismus der &Uuml;bertragung von Informationen von STIM1 auf den Kalzium-Freigabe aktiviert Kalzium/ORAI1-Kanal ist jedoch noch unbekannt. Hier demonstrieren wir durch F&ouml;rster Resonanz-Energie-Transfer-Mikroskopie eine dynamische Kopplung von STIM1 und ORAI1, die die Aktivierung von Ca(2+) Eintrag gipfelt. F&ouml;rster-Resonanz-Energie-Transfer Imaging lebender Zellen bereitgestellt Einblick in die Zeit-Abh&auml;ngigkeit der entscheidenden Ereignisse dieser Signalweg, bestehend aus Ca(2+) Shop Ersch&ouml;pfung, STIM1 Multimerization und STIM1-ORAI1-Interaktion. Beschleunigte Speicher Ersch&ouml;pfung zul&auml;ssig, l&ouml;sen eine erhebliche Zeitspanne zwischen STIM1-STIM1 und STIM1-ORAI1 Interaktionen. Shop Nachf&uuml;llen, umgekehrt STIM1 Multimerization und STIM1-ORAI1-Interaktion. Das Zytosolische STIM1 Carboxyl-Terminus selbst war in der Lage, in-vitro-als auch in vivo ORAI1 zuzuordnende und Kanal-Funktion, noch ohne ORAI1-STIM1-Cluster-Bildung anzuregen. Die dynamische Wechselwirkung trat &uuml;ber die Carboxyl-Terminus der ORAI1, die eine vermeintliche gewickelt-umwickeltes-Struktur enth&auml;lt. Eine ORAI1 C Endstation L&ouml;schung Mutant sowie eine Mutante (L273S) mit erschwerten gewickelt-umwickeltes Formation fehlte Interaktion sowie funktionale Kommunikation mit STIM1 und Fehler beim Generieren des Ca(2+) nach innen Str&ouml;mungen. Eine N-terminale L&ouml;schung Mutant ORAI1 sowie das ORAI1-R91W-mutant verkn&uuml;pfte bis schwere kombinierte Immundefizienz-Syndrom wurde in &auml;hnlicher Weise beeintr&auml;chtigt in Bezug auf die aktuellen Aktivierung trotz des Seins mit STIM1 interagieren. Das C-terminale aufgerollte Spule Motiv der ORAI1 stellt daher eine wichtige Dom&auml;ne f&uuml;r dynamische Ankopplung an STIM1.

Dynamische Kopplung der vermeintlichen aufgerollte Spule-Dom&auml;ne des ORAI1 mit STIM1 vermittelt ORAI1 Kanal Aktivierung.

STIM1 e ORAI1 (chiamato anche CRACM1) sono componenti essenziali del classico calcio attivato dal rilascio calcio corrente; Tuttavia, il meccanismo di trasmissione di informazioni di STIM1 per il canale del calcio calcio/ORAI1 attivato dal rilascio &egrave; ancora sconosciuto. Qui dimostriamo da F&ouml;rster resonance energy transfer microscopy un accoppiamento dinamico di STIM1 e ORAI1 che culmina con l&#39;attivazione della voce Ca(2+). Trasferimento di energia per risonanza imaging delle cellule viventi fornito spaccato la dipendenza dal tempo di eventi cruciali di questa via di segnalazione composto da Ca(2+) negozio deplezione, STIM1 multimerization e STIM1 ORAI1 interazione. Negozio accelerata deplezione consentito risolvendo un significativo ritardo tra STIM1 STIM1 e STIM1 ORAI1 interazioni. Negozio ricarica invertito sia STIM1 multimerization STIM1 ORAI1 interazione. Citosolico STIM1 C terminale stesso era in grado, in vitro, nonch&eacute; in vivo, da associare a ORAI1 e per stimolare la funzione di canale, ancora senza formazione di cluster ORAI1-STIM1. L&#39;interazione dinamica si &egrave; verificato tramite il C-terminale di ORAI1 che comprende una struttura di dominio coiled-coil putativo. Un mutante di delezione terminale ORAI1 C cos&igrave; come un mutante (L273S) con formazione di dominio coiled-coil impedimento mancava interazione cos&igrave; come comunicazione funzionale con STIM1 e non &egrave; riuscito a generare correnti di Ca(2+) verso l&#39;interno. Un mutante di delezione N-terminale di ORAI1 cos&igrave; come la sindrome di mutante collegato a grave deficit immunitario combinato ORAI1 R91W era similmente alterato in termini di attivazione corrente pur essendo in grado di interagire con STIM1. Quindi, il motivo del C-terminale coiled-coil di ORAI1 rappresenta un dominio chiave per accoppiamento dinamico a STIM1.

Accoppiamento dinamico del dominio coiled-coil putativo di ORAI1 con STIM1 media attivazione canale ORAI1.

STIM1 &#x3068; ORAI1 &#xFF08;CRACM1 &#x3068;&#x3082;&#x547C;&#x3070;&#x308C;&#x307E;&#x3059;) &#x30EA;&#x30EA;&#x30FC;&#x30B9; &#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x53E4;&#x5178;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0; &#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0;&#x306E;&#x73FE;&#x5728;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x30B3;&#x30F3;&#x30DD;&#x30FC;&#x30CD;&#x30F3;&#x30C8;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x305F;&#x3060;&#x3057;&#x3001;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0; &#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0;/ORAI1 &#x306E;&#x30EA;&#x30EA;&#x30FC;&#x30B9;&#x304C;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6; &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306B; STIM1 &#x306E;&#x60C5;&#x5831;&#x4F1D;&#x9054;&#x306E;&#x6A5F;&#x69CB;&#x306F;&#x307E;&#x3060;&#x4E0D;&#x660E;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053; STIM1 &#x3068;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0; &#x30A8;&#x30F3;&#x30C8;&#x30EA;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x3067;&#x7D76;&#x9802;&#x306B;&#x9054;&#x3059;&#x308B; ORAI1 &#x306E;&#x52D5;&#x7684;&#x7D50;&#x5408;&#x86CD;&#x5149;&#x5171;&#x9CF4;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;&#x4F1D;&#x9054;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x6CD5;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x86CD;&#x5149;&#x5171;&#x9CF4;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;&#x79FB;&#x52D5;&#x751F;&#x304D;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0; &#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0; &#x30B9;&#x30C8;&#x30A2;&#x67AF;&#x6E07;&#x3001;STIM1 &#x591A;&#x91CF;&#x4F53;&#x5F62;&#x6210;&#x304A;&#x3088;&#x3073; STIM1 ORAI1 &#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x304B;&#x3089;&#x6210;&#x308B;&#x3053;&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x30A4;&#x30D9;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;&#x6642;&#x9593;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x306B;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x529B;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x52A0;&#x901F;&#x30B9;&#x30C8;&#x30A2;&#x306E;&#x67AF;&#x6E07;&#x306F;&#x3001;STIM1 STIM1 &#x3068; STIM1 ORAI1 &#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x9577;&#x3044;&#x9045;&#x5EF6;&#x6642;&#x9593;&#x3092;&#x89E3;&#x6C7A;&#x3059;&#x308B;&#x8A31;&#x53EF;&#x3002;&#x30B9;&#x30C8;&#x30A2;&#x306E;&#x88DC;&#x5145; STIM1 &#x591A;&#x91CF;&#x4F53;&#x5F62;&#x6210;&#x3068; STIM1 ORAI1 &#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x9006;&#x8EE2;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30BE;&#x30EB;&#x6027;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x306E; STIM1 &#x306E; C &#x672B;&#x7AEF;&#x81EA;&#x4F53;&#x3053;&#x3068;&#x304C; in vitro &#x3067;&#x3068;&#x540C;&#x69D8;&#x3001;&#x751F;&#x4F53;&#x5185;&#x3067; ORAI1 &#x3068;&#x3092;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x3068;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x95A2;&#x6570;&#x3092;&#x307E;&#x3060;&#x306A;&#x3057; ORAI1 STIM1 &#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x5F62;&#x6210;&#x3092;&#x523A;&#x6FC0;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x52D5;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x63A8;&#x5B9A;&#x30B3;&#x30A4;&#x30EB;&#x30C9; &#x30B3;&#x30A4;&#x30EB; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x69CB;&#x9020;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059; ORAI1 &#x306E; C &#x672B;&#x7AEF;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x304C;&#x767A;&#x751F;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x59A8;&#x3052;&#x3089;&#x308C;&#x308B;&#x30B3;&#x30A4;&#x30EB;&#x30C9; &#x30B3;&#x30A4;&#x30EB; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x5F62;&#x6210;&#x3068;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x4F53; (L273S) &#x3068;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;&#x3001;ORAI1 &#x306E; C &#x672B;&#x7AEF;&#x9818;&#x57DF;&#x306E;&#x6B20;&#x5931;&#x5909;&#x7570; STIM1 &#x3068;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x306A;&#x901A;&#x4FE1;&#x3068;&#x540C;&#x69D8;&#x3001;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306B;&#x6B20;&#x3051;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3057;&#x3001;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0;&#x5185;&#x5411;&#x304D;&#x96FB;&#x6D41;&#x306E;&#x751F;&#x6210;&#x306B;&#x5931;&#x6557;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;N &#x672B;&#x7AEF;&#x6B20;&#x5931;&#x5909;&#x7570; ORAI1 R91W &#x5909;&#x7570;&#x30EA;&#x30F3;&#x30AF;&#x304B;&#x3089;&#x91CD;&#x5EA6;&#x8907;&#x5408;&#x514D;&#x75AB;&#x4E0D;&#x5168;&#x75C7;&#x5019;&#x7FA4;&#x3068;&#x540C;&#x69D8;&#x306B; ORAI1 &#x306E; STIM1 &#x3068;&#x5BFE;&#x8A71;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x306B;&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x73FE;&#x5728;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x306E;&#x9762;&#x3067;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;&#x652F;&#x969C;&#x306F;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;ORAI1 &#x306E; C &#x672B;&#x7AEF;&#x30B3;&#x30A4;&#x30EB;&#x30C9; &#x30B3;&#x30A4;&#x30EB; &#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5; STIM1 &#x52D5;&#x7684;&#x7D50;&#x5408;&#x7528;&#x30AD;&#x30FC; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3092;&#x8868;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

STIM1 &#x3068; ORAI1 &#x306E;&#x63A8;&#x5B9A;&#x30B3;&#x30A4;&#x30EB;&#x30C9; &#x30B3;&#x30A4;&#x30EB; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30C3;&#x30AF; &#x30AB;&#x30C3;&#x30D7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0; ORAI1 &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x3092;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

STIM1 &#xBC0F; ORAI1 (CRACM1 &#xB77C;&#xACE0;&#xB3C4; &#xD568;)&#xB294; &#xD604;&#xC7AC;; &#xD558;&#xB294; &#xACE0;&#xC804;&#xC801;&#xC778; &#xCE7C;&#xC298; &#xCD9C;&#xC2DC; &#xD65C;&#xC131; &#xCE7C;&#xC298;&#xC758; &#xD544;&#xC218; &#xAD6C;&#xC131; &#xC694;&#xC18C; &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xCE7C;&#xC298; &#xCD9C;&#xC2DC; &#xD65C;&#xC131; &#xCE7C;&#xC298;/orai1&#xB85C; stim1&#xC758; &#xC815;&#xBCF4;&#xB97C; &#xC804;&#xC1A1; &#xD558;&#xB294; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC740; &#xC544;&#xC9C1; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC2DC;&#xC5F0; F&ouml;rster &#xACF5;&#xBA85; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0; &#xC804;&#xC1A1; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC95;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; stim1&#xC640; ORAI1 Ca(2+) &#xD56D;&#xBAA9;&#xC758; &#xD65C;&#xC131;&#xD654;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC808;&#xC815; &#xB3D9;&#xC801; &#xACB0;&#xD569; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. F&ouml;rster &#xACF5;&#xBA85; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0; &#xC804;&#xB2EC; Ca(2+) &#xC800;&#xC7A5;&#xC18C; &#xACE0;&#xAC08;, STIM1 multimerization, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; STIM1 ORAI1 &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC73C;&#xB85C; &#xAD6C;&#xC131; &#xB41C; &#xD558;&#xC774; &#xC2E0;&#xD638; &#xD1B5;&#xB85C;&#xC758; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC774;&#xBCA4;&#xD2B8;&#xC758; &#xC2DC;&#xAC04; &#xC758;&#xC874;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xB294; &#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xC601;&#xC0C1;. &#xAC00;&#xC18D;&#xB41C; &#xC800;&#xC7A5;&#xC18C; &#xACE0;&#xAC08; STIM1 stim1&#xC640; STIM1-ORAI1 &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xC9C0;&#xC5F0; &#xC2DC;&#xAC04;&#xC744; &#xD655;&#xC778;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC800;&#xC7A5;&#xC18C;&#xB97C; &#xCC44;&#xC6B0;&#xB294; &#xBC18;&#xC804; STIM1 multimerization &#xBC0F; STIM1 ORAI1 &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;. &#xC790;&#xCCB4; cytosolic STIM1 C &#xC885;&#xC810; &#xC218;, &#xCCB4; &#xC678;&#xB85C; in vivo, orai1&#xC5D0; &#xC5F0;&#xACB0; &#xD558; &#xACE0; ORAI1 STIM1 &#xD074;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xD130; &#xD615;&#xC131; &#xC5C6;&#xC774; &#xC544;&#xC9C1; &#xCC44;&#xB110; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xC790;&#xADF9; &#xD558;&#xB294;. &#xB3D9;&#xC801; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xC0C1; &#xCF54;&#xC77C; &#xCF54;&#xC77C; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; orai1&#xC758; C &#xB9D0;&#xB2E8;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. ORAI1 C &#xB9D0;&#xB2E8; &#xC0AD;&#xC81C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xCCB4;&#xB85C; &#xBE44;&#xB2A5;&#xB960;&#xC801;&#xB41C; &#xCF54;&#xC77C; &#xCF54;&#xC77C; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xD615;&#xC131; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; (L273S) &#xBD80;&#xC871;&#xC73C;&#xB85C; &#xC0C1;&#xD638;&#xC640; stim1&#xC640;&#xC758; &#xD1B5;&#xC2E0;&#xC744; &#xAE30;&#xB2A5; &#xBC0F; Ca(2+) &#xC548;&#xCABD;&#xC73C;&#xB85C; &#xC804;&#xB958;&#xB97C; &#xC0DD;&#xC131; &#xD558;&#xC9C0; &#xBABB;&#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. ORAI1 ORAI1 R91W &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB41C; &#xC2EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xD569; &#xB41C; &#xBA74;&#xC5ED; &#xACB0;&#xD54D; &#xC99D;&#xD6C4;&#xAD70;&#xC758; N &#xB2E8;&#xC790; &#xC0AD;&#xC81C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; STIM1 &#xC791;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC784;&#xC5D0;&#xB3C4; &#xBD88;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0; &#xD604;&#xC7AC; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xCE21;&#xBA74;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB9C8;&#xCC2C;&#xAC00;&#xC9C0;&#xB85C; &#xC7A5;&#xC560;&#xC778; &#xC774;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, orai1&#xC758; C-&#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xCF54;&#xC77C; &#xCF54;&#xC77C; &#xBAA8;&#xD2F0;&#xBE0C; stim1&#xC758; &#xB3D9;&#xC801; &#xACB0;&#xD569;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC8FC;&#xC694; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Stim1&#xC640; orai1&#xC758; &#xC0C1; &#xCF54;&#xC77C; &#xCF54;&#xC77C; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; &#xB3D9;&#xC801; &#xCEE4;&#xD50C;&#xB9C1; ORAI1 &#xCC44;&#xB110; &#xD65C;&#xC131;&#xD654;&#xB97C; &#xC911;&#xC7AC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

STIM1 y ORAI1 (tambi&eacute;n llamados CRACM1) son componentes esenciales del cl&aacute;sica calcio activado por liberaci&oacute;n calcio actual; sin embargo, el mecanismo de la transmisi&oacute;n de informaci&oacute;n de STIM1 a los canales de calcio activados por liberaci&oacute;n de calcio/ORAI1 a&uacute;n se desconoce. Aqu&iacute; demostramos por microscop&iacute;a de transferencia de energ&iacute;a de resonancia de F&ouml;rster un acoplamiento din&aacute;mico de STIM1 y ORAI1 que culmina en la activaci&oacute;n de la entrada de CA. Transferencia de energ&iacute;a de resonancia F&ouml;rster im&aacute;genes de c&eacute;lulas vivas proporcionan la penetraci&oacute;n en la dependencia del tiempo de los acontecimientos cruciales de esta v&iacute;a de se&ntilde;alizaci&oacute;n que comprende el agotamiento de la tienda de CA, STIM1 multimerization y la interacci&oacute;n STIM1-ORAI1. Tienda acelerado agotamiento hab&iacute;a permitido resolver un importante desfase temporal entre STIM1-STIM1 y STIM1-ORAI1 interacciones. Tienda rellenar invierte tanto STIM1 multimerization y STIM1-ORAI1 interacci&oacute;n. La terminal citos&oacute;lica de C STIM1 s&iacute; mismo era capaz, in vitro como in vivo, asociado con ORAI1 y estimular la funci&oacute;n del canal, pero sin la formaci&oacute;n de grupos de ORAI1-STIM1. La din&aacute;mica interacci&oacute;n ocurri&oacute; v&iacute;a la terminal C de ORAI1 que incluye una estructura de dominio putativos de coiled-coil. Un mutante de eliminaci&oacute;n terminal de ORAI1 C as&iacute; como un mutante (L273S) con formaci&oacute;n de dominio impedida de coiled-coil carec&iacute;a de interacci&oacute;n, as&iacute; como la comunicaci&oacute;n funcional con STIM1 y no ha podido generar corrientes hacia el interior de la CA. Un mutante de la canceladura de N-terminal de ORAI1, as&iacute; como el s&iacute;ndrome de inmunodeficiencia combinada ligada a graves mutante ORAI1 R91W fue igualmente deteriorado en t&eacute;rminos de activaci&oacute;n actual a pesar de ser capaces de interactuar con STIM1. Por lo tanto, el motivo de coiled-coil c-terminal de ORAI1 representa un dominio clave para el acoplamiento din&aacute;mico a STIM1.

Acoplamiento din&aacute;mico del dominio coiled-coil putativos de ORAI1 con STIM1 media activaci&oacute;n del canal de ORAI1.

&#x6211;&#x4EEC;&#x6765;&#x8FD9;&#x91CC;&#x62A5;&#x5230;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x751F;&#x7269;&#x82AF;&#x7247;&#x8BFB;&#x51FA;&#x4F7F;&#x7528;&#x5FEB;&#x901F;&#x4EA4;&#x66FF;&#x52B1;&#x78C1;&#x88C5;&#x7F6E;&#x7684;&#x7814;&#x5236;&#x3002;&#x6280;&#x672F;&#x901A;&#x8FC7;&#x63D0;&#x4F9B;&#x989D;&#x5916;&#x7684;&#x989C;&#x8272;&#x901A;&#x9053;&#x5728;&#x52B1;&#x78C1;&#x6269;&#x5C55;&#x4E86;&#x6807;&#x51C6;&#x6210;&#x50CF;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4EEA;&#x3002;&#x4F7F;&#x7814;&#x7A76;&#x7684;&#x79FB;&#x52A8;&#x7684;&#x5BF9;&#x8C61;&#xFF0C;&#x4F8B;&#x5982;&#x79EF;&#x6781;&#x8FD0;&#x9001;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684;&#x56CA;&#x6CE1;&#x6216;&#x81EA;&#x7531;&#x4F20;&#x64AD;&#x8840;&#x8102;&#x7684;&#x8102;&#x53CC;&#x5C42;&#xFF0C;&#x7167;&#x660E;&#x8109;&#x51B2;&#x7684;&#x9891;&#x7387;&#x88AB;&#x8BC4;&#x4E3A;&#x591F;&#x9AD8;&#x51E0;&#x4E4E;&#x51BB;&#x7ED3;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x5206;&#x5B50;&#xFF0C;&#x8BAE;&#x6848;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x90FD;&#x901A;&#x8FC7;&#x7167;&#x4EAE;&#x533A;&#x57DF;&#x8F6C;&#x79FB;&#x3002;&#x793A;&#x4F8B;&#x7167;&#x660E;&#x3001; &#x626B;&#x63CF;&#x548C;&#x7EBF;&#x76F8;&#x673A;&#x8BFB;&#x51FA;&#x4EA7;&#x91CF;&#x4E24;&#x4E2A; quasi-simultaneously &#x8BB0;&#x5F55;&#x56FE;&#x50CF;&#x8986;&#x76D6;&#x76F8;&#x540C;&#x7684;&#x6837;&#x672C;&#x533A;&#x57DF;&#x7684;&#x540C;&#x6B65;&#x3002;&#x884D;&#x5C04;&#x6781;&#x9650;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x548C;&#x9AD8;&#x5B9A;&#x4F4D;&#x7CBE;&#x5EA6;&#x7684;&#x70B9;&#x5149;&#x6E90;&#x5230;&#x7EA6; 10 nm &#x901A;&#x8FC7;&#x626B;&#x63CF;&#x663E;&#x793A;&#x56FA;&#x5B9A;&#x5316; 100 nm &#x8367;&#x5149;&#x4E73;&#x80F6;&#x73E0;&#x3002;Ultra-sensitivity &#x7531;&#x5355;&#x4E2A;&#x8367;&#x5149;&#x4EB2;&#x5206;&#x5B50;&#x6269;&#x6563;&#x6D41;&#x4F53;&#x8102;&#x53CC;&#x5C42;&#x7684;&#x5F71;&#x50CF;&#x5B66;&#x8868;&#x73B0;&#x3002;&#x4E24;&#x8272;&#x4EB2;&#x7528; Cy3 &#x548C; Cy5 &#x6807;&#x8BB0;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5728;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5404;&#x81EA;&#x52B1;&#x78C1;&#x6E20;&#x9053; &#xFF1B; &#x4E2D;&#x5BB9;&#x6613;&#x8BC6;&#x522B;&#x67D3;&#x6599;&#x804C;&#x4F4D;&#x9AD8;&#x6309;&#x7167;&#x786E;&#x8BA4;&#x7684;&#x79FB;&#x52A8;&#x5BF9;&#x8C61;&#x7684;&#x5171;&#x5B9A;&#x4F4D;&#x7814;&#x7A76;&#x7684;&#x9002;&#x7528;&#x6027;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x626B;&#x63CF;&#x4E2D;&#x5927;&#x91CF;&#x4EBA;&#x53E3;&#x7684;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6297;&#x4F53;-&#x53D7;&#x4F53;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x8BF4;&#x660E;&#x6B64;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5BF9;&#x4E8E;&#x751F;&#x7269;&#x82AF;&#x7247;&#x4E2D;&#x5E94;&#x7528;&#x7684;&#x53EF;&#x884C;&#x6027;&#x3002;

&#x4EA4;&#x66FF; quasi-simultaneous &#x591A;&#x8272;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x68C0;&#x6D4B;&#x751F;&#x7269;&#x82AF;&#x7247;&#x8BFB;&#x53D6;&#x5668;&#x4E2D;&#x7684;&#x6FC0;&#x52B1;&#x8BA1;&#x5212;&#x7684;&#x6267;&#x884C;&#x60C5;&#x51B5;&#x3002;

We report here the development of a device for single-molecule biochip readout using fast alternating excitation. The technology extends standard imaging cytometry by offering additional color channels in excitation. To enable the study of mobile objects, e.g. actively transported vesicles in living cells or freely diffusing lipids in a lipid bilayer, the frequency of the illumination pulses was chosen high enough to virtually freeze the motion of the biomolecules, as they are shifted through the illuminated area. The synchronization of sample illumination, scanning and line-camera readout yield two quasi-simultaneously recorded images covering the same sample region. Diffraction-limited resolution and high localization precision for point-light sources down to approximately 10 nm was shown by scanning immobilized 100 nm fluorescence latex beads. Ultra-sensitivity was demonstrated by imaging single fluorescent streptavidin molecules diffusing in a fluid lipid bilayer. Two-color streptavidin labeled with Cy3 and Cy5 could be easily identified in the two respective excitation channels; high accordance in the dye positions confirms the applicability for colocalization studies of moving objects. Finally, scans of antibody-receptor interactions in large populations of live cells illustrate the feasibility of this method for biochip application.

Implementation of alternating excitation schemes in a biochip-reader for quasi-simultaneous multi-color single-molecule detection.

Nous rapportons ici le d&#xE9;veloppement d&#x26;#39;un dispositif de lecture de biopuces &#xE0; mol&#xE9;cule unique &#xE0; l&#x26;#39;aide rapide d&#x26;#39;excitation alternatif. La technologie s&#x26;#39;&#xE9;tend cytom&#xE9;trie imagerie standard en offrant des canaux de couleurs suppl&#xE9;mentaires dans l&#x26;#39;excitation. Afin de permettre l&#x26;#39;&#xE9;tude d&#x26;#39;objets mobiles, par exemple, des v&#xE9;sicules activement transport&#xE9;es dans les cellules vivantes ou des lipides se diffusant librement dans une bicouche lipidique, la fr&#xE9;quence des impulsions d&#x26;#39;illumination a &#xE9;t&#xE9; choisie suffisamment &#xE9;lev&#xE9;e pour pratiquement geler le mouvement des biomol&#xE9;cules, comme ils sont d&#xE9;cal&#xE9;s dans le lumineux espace. La synchronisation de l&#x26;#39;&#xE9;chantillon d&#x26;#39;&#xE9;clairage, de num&#xE9;risation et de lecture en ligne &#xE0; huis clos donner deux images quasi-simultan&#xE9;ment enregistr&#xE9;es couvrant la r&#xE9;gion m&#xEA;me &#xE9;chantillon. Limit&#xE9;e par la diffraction r&#xE9;solution et la pr&#xE9;cision de localisation &#xE9;lev&#xE9; pour point de sources de lumi&#xE8;re vers le bas &#xE0; environ 10 nm a &#xE9;t&#xE9; d&#xE9;montr&#xE9;e par la num&#xE9;risation immobilis&#xE9;s 100 nm fluorescence des billes de latex. Ultra-sensibilit&#xE9; a &#xE9;t&#xE9; d&#xE9;montr&#xE9; par imagerie simples mol&#xE9;cules de streptavidine fluorescents diffusant dans une bicouche lipidique fluide. Deux couleurs streptavidine marqu&#xE9;e avec Cy3 et Cy5 pouvaient facilement &#xEA;tre identifi&#xE9;s dans les deux canaux d&#x26;#39;excitation respectives; conform&#xE9;ment &#xE9;lev&#xE9; dans les postes de teinture confirme l&#x26;#39;applicabilit&#xE9; des &#xE9;tudes de colocalisation d&#x26;#39;objets en mouvement. Enfin, les analyses d&#x26;#39;anticorps-r&#xE9;cepteurs interactions dans de grandes populations de cellules vivantes illustrer la faisabilit&#xE9; de cette m&#xE9;thode pour l&#x26;#39;application des biopuces.

La mise en &#x153;uvre d&#x26;#39;une alternance de r&#xE9;gimes d&#x26;#39;excitation dans une biopuce-lecteur pour quasi-simultan&#xE9;e multi-couleur unique mol&#xE9;cule de d&#xE9;tection

Wir berichten hier die Entwicklung eines Ger&auml;tes zur Einzelmolek&uuml;l-Biochip Auslesen mit schnell wechselnden Erregung. Die Technologie erweitert Norm bildgebenden Cytometry durch das Angebot von zus&auml;tzlichen Farbkan&auml;le in Erregung. Um die Studie von mobilen Objekten zu erm&ouml;glichen z.B. aktiv transportiert Vesicles in lebenden Zellen oder frei zu einer Diffusion der Lipide in eine Lipid-Bilayer, die Frequenz der Impulse Beleuchtung gew&auml;hlt wurde hoch genug, um praktisch Einfrieren die Bewegung der Biomolek&uuml;le, wie sie durch den beleuchteten Bereich verschoben werden. Die Synchronisation von Beleuchtung, Scannen und Linie der Kamera Auslesen Ausbeute zwei quasi-simultaneously aufgezeichneten Beispielbilder die gleichen Probe-Region abdeckt. Beugung begrenzte Aufl&ouml;sung und hohe Lokalisierung Pr&auml;zision f&uuml;r Punkt-Lichtquellen bis auf ca. 10 nm wurde durch Scannen immobilisiert 100 nm Fluoreszenz Latex Perlen gezeigt. Ultra-Sensitivity zeigte sich einzelne fluoreszierende Streptavidin-Molek&uuml;le in einer Fl&uuml;ssigkeit Lipid-Bilayer zu einer Diffusion Imaging. Zweifarbige Streptavidin mit Cy3 und Cy5 beschriftet k&ouml;nnte leicht in die beiden Kan&auml;le des jeweiligen Erregung identifiziert werden; hohe &Uuml;bereinstimmung in den Farbstoff-Positionen best&auml;tigt die Anwendbarkeit f&uuml;r Kolokalisation Studien von bewegten Objekten. Schlie&szlig;lich veranschaulichen Scans von Antik&ouml;rper-Rezeptor-Interaktionen in gro&szlig;en Populationen von lebenden Zellen die Machbarkeit dieser Methode f&uuml;r Biochip-Anwendung.

Umsetzung abwechselnder Erregung Systeme in einem Biochip-Reader f&uuml;r quasi-simultaneous Multi-Color Einzelmolek&uuml;l-Erkennung.

Riportiamo qui lo sviluppo di un dispositivo per la lettura di singola molecola biochip utilizzando veloce eccitazione alternati. La tecnologia estende cytometry imaging standard offrendo canali colore aggiuntivo in eccitazione. Per consentire lo studio di oggetti mobili, ad esempio attivamente trasportate vescicole in cellule viventi o liberamente diffondere lipidi in un doppio strato lipidico, la frequenza degli impulsi di illuminazione &egrave; stato scelto abbastanza alto praticamente congelare il movimento delle biomolecole, come essi sono spostati attraverso l&#39;area illuminata. La sincronizzazione del campione illuminazione, scansione e linea-telecamera lettura resa due quasi-simultaneously immagini registrate che copre la regione del campione stesso. Diffrazione limitata risoluzione e precisione di localizzazione alta per sorgenti di luce puntiforme fino a circa 10 nm &egrave; stato mostrato da scansione immobilizzato perline lattice fluorescenza di 100 nm. Ultra-Sensitivity &egrave; stata dimostrata da streptavidina fluorescente singola molecole diffondendo in un doppio strato lipidico fluido di imaging. Due colori streptavidina etichettato con Cy3 e Cy5 potrebbe essere facilmente identificato nei due canali rispettiva eccitazione; alta conformit&agrave; nelle posizioni di tintura conferma l&#39;applicabilit&agrave; per gli studi sulla presenza di oggetti in movimento. Infine, scansioni di interazioni anticorpo-recettore in grandi popolazioni di cellule vive illustrano la fattibilit&agrave; di questo metodo per l&#39;applicazione del biochip.

Implementazione di alternando schemi di eccitazione in un lettore di biochip per quasi rilevazione singola molecola multi-colore.

&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x901F;&#x3044;&#x4EA4;&#x4E92;&#x52B1;&#x8D77;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C3;&#x30D7;&#x306E;&#x8AAD;&#x307F;&#x51FA;&#x3057;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x88C5;&#x7F6E;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x5831;&#x544A;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x6280;&#x8853;&#x306F;&#x3001;&#x52B1;&#x8D77;&#x306E;&#x8FFD;&#x52A0;&#x306E;&#x30AB;&#x30E9;&#x30FC;&#x30C1;&#x30E3;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x6A19;&#x6E96;&#x306E;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x3092;&#x62E1;&#x5F35;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5F7C;&#x3089;&#x306F;&#x7167;&#x660E;&#x3092;&#x901A;&#x3063;&#x3066;&#x30B7;&#x30D5;&#x30C8;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x79FB;&#x52D5;&#x4F53;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3092;&#x6709;&#x52B9;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x751F;&#x304D;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x3084;&#x8102;&#x8CEA;&#x4E8C;&#x91CD;&#x5C64;&#x3067;&#x81EA;&#x7531;&#x306B;&#x62E1;&#x6563;&#x3057;&#x3001;&#x8102;&#x8CEA;&#x3001;&#x4F8B;&#x3048;&#x3070;&#x7A4D;&#x6975;&#x7684;&#x306B;&#x8F38;&#x9001;&#x5C0F;&#x80DE;&#x306F;&#x3001;&#x7167;&#x660E;&#x30D1;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E;&#x5468;&#x6CE2;&#x6570;&#x306F;&#x3001;&#x5B9F;&#x8CEA;&#x7684;&#x306B;&#x751F;&#x4F53;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x52D5;&#x304D;&#x3092;&#x51CD;&#x7D50;&#x3059;&#x308B;&#x306E;&#x306B;&#x5341;&#x5206;&#x9AD8;&#x3044;&#x9078;&#x3070;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x30A8;&#x30EA;&#x30A2;&#x3002;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x7167;&#x660E;&#x3001;&#x30B9;&#x30AD;&#x30E3;&#x30F3;&#x3068;&#x30E9;&#x30A4;&#x30F3;&#x8AAD;&#x307F;&#x51FA;&#x3057;&#x30AB;&#x30E1;&#x30E9;&#x306E;&#x540C;&#x671F;&#x306F;&#x3001;&#x540C;&#x3058;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x9818;&#x57DF;&#x3092;&#x30AB;&#x30D0;&#x30FC;&#x3059;&#x308B;2&#x3064;&#x306E;&#x534A;&#x540C;&#x6642;&#x306B;&#x8A18;&#x9332;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x753B;&#x50CF;&#x3092;&#x5F97;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3;&#x306F;&#x7D04;10 nm&#x306E;&#x70B9;&#x5149;&#x6E90;&#x306E;&#x56DE;&#x6298;&#x9650;&#x754C;&#x306E;&#x5206;&#x89E3;&#x80FD;&#x3068;&#x9AD8;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BA;&#x7CBE;&#x5EA6;&#x304C;&#x56FA;&#x5B9A;&#x5316;&#x3057;&#x305F;100nm&#x3067;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x30E9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x30D3;&#x30FC;&#x30BA;&#x3092;&#x8D70;&#x67FB;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x8D85;&#x9AD8;&#x611F;&#x5EA6;&#x306F;&#x3001;&#x6D41;&#x4F53;&#x8102;&#x8CEA;&#x4E8C;&#x91CD;&#x5C64;&#x306E;&#x62E1;&#x6563;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x30B9;&#x30C8;&#x30EC;&#x30D7;&#x30C8;&#x30A2;&#x30D3;&#x30B8;&#x30F3;&#x5206;&#x5B50;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002; Cy3&#x304A;&#x3088;&#x3073;Cy5&#x3067;&#x6A19;&#x8B58;&#x3057;&#x305F;&#x4E8C;&#x8272;&#x30B9;&#x30C8;&#x30EC;&#x30D7;&#x30C8;&#x30A2;&#x30D3;&#x30B8;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x7C21;&#x5358;&#x306B;2&#x3064;&#x306E;&#x305D;&#x308C;&#x305E;&#x308C;&#x306E;&#x52B1;&#x8D77;&#x30C1;&#x30E3;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB;&#x3067;&#x540C;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x3001;&#x67D3;&#x6599;&#x306E;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x306E;&#x9AD8;&#x3044;&#x306B;&#x5F93;&#x3044;&#x3001;&#x79FB;&#x52D5;&#x30AA;&#x30D6;&#x30B8;&#x30A7;&#x30AF;&#x30C8;&#x306E;&#x5C40;&#x5728;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x9069;&#x7528;&#x6027;&#x3092;&#x78BA;&#x8A8D;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;&#x751F;&#x304D;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x5927;&#x96C6;&#x56E3;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x6297;&#x4F53; - &#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x30B9;&#x30AD;&#x30E3;&#x30F3;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C3;&#x30D7;&#xB7;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;&#x306E;&#x3053;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306E;&#x5B9F;&#x73FE;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x6E96;&#x540C;&#x6642;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30AB;&#x30E9;&#x30FC;&#x5358;&#x5206;&#x5B50;&#x691C;&#x51FA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C3;&#x30D7;&#x30EA;&#x30FC;&#x30C0;&#x30FC;&#x306B;&#x52B1;&#x78C1;&#x65B9;&#x5F0F;&#x3092;&#x4EA4;&#x4E92;&#x306E;&#x5B9F;&#x88C5;

&#xC6B0;&#xB9AC; &#xBCF4;&#xACE0; &#xC5EC;&#xAE30; &#xBE60;&#xB978; &#xB300;&#xCCB4; &#xC5EC;&#xAE30;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xBC14;&#xC774;&#xC624; &#xCE69; &#xD310;&#xB3C5; &#xC7A5;&#xCE58;&#xB97C; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xAE30;&#xC220;&#xC740; &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0; &#xCD94;&#xAC00; &#xC0C9;&#xC0C1; &#xCC44;&#xB110;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558; &#xC5EC; &#xD45C;&#xC900; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; cytometry&#xB97C; &#xD655;&#xC7A5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC608;&#xB97C; &#xB4E4;&#xC5B4; &#xC801;&#xADF9;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBAA8;&#xBC14;&#xC77C; &#xAC1C;&#xCCB4;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB97C; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; &#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xC18C;&#xD3EC; &#xC218;&#xC1A1; &#xB610;&#xB294; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xC9C0;&#xC9C8; bilayer&#xC5D0;&#xC11C; &#xC790;&#xC720;&#xB86D;&#xAC8C; &#xD655;&#xC0B0;, &#xC870;&#xBA85; &#xD384;&#xC2A4;&#xC758; &#xC8FC;&#xD30C;&#xC218; &#xC120;&#xC815; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xCDA9;&#xBD84;&#xD788; &#xB192;&#xC740; &#xC0AC;&#xC2E4;&#xC0C1; &#xB3D9;&#xACB0; biomolecules, &#xBAA8;&#xC158; &#xC870;&#xBA85;&#xB41C; &#xC601;&#xC5ED;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC774;&#xB3D9;. &#xC0D8;&#xD50C; &#xC870;&#xBA85;, &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC0F; &#xB77C;&#xC778; &#xCE74;&#xBA54;&#xB77C; &#xD310;&#xB3C5;&#xC758; &#xB3D9;&#xAE30;&#xD654; &#xAC19;&#xC740; &#xC0D8;&#xD50C; &#xC601;&#xC5ED;&#xC744; &#xB2E4;&#xB8E8;&#xB294; &#xB450; quasi-simultaneously &#xAE30;&#xB85D; &#xB41C; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0;&#xB97C; &#xC5BB;&#xC744;. &#xD68C;&#xC808; &#xC81C;&#xD55C; &#xB41C; &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xC57D; 10&#xB85C; &#xD3EC;&#xC778;&#xD2B8; &#xB77C;&#xC774;&#xD2B8; &#xC18C;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB192;&#xC740; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; &#xC815;&#xBC00; nm 100 nm &#xD615;&#xAD11; &#xB77C;&#xD14D;&#xC2A4; &#xAD6C;&#xC2AC; &#xC6C0;&#xC9C1;&#xC77C; &#xC218; &#xAC80;&#xC0C9; &#xD558; &#xC5EC; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD588;&#xB2E4;. Ultra-sensitivity &#xC561;&#xCCB4; &#xC9C0;&#xC9C8; bilayer diffusing &#xB2E8;&#xC77C; &#xD615;&#xAD11; streptavidin &#xBD84;&#xC790; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC785;&#xC99D; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. 2 &#xC0C9; streptavidin cy3&#xC640; Cy5 &#xB808;&#xC774;&#xBE14;&#xC774; &#xB450; &#xAC01;&#xAC01; &#xC5EC;&#xAE30; &#xCC44;&#xB110;;&#xC5D0; &#xC27D;&#xAC8C; &#xD655;&#xC778; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5FC;&#xB8CC; &#xC704;&#xCE58; &#xB192;&#xC740; &#xB530;&#xB77C; &#xC6C0;&#xC9C1;&#xC774;&#xB294; &#xBB3C;&#xCCB4;&#xC758; colocalization &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC801;&#xC6A9; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC744; &#xD655;&#xC778;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xD070; &#xC778;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xD56D; &#xCCB4; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC14;&#xC774;&#xC624; &#xC751;&#xC6A9;&#xC744; &#xC704;&#xD55C;&#xC774; &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xD0C0;&#xB2F9;&#xC131;&#xC744; &#xC124;&#xBA85;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Quasi-simultaneous &#xBA40;&#xD2F0; &#xCEEC;&#xB7EC; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xAC80;&#xCD9C;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xBC14;&#xC774;&#xC624; &#xCE69; &#xB9AC;&#xB354; &#xC5EC;&#xAE30; &#xAD6C;&#xC131;&#xD45C;&#xB97C; &#xBC88;&#xAC08;&#xC544;&#xC758; &#xAD6C;&#xD604;.

Se presenta aqu&#xED; el desarrollo de un dispositivo para la lectura biochip sola mol&#xE9;cula utilizando excitaci&#xF3;n r&#xE1;pida alternancia. La tecnolog&#xED;a se extiende a la citometr&#xED;a de imagen est&#xE1;ndar, ofreciendo canales adicionales de color en la excitaci&#xF3;n. Para permitir que el estudio de los objetos m&#xF3;viles, por ejemplo, ves&#xED;culas activamente transportados en las c&#xE9;lulas vivas o l&#xED;pidos libremente difusoras en una bicapa lip&#xED;dica, la frecuencia de los impulsos de iluminaci&#xF3;n fue elegida lo suficientemente alta como para congelar pr&#xE1;cticamente el movimiento de las biomol&#xE9;culas, a medida que se desplaza a trav&#xE9;s del sistema de iluminaci&#xF3;n &#xE1;rea. La sincronizaci&#xF3;n de la muestra de lectura de la iluminaci&#xF3;n, la exploraci&#xF3;n y la l&#xED;nea de c&#xE1;maras-producir dos im&#xE1;genes casi simult&#xE1;neamente grabados que cubren la regi&#xF3;n misma muestra. Difracci&#xF3;n limitada resoluci&#xF3;n y precisi&#xF3;n de localizaci&#xF3;n de alta para el punto de fuentes de luz hasta aproximadamente 10 nm ha demostrado mediante el an&#xE1;lisis de fluorescencia de 100 nm inmovilizados bolas de l&#xE1;tex. Ultra-sensibilidad se ha demostrado por im&#xE1;genes individuales mol&#xE9;culas de estreptavidina fluorescentes difunden en una bicapa lip&#xED;dica fluida. En dos colores con estreptavidina marcada con Cy3 y Cy5 puede ser f&#xE1;cilmente identificado en los dos canales de excitaci&#xF3;n respectivas conforme lo alto de las posiciones de tinte confirma la aplicabilidad de los estudios de colocalizaci&#xF3;n de objetos en movimiento. Por &#xFA;ltimo, los an&#xE1;lisis de las interacciones de los receptores de anticuerpos en grandes poblaciones de c&#xE9;lulas vivas ilustrar la viabilidad de este m&#xE9;todo para la aplicaci&#xF3;n de biochips.

La aplicaci&#xF3;n de esquemas de alternancia de excitaci&#xF3;n de un biochip para el lector de cuasi-simult&#xE1;nea multi-color de una sola mol&#xE9;cula de detecci&#xF3;n

&#x6211;&#x4EEC;&#x63D0;&#x51FA;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6765;&#x786E;&#x5B9A;&#x548C;&#x8FA8;&#x522B;&#x8367;&#x5149;&#x6807;&#x8BB0;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28; (&#39;&#x730E;&#x7269;&#39;) &#x548C;&#x6D3B;&#x7684;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5185;&#x7684;&#x819C;&#x86CB;&#x767D; (&#x8BF1;&#x9975;&#xFF09; &#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x4EA4;&#x4E92;&#x3002;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x662F; micropatterned &#x8868;&#x9762;&#x6297;&#x4F53;&#x7684;&#x8BF1;&#x9975;&#x80DE;&#x5B98;&#x80FD;&#x4E0A;&#x9540;&#x91D1;&#x7684;&#x3002;&#x8BF1;&#x9975;&#x6355;&#x98DF;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x88AB;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x901A;&#x8FC7;&#x8367;&#x5149;&#x730E;&#x7269;&#x7684;&#x91CD;&#x65B0;&#x5206;&#x914D;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4F7F;&#x7528;&#x8BE5;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6765;&#x63CF;&#x8FF0;&#x4EBA;&#x7C7B; CD4&#xFF0C;&#x6FC0;&#x6D3B; T &#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;&#x5728;&#x4E3B;&#x8981;&#x7684; co-receptor &#x548C;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x8354;&#x679D;&#xFF0C;&#x86CB;&#x767D;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6FC0;&#x9176;&#x65E9;&#x671F; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x7684;&#x5FC5;&#x8981;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x901A;&#x8FC7;&#x91CF;&#x5316;&#x8354;&#x679D;&#x91CD;&#x65B0;&#x5206;&#x914D;&#x7ED9; CD4 &#x611F;&#x5149;&#x6027;&#x8861;&#x91CF;&#x5E73;&#x8861;&#x534F;&#x4F1A;&#x548C;&#x6F02;&#x767D;&#x8BD5;&#x9A8C;&#x53CA;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x6210;&#x50CF;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x7814;&#x7A76;&#x3002;&#x9664;&#x4E86;&#x5DF2;&#x77E5;&#x7684;&#x950C;&#x6263;&#x7ED3;&#x6784;&#xFF0C;&#x8354;&#x679D;&#x819C;&#x951A;&#x7279;&#x522B;&#x662F;&#x5BF9;&#x4E3B;&#x8981;&#x5F71;&#x54CD;&#x8354;&#x679D; CD4 &#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF0C;&#x8C03;&#x89E3;&#x76F4;&#x63A5;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x548C;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x7A33;&#x5B9A;&#x5176;&#x4ED6;&#x8354;&#x679D;&#x57DF;&#x7684;&#x4EA4;&#x4E92;&#x3002;&#x603B;&#x5171;&#x819C;&#x7887;&#x6CCA;&#x5904;&#x589E;&#x52A0;&#x4E92;&#x52A8;&#x751F;&#x5B58;&#x671F;&#x7531;&#x4E24;&#x4E2A;&#x6570;&#x91CF;&#x7EA7;&#x3002;

Micropatterning &#x5728;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;-&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x3002;

We present a method to identify and characterize interactions between a fluorophore-labeled protein ('prey') and a membrane protein ('bait') in live mammalian cells. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies to the bait extracellular domain. Bait-prey interactions are assayed through the redistribution of the fluorescent prey. We used the method to characterize the interaction between human CD4, the major co-receptor in T-cell activation, and human Lck, the protein tyrosine kinase essential for early T-cell signaling. We measured equilibrium associations by quantifying Lck redistribution to CD4 micropatterns and studied interaction dynamics by photobleaching experiments and single-molecule imaging. In addition to the known zinc clasp structure, the Lck membrane anchor in particular had a major impact on the Lck-CD4 interaction, mediating direct binding and further stabilizing the interaction of other Lck domains. In total, membrane anchorage increased the interaction lifetime by two orders of magnitude.

Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells.

Nous pr&#xE9;sentons une m&#xE9;thode pour identifier et caract&#xE9;riser les interactions entre une prot&#xE9;ine fluorophore marqu&#xE9; (&#xAB;proie&#xBB;) et une prot&#xE9;ine de la membrane (&#xAB;l&#x26;#39;app&#xE2;t&#xBB;) dans les cellules vivantes de mammif&#xE8;res. Les cellules sont &#xE9;tal&#xE9;es sur des surfaces fonctionnalis&#xE9;es micro&#xE9;lectrodes avec des anticorps &#xE0; domaine extracellulaire d&#x26;#39;app&#xE2;t. Bait-proies interactions sont dos&#xE9;s par la redistribution de la proie fluorescente. Nous avons utilis&#xE9; la m&#xE9;thode pour caract&#xE9;riser l&#x26;#39;interaction entre le CD4 humain, les principaux co-r&#xE9;cepteur dans activation des lymphocytes T, et l&#x26;#39;homme LCK, la prot&#xE9;ine tyrosine kinase essentielle pour le d&#xE9;but de signalisation des cellules T. Nous avons mesur&#xE9; les associations d&#x26;#39;&#xE9;quilibre en quantifiant Lck redistribution &#xE0; micropatterns CD4 et ont &#xE9;tudi&#xE9; la dynamique d&#x26;#39;interaction par photoblanchiment exp&#xE9;riences et une seule mol&#xE9;cule d&#x26;#39;imagerie. En plus de la structure fermoir de zinc connus, l&#x26;#39;ancrage de la membrane Lck en particulier ont eu un impact majeur sur l&#x26;#39;interaction Lck-CD4, la m&#xE9;diation directe liant les parties et la stabilisation de l&#x26;#39;interaction d&#x26;#39;autres domaines Lck. Au total, la membrane d&#x26;#39;ancrage augment&#xE9; la dur&#xE9;e de vie d&#x26;#39;interaction de deux ordres de grandeur.

Micromodelage pour l&#x26;#39;analyse quantitative des interactions prot&#xE9;ine-prot&#xE9;ine dans les cellules vivantes

Wir stellen eine Methode zur Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionen zwischen einem Fluorophore beschriftet Protein (&#39;Beute&#39;) und einem Membranprotein (&#39;K&ouml;der&#39;) in lebenden S&auml;ugetier-Zellen. Zellen sind auf Micropatterned Oberfl&auml;chen, die Antik&ouml;rper gegen die K&ouml;der extrazellul&auml;ren funktionalisierten beschichtet. K&ouml;der-Beute Interaktionen werden durch die Umverteilung der fluoreszierenden Beute normalisiert. Wir verwendet die Methode, um die Interaktion zwischen menschlichen CD4, die gro&szlig;en Co-receptor in T-Zell-Aktivierung und menschlichen Lck, notwendig f&uuml;r die fr&uuml;hen T-Zell-Signalisierung Proteintyrosinkinase zu charakterisieren. Wir Ma&szlig;en Gleichgewicht Verb&auml;nde durch Quantifizierung Lck Umverteilung zu CD4-Micropatterns und studierte Interaktion Dynamik durch Photobleichung Experimente und Einzelmolek&uuml;l-Bildgebung. Neben der bekannten Zink-Verschluss-Struktur hatte der Lck-Membran-Anker insbesondere einen wichtigen Einfluss auf die Lck-CD4-Interaktion, Vermittlung, direkte Bindung und die Interaktion anderer Lck-Dom&auml;nen weiter zu stabilisieren. Insgesamt stieg das Membran Ankerplatz die Interaktion-Lebensdauer von zwei Gr&ouml;&szlig;enordnungen.

Micropatterning f&uuml;r die Quantitative Analyse von Protein-Protein Interaktionen in lebenden Zellen.

Vi presentiamo un metodo per identificare e caratterizzare le interazioni tra una proteina fluoroforo (&#39;preda&#39;) e una proteina di membrana (&#39;esca&#39;) in cellule di mammifero dal vivo. Le cellule sono placcate su superfici micropatterned funzionalizzate con anticorpi contro il dominio extracellulare di esca. Esca-preda interazioni sono analizzate attraverso la ridistribuzione della preda fluorescente. Abbiamo utilizzato il metodo per caratterizzare l&#39;interazione tra umani CD4, il ricettore pi&ugrave; importanti nell&#39;attivazione delle cellule T e umano Lck, la chinasi della tirosina della proteina essenziale per la segnalazione precoce T-cellulare. Abbiamo misurato le associazioni equilibrio da quantificare Lck ridistribuzione di CD4 microdisegni e studiato la dinamica di interazione di singola molecola imaging e photobleaching esperimenti. Oltre la struttura di chiusura conosciuto zinco, l&#39;ancoraggio della membrana Lck in particolare ha avuto un impatto importante sull&#39;interazione Lck-CD4, mediando il binding diretto e stabilizzare ulteriormente l&#39;interazione di altri domini Lck. In totale, ancoraggio della membrana aumentata la durata dell&#39;interazione di due ordini di grandezza.

Micropatterning per l&#39;analisi quantitativa delle interazioni della proteina-proteina in cellule viventi.

&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08; &#x26;#39;&#x7372;&#x7269;&#x26;#39;&#xFF09;&#x3001;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x3001;&#x54FA;&#x4E73;&#x52D5;&#x7269;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08; &#x26;#39;&#x990C;&#x26;#39;&#xFF09;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3057;&#x3001;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x63D0;&#x793A;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x7D30;&#x80DE;&#x306F;&#x3001;&#x990C;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x6297;&#x4F53;&#x3067;&#x5B98;&#x80FD;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x8868;&#x9762;&#x4E0A;&#x306B;&#x30E1;&#x30C3;&#x30AD;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x990C; - &#x6355;&#x98DF;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306F;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x7372;&#x7269;&#x306E;&#x518D;&#x5206;&#x914D;&#x3092;&#x901A;&#x3057;&#x3066;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30D2;&#x30C8;CD4 T&#x7D30;&#x80DE;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30B3;&#x30EC;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x30E1;&#x30B8;&#x30E3;&#x30FC;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;Lck&#x304C;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x3001;&#x521D;&#x671F;&#x306E;T&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x306B;&#x5FC5;&#x9808;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;CD4&#x306E;&#x5FAE;&#x7D30;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x3078;&#x306E;&#x518D;&#x5206;&#x914D;Lck&#x3092;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5747;&#x8861;&#x306E;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3092;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3057;&#x3001;&#x5B9F;&#x9A13;&#x3068;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x5149;&#x9000;&#x8272;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x3092;&#x8ABF;&#x3079;&#x305F;&#x3002;&#x65E2;&#x77E5;&#x306E;&#x4E9C;&#x925B;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30D7;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x306B;&#x52A0;&#x3048;&#x3066;&#x3001;&#x7279;&#x306B;&#x819C;&#x30A2;&#x30F3;&#x30AB;&#x30FC;Lck&#x304C;&#x76F4;&#x63A5;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x3001;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;Lck&#x306E;&#x4ED6;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x3092;&#x5A92;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B;&#x3001;Lck&#x304C;-CD4&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306B;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x305F;&#x3002;&#x5408;&#x8A08;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x819C;&#x306E;&#x505C;&#x6CCA;&#x306F;2&#x6841;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x5BFF;&#x547D;&#x3092;&#x5897;&#x52A0;&#x3055;&#x305B;&#x305F;&#x3002;

&#x751F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; - &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;

&#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558; &#xACE0; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; fluorophore &#xB77C;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (&#39;&#xBA39;&#xC774;&#39;)&#xC640; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (&#39;&#xBBF8;&#xB07C;&#39;) &#xAC04;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC18C;&#xAC1C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC140; &#xBBF8;&#xB07C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xD56D; &#xCCB4;&#xC640; functionalized micropatterned &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0; &#xB3C4;&#xAE08; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBBF8;&#xB07C; &#xBA39;&#xC774; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD615;&#xAD11; &#xBA39;&#xC774;&#xC758; &#xC7AC;&#xBD84;&#xBC30;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xBD84;&#xC11D; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC778;&#xAC04;&#xC758; CD4, T &#xC138;&#xD3EC; &#xD65C;&#xC131;&#xD654;&#xC758; &#xC8FC;&#xC694; co-receptor &#xC778;&#xAC04;&#xC758; Lck, &#xCD08;&#xAE30; T &#xC138;&#xD3EC; &#xC2DC;&#xADF8;&#xB110;&#xB9C1;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; tyrosine kinase&#xC758; &#xC0C1;&#xD638;&#xC791;&#xC6A9; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; Lck &#xC7AC;&#xBC30;&#xD3EC; CD4 micropatterns &#xCE21;&#xC815; &#xD558; &#xC5EC; &#xD3C9;&#xD615; &#xB2E8;&#xCCB4;&#xB97C; &#xCE21;&#xC815; &#xD558; &#xACE0; photobleaching &#xC2E4;&#xD5D8; &#xBC0F; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xD558; &#xC5EC; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xC5ED;&#xD559;&#xC744; &#xACF5;&#xBD80; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4;&#xB41C; &#xC544;&#xC5F0; &#xAC78;&#xC1E0; &#xAD6C;&#xC870; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; Lck &#xB9C9; &#xC575;&#xCEE4; &#xD2B9;&#xD788; &#xC9C1;&#xC811; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xBC0F; &#xCD94;&#xAC00; &#xB2E4;&#xB978; Lck &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xC548;&#xC815; &#xC2DC;&#xD0A4;&#xB294; &#xC911;&#xC7AC; Lck CD4 &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xD070; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC8FC;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xCD1D;, &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xC575;&#xCEE4;&#xB9AC;&#xC9C0; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xC218;&#xBA85; &#xB450; &#xBC30;&#xB098; &#xC99D;&#xAC00;.

&#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xC815;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; Micropatterning.

Se presenta un m&#xE9;todo para identificar y caracterizar las interacciones entre una prote&#xED;na marcada con fluor&#xF3;foro (&#x26;quot;presa&#x26;quot;) y una prote&#xED;na de membrana (&#xAB;cebo&#xBB;) en c&#xE9;lulas de mam&#xED;feros vivos. Las c&#xE9;lulas se cultivaron sobre superficies micropatterned funcionalizados con anticuerpos contra el dominio extracelular de cebo. Bait-presa se analizan las interacciones a trav&#xE9;s de la redistribuci&#xF3;n de la presa fluorescente. Se us&#xF3; el m&#xE9;todo para caracterizar la interacci&#xF3;n entre los linfocitos CD4 humanos, los principales co-receptor de activaci&#xF3;n de c&#xE9;lulas T, y Lck humana, la prote&#xED;na tirosina quinasa esencial para principios de c&#xE9;lulas T de se&#xF1;alizaci&#xF3;n. Medimos las asociaciones de equilibrio mediante la cuantificaci&#xF3;n de la redistribuci&#xF3;n de Lck micropatrones CD4 y estudi&#xF3; la din&#xE1;mica de interacci&#xF3;n por photobleaching experimentos y las im&#xE1;genes de una sola mol&#xE9;cula. Adem&#xE1;s de la estructura de zinc broche conocido, el anclaje de membrana Lck en particular ten&#xED;a un impacto importante en la interacci&#xF3;n Lck-CD4, mediando la uni&#xF3;n directa y a&#xFA;n m&#xE1;s la estabilizaci&#xF3;n de la interacci&#xF3;n de otro Lck dominios. En total, la membrana de anclaje aumentado el tiempo de vida por la interacci&#xF3;n de dos &#xF3;rdenes de magnitud.

Micropatterning para el an&#xE1;lisis cuantitativo de las interacciones prote&#xED;na-prote&#xED;na en las c&#xE9;lulas vivas

&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x540C;&#x65F6;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x5438;&#x6536;&#x5076;&#x6781;&#x5B50;&#x7684;&#x8868;&#x5F81;&#x4E0E;&#x8BC6;&#x522B;&#x5927;&#x66F2;&#x9762;&#x4E0A;&#x7684;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x6570;&#x636E;&#x91C7;&#x96C6;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x53D1;&#x5C55;&#x3002;&#x8BE5;&#x65B9;&#x6CD5;&#x57FA;&#x4E8E;&#x82AF;&#x7247;&#x8BFB;&#x51FA;&#x5728;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x654F;&#x611F;&#x6027; &#xFF08;&#x9ED1;&#x68EE;&#x3001; J.&#xFF1B; &#x524D;&#x9762;&#x6240;&#x8FF0;&#x7684;&#x88C5;&#x7F6E;Sonnleitner&#x3001; M&#x3002;;Sonnleitner&#xFF0C;A.&#xFF1B;Freudenthaler&#xFF0C;G.;&#x4E9A;&#x5BDF;&#x514B;&#xFF0C;J.;H&ouml;glinger&#xFF0C;O.;&#x8FC5;&#x8FBE;&#xFF0C;H.&#xFF1B;Sch&uuml;tz G.J.&#x809B;&#x95E8;&#x3002;&#x5316;&#x5B66; 2004 &#x5E74; 76&#xFF0C;5960 5964)&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x4E86;&#x5F02;&#x6B65;&#x65F6;&#x95F4;&#x5EF6;&#x8FDF;&#x548C;&#x96C6;&#x6210;-&#xFF08;TDI&#xFF09; &#x6A21;&#x5F0F;&#x6210;&#x50CF;&#x8FD8;&#x8BB0;&#x5F55;&#x8367;&#x5149;&#x4FE1;&#x53F7;&#x7684;&#x65F6;&#x95F4;&#x8FDB;&#x7A0B;&#xFF1A; &#x56FE;&#x50CF;&#x56E0;&#x6B64;&#x5305;&#x542B;&#x7A7A;&#x95F4;&#x548C;&#x65F6;&#x95F4;&#x7684;&#x4FE1;&#x606F;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BC1;&#x660E;&#x539F;&#x5219;&#x901A;&#x8FC7;&#x8C03;&#x8282;&#x7684;&#x4FE1;&#x53F7;&#x901A;&#x8FC7;&#x65CB;&#x8F6C;&#x52B1;&#x78C1;&#x4E24;&#x6781;&#x5206;&#x5316;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x5141;&#x8BB8;&#x6B67;&#x89C6;&#x9759;&#x6001;&#x5438;&#x9644;&#x5076;&#x6781;&#x5B50;&#x5BF9;&#x591A;&#x6216;&#x81EA;&#x7531;&#x65CB;&#x8F6C;&#x5355;&#x4E2A;&#x5438;&#x6536;&#x5076;&#x6781;&#x5B50;&#x3002;BSA &#x643A;&#x5E26;&#x4E0D;&#x540C;&#x6570;&#x91CF;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x8BC1;&#x660E;&#x8BE5;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x53EF;&#x884C;&#x6027;&#x3002;&#x86CB;&#x767D;&#x7269;&#x79CD;&#x8D34;&#x6807; 0.55 &#x548C; 2.89 &#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;&#x6BCF;&#x5EA6;&#x5E73;&#x5747;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5F88;&#x5BB9;&#x6613;&#x533A;&#x5206;&#x3002;

&#x4F7F;&#x7528;&#x504F;&#x632F;&#x8C03;&#x5236;&#x5F02;&#x6B65;&#x65F6;&#x95F4;&#x5EF6;&#x8FDF;&#x548C;&#x96C6;&#x6210;&#x6A21;&#x5F0F;&#x626B;&#x63CF;&#x4E0D;&#x52A8;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x7684;&#x6807;&#x8BC6;&#x3002;

We report the development of a data acquisition method for identifying single molecules on large surfaces with simultaneous characterization of their absorption dipole. The method is based on a previously described device for microarray readout at single molecule sensitivity (Hesse, J.; Sonnleitner, M.; Sonnleitner, A.; Freudenthaler, G.; Jacak, J.; HÃ¶glinger, O.; Schindler, H.; SchÃ¼tz, G. J. Anal. Chem. 2004, 76, 5960-5964). Here, we introduced asynchronous time delay and integration- (TDI-) mode imaging to record also the time course of fluorescence signals: the images thus contain both spatial and temporal information. We demonstrate the principle by modulating the signals via rotating excitation polarization, which allows for discriminating static absorption dipoles against multiple or freely rotating single absorption dipoles. Experiments on BSA carrying different numbers of fluorophores demonstrate the feasibility of the method. Protein species with an average labeling degree of 0.55 and 2.89 fluorophores per protein can be readily distinguished.

Identification of immobile single molecules using polarization-modulated asynchronous time delay and integration-mode scanning.

On signaler l&#x26;#39;apparition d&#x26;#39;un proc&#xE9;d&#xE9; d&#x26;#39;acquisition de donn&#xE9;es d&#x26;#39;identification de mol&#xE9;cules simples sur de grandes surfaces avec la caract&#xE9;risation simultan&#xE9;e de leur absorption dip&#xF4;le. La m&#xE9;thode est bas&#xE9;e sur un dispositif pr&#xE9;c&#xE9;demment d&#xE9;crit pour la lecture puces &#xE0; la sensibilit&#xE9; seule mol&#xE9;cule (Hesse, J.; Sonnleitner, M.; Sonnleitner, A.; Freudenthaler, G.; Jacak, J.; H&#xF6;glinger, O.; Schindler, H .; Sch&#xFC;tz, GJ Anal Chem 2004, 76, 5960-5964)... Ici, nous avons introduit retard temporel asynchrone et l&#x26;#39;int&#xE9;gration d&#x26;#39;imagerie de mode (TDI) &#xE0; enregistrer aussi le cours du temps des signaux de fluorescence: les images contiennent de l&#x26;#39;information &#xE0; la fois spatiale et temporelle. Nous d&#xE9;montrons le principe par la modulation des signaux via la polarisation d&#x26;#39;excitation rotation, ce qui permet de distinguer des dip&#xF4;les d&#x26;#39;absorption statiques contre les multiples ou tournant librement dip&#xF4;les d&#x26;#39;absorption simples. Les exp&#xE9;riences sur les BSA transportant des nombres diff&#xE9;rents de fluorophores d&#xE9;montrer la faisabilit&#xE9; de la m&#xE9;thode. Esp&#xE8;ces de prot&#xE9;ines avec un degr&#xE9; d&#x26;#39;&#xE9;tiquetage moyenne de 0,55 et 2,89 fluorophores par des prot&#xE9;ines peuvent &#xEA;tre facilement distingu&#xE9;s.

Identification des mol&#xE9;cules simples immobiles en utilisant la polarisation modul&#xE9;e Time Delay asynchrone et de l&#x26;#39;int&#xE9;gration en mode balayage

Wir berichten &uuml;ber die Entwicklung einer Daten-&Uuml;bernahme-Methode zur Identifizierung einzelner Molek&uuml;le auf gro&szlig;en Fl&auml;chen mit gleichzeitiger Charakterisierung ihrer Resorption Dipols. Die Methode basiert auf einem zuvor beschriebenen Ger&auml;t f&uuml;r Microarray Ablesung bei Einzelmolek&uuml;l-Empfindlichkeit (Hessen, J.; Sonnleitner, M.; Sonnleitner, A.; Freudenthaler, G.; Jacak, J.; H&ouml;glinger, o.; Schindler, H.; Sch&uuml;tz, G. J. Anal. Chem. 2004, 76, 5960-5964). Hier wir eingef&uuml;hrt, asynchrone Zeitverz&ouml;gerung und Integration-(TDI-) Modus imaging um auch den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenzsignale aufzeichnen: die Bilder also sowohl r&auml;umliche und zeitliche Informationen enthalten. Wir zeigen das Prinzip durch Modulation der Signale &uuml;ber rotierende Erregung Polarisierung, wodurch diskriminieren statische Resorption Dipole gegen Multiple oder frei drehbare einzelne Resorption Dipole. Experimente an BSA tragen unterschiedliche Anzahlen von Fluorophore zeigen die Machbarkeit der Methode. Protein-Arten mit durchschnittlich 0,55 und 2,89 Fluorophore pro Protein beschriften k&ouml;nnen leicht unterschieden werden.

Kennung der immobile einzelner Molek&uuml;le mit Polarisations-modulierte asynchrone Zeitverz&ouml;gerung und Integration-Modus scannen.

Riportiamo lo sviluppo di un metodo di acquisizione dati per l&#39;identificazione di molecole singole su grandi superfici con simultanea caratterizzazione del dipolo loro assorbimento. Il metodo &egrave; basato su un dispositivo precedentemente descritto per la lettura di microarray a sensibilit&agrave; singola molecola (Hesse, J.; Sonnleitner, M.; Sonnleitner, A.; Freudenthaler, G.; Jacak, J.; Euler, O.; Schindler, H.; Sch&uuml;tz, G. J. Anal. Chem 2004, 76, 5960-5964). Qui, abbiamo introdotto ritardo asincrono e integrazione-(TDI-) modalit&agrave; imaging per registrare anche il corso di tempo dei segnali di fluorescenza: le immagini cos&igrave; contengono informazioni spaziali e temporali. Dimostriamo il principio modulando i segnali tramite rotazione di polarizzazione di eccitazione, che consente di discriminare dipoli statici assorbimento contro pi&ugrave; o liberamente ruotare dipoli assorbimento singolo. Esperimenti su BSA portando diversi numeri di fluorofori dimostrano la fattibilit&agrave; del metodo. Specie di proteine con una media di etichettatura grado di 0,55 e 2,89 fluorofori per proteina pu&ograve; essere prontamente distinto.

Identificazione di molecole singoli immobile utilizzando ritardo asincrono polarizzazione-modulato e integrazione-modalit&agrave; di scansione.

&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x306F;&#x3001;&#x53CC;&#x6975;&#x5B50;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5438;&#x53CE;&#x306E;&#x540C;&#x6642;&#x7279;&#x6027;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3067;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x8868;&#x9762;&#x4E0A;&#x306E;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x53CE;&#x96C6;&#x6CD5;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x5831;&#x544A;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x30BE;&#x30F3;&#x30E9;&#x30A4;&#x30C8;&#x30CA;&#x30FC;&#x3001;M.;&#x30BE;&#x30F3;&#x30E9;&#x30A4;&#x30C8;&#x30CA;&#x30FC;&#x3001;A.; Freudenthaler&#x3001;G.; Jacak&#x3001;J.;H&#xF6;glinger&#x3001;O.&#x3001;&#x30B7;&#x30F3;&#x30C9;&#x30E9;&#x30FC;&#x3001;H&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x611F;&#x5EA6;&#xFF08;&#x30D8;&#x30C3;&#x30BB;&#x3001;J.&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30A2;&#x30EC;&#x30A4;&#x8AAD;&#x307F;&#x51FA;&#x3057;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x524D;&#x8FF0;&#x3057;&#x305F;&#x30C7;&#x30D0;&#x30A4;&#x30B9;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30B7;&#x30E5;&#x30C3;&#x30C4;&#x3001;GJ&#x30A2;&#x30CA;&#x30EB;&#x5316;&#x5B66;2004&#x3001;76&#x3001;5960&#x304B;&#x3089;5964&#xFF09;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x306E;&#x6642;&#x9593;&#x7D4C;&#x904E;&#x3092;&#x8A18;&#x9332;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x975E;&#x540C;&#x671F;&#x306E;&#x9045;&#x5EF6;&#x6642;&#x9593;&#x3068;&#x306E;&#x7D71;&#x5408; - &#xFF08;TDI-&#xFF09;&#x30E2;&#x30FC;&#x30C9;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x5C0E;&#x5165;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#xFF1A;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x7A7A;&#x9593;&#x3068;&#x6642;&#x9593;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x60C5;&#x5831;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x8907;&#x6570;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x81EA;&#x7531;&#x306B;&#x56DE;&#x8EE2;&#x3055;&#x305B;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x5438;&#x53CE;&#x53CC;&#x6975;&#x5B50;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x5DEE;&#x5225;&#x9759;&#x7684;&#x5438;&#x53CE;&#x30C0;&#x30A4;&#x30DD;&#x30FC;&#x30EB;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x56DE;&#x8EE2;&#x52B1;&#x8D77;&#x306E;&#x5206;&#x6975;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x5909;&#x8ABF;&#x4FE1;&#x53F7;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x539F;&#x5247;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x86CD;&#x5149;&#x56E3;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x6570;&#x5B57;&#x3092;&#x904B;&#x3076;BSA&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306E;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3042;&#x305F;&#x308A;0.55 2.89&#x86CD;&#x5149;&#x4F53;&#x306E;&#x5E73;&#x5747;&#x7684;&#x306A;&#x30E9;&#x30D9;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x5EA6;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x7A2E;&#x306F;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x533A;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x504F;&#x5149;&#x5909;&#x8ABF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x975E;&#x540C;&#x671F;&#x9045;&#x5EF6;&#x6642;&#x9593;&#x3068;&#x7D71;&#x5408;&#x30E2;&#x30FC;&#x30C9;&#x306E;&#x30B9;&#x30AD;&#x30E3;&#x30F3;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x4E0D;&#x52D5;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x540C;&#x5B9A;

&#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xD761;&#xC218; &#xC30D; &#xADF9;&#xC758; &#xB3D9;&#xC2DC; &#xBB18;&#xC0AC;&#xC640; &#xB300;&#xD615; &#xD654;&#xBA74;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790;&#xB97C; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xC218;&#xC9D1; &#xBC29;&#xBC95; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;. &#xC55E;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC124;&#xBA85;&#xD55C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xAC10;&#xB3C4; (&#xD5E4;&#xC138;, J.;&#xC5D0; microarray &#xD310;&#xB3C5; &#xC7A5;&#xCE58;&#xB97C; &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC; Sonnleitner, M.; Sonnleitner, A.; Freudenthaler, G.; Jacak, &#xC81C;&#xC774;; H&ouml;glinger, O.; &#xC270;&#xB4E4;&#xB7EC;, &#xD5E4;; &#xC26C;&#xCE20;, G. J. &#xD56D;&#xBB38;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD654;&#xD559; 2004 &#xB144; 76, 5960-5964). &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0;&#xC11C;, &#xC6B0;&#xB9AC; &#xBE44;&#xB3D9;&#xAE30; &#xC2DC;&#xAC04; &#xC9C0;&#xC5F0; &#xBC0F; &#xD1B5;&#xD569;-(TDI-) &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xAE30;&#xB85D; &#xB610;&#xD55C; &#xD615;&#xAD11; &#xC2E0;&#xD638; &#xC2DC;&#xAC04; &#xACFC;&#xC815; &#xBAA8;&#xB4DC; &#xC18C;&#xAC1C;: &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0; &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; &#xACF5;&#xAC04; &#xBC0F; &#xC2DC;&#xAC04; &#xC815;&#xBCF4;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC5EC;&#xAE30; &#xC591;&#xADF9; &#xD654;, &#xC815;&#xC801; &#xD761;&#xC218; &#xC30D; &#xADF9; &#xC790; &#xB2E4;&#xC911;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCC28;&#xBCC4; &#xB610;&#xB294; &#xC790;&#xC720;&#xB86D;&#xAC8C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xD761;&#xC218; &#xC30D; &#xADF9; &#xC790; &#xD68C;&#xC804;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD5C8;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xD68C;&#xC804;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC2E0;&#xD638;&#xB97C; &#xBCC0;&#xC870; &#xD558; &#xC5EC; &#xC6D0;&#xCE59;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. BSA&#xB294; fluorophores&#xC758; &#xC11C;&#xB85C; &#xB2E4;&#xB978; &#xC22B;&#xC790;&#xB97C; &#xB4E4;&#xACE0;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xD0C0;&#xB2F9;&#xC131;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC885; &#xD3C9;&#xADE0; 0.55&#xC774; &#xACE0; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB2F9; 2.89 fluorophores &#xB77C;&#xBCA8;&#xC744; &#xC27D;&#xAC8C; &#xAD6C;&#xBD84;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC6C0;&#xC9C1;&#xC774;&#xAE30; &#xD798; &#xB4DC;&#xB294; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xD3B8;&#xAD11; &#xBCC0;&#xC870; &#xBE44;&#xB3D9;&#xAE30; &#xC2DC;&#xAC04; &#xC9C0;&#xC5F0; &#xBC0F; &#xD1B5;&#xD569; &#xBAA8;&#xB4DC; &#xAC80;&#xC0C9;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Se presenta el desarrollo de un m&#xE9;todo de adquisici&#xF3;n de datos para la identificaci&#xF3;n de mol&#xE9;culas individuales en superficies grandes con la caracterizaci&#xF3;n simult&#xE1;nea de su absorci&#xF3;n dipolo. El m&#xE9;todo se basa en un dispositivo anteriormente descrito para la lectura de microarrays en la sensibilidad sola mol&#xE9;cula (Hesse, J.; Sonnleitner, M.; Sonnleitner, A.; Freudenthaler, G.; Jacak, J.; H&#xF6;glinger, O.; Schindler, H .; Sch&#xFC;tz, GJ Anal Chem. 2004, 76, 5960 hasta 5964)... En este sentido, present&#xF3; retardo de tiempo as&#xED;ncrona y la integraci&#xF3;n (TDI) de im&#xE1;genes modo para grabar tambi&#xE9;n el curso temporal de las se&#xF1;ales de fluorescencia: las im&#xE1;genes de lo que contienen informaci&#xF3;n tanto espacial como temporal. Se demuestra el principio por la modulaci&#xF3;n de las se&#xF1;ales a trav&#xE9;s de la polarizaci&#xF3;n de excitaci&#xF3;n giratoria, que permite la discriminaci&#xF3;n de dipolos de absorci&#xF3;n est&#xE1;ticas contra dipolos absorci&#xF3;n m&#xFA;ltiples o individuales girar libremente. Los experimentos en BSA transportan diferentes n&#xFA;meros de fluor&#xF3;foros demostrar la viabilidad del m&#xE9;todo. Especies de prote&#xED;nas con un grado de etiquetado promedio de 0,55 y 2,89 por fluor&#xF3;foros prote&#xED;na se pueden distinguir f&#xE1;cilmente.

La identificaci&#xF3;n de las mol&#xE9;culas individuales inm&#xF3;viles utilizando la polarizaci&#xF3;n modulada retardo de tiempo as&#xED;ncrona y escaneo en modo de integraci&#xF3;n

&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7406;&#x89E3;&#x590D;&#x6742;&#x751F;&#x7269;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x57FA;&#x4E8E;&#x5E76;&#x884C;&#x5316;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x548C;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x9AD8;&#x8D28;&#x91CF;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7EC4;&#x5B66;&#x5DE5;&#x5177;&#x3002;&#x5F53;&#x524D;&#x7B5B;&#x9009;&#x5E73;&#x53F0;&#xFF0C;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x4F9D;&#x8D56;&#x4E8E;&#x6D4B;&#x91CF;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x800C;&#x662F;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x5448;&#x73B0;&#x7ED3;&#x679C;&#x96BE;&#x8D4B;&#x4E88;&#x7684;&#x4F53;&#x5185;&#x7684;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E2D;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5728;&#x6B64;&#x5904;&#x63CF;&#x8FF0;&#x7684;&#x8BBE;&#x8BA1;&#x548C;&#x5EFA;&#x8BBE;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x67E5;&#x660E;&#x548C;&#x91CF;&#x5316;&#x8367;&#x5149;&#x6807;&#x8BB0;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28; (&quot;&#x730E;&#x7269;&quot;) &#x548C;&#x5728;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684;&#x819C;&#x86CB;&#x767D; (&quot;&#x8BF1;&#x9975;&quot;&#xFF09; &#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x4EA4;&#x4E92;&#x7684;&#x8BE6;&#x7EC6;&#x7684;&#x534F;&#x8BAE;&#x3002;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x662F; micropatterned &#x8868;&#x9762;&#x6297;&#x4F53;&#x7684;&#x8BF1;&#x9975; exoplasmic &#x57DF;&#x5B98;&#x80FD;&#x4E0A;&#x9540;&#x91D1;&#x7684;&#x3002;&#x8BF1;&#x9975;&#x6355;&#x98DF;&#x7684;&#x4EA4;&#x4E92;&#x662F;&#x901A;&#x8FC7;&#x91CD;&#x65B0;&#x5206;&#x914D;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x730E;&#x7269;&#x7684;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x3002;&#x8BE5;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#x662F;&#x9AD8;&#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#x4E0B;&#x6C34;&#x5E73;&#x7684;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x68C0;&#x6D4B;&#x5F31;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x548C;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x5B83;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E00;&#x79CD;&#x7B5B;&#x67E5;&#x5DE5;&#x5177;&#x9002;&#x7528;&#x80FD;&#x529B;&#x3002;&#x6982;&#x5FF5;&#x8BC1;&#x660E;&#x88AB;&#x8BC1;&#x660E; CD4&#xFF0C;&#x4E3B;&#x8981;&#x7684; hiv &#x611F;&#x67D3;&#x6291;&#x5236; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x4FE1;&#x53F7;&#x3001; &#x4E2D;&#x548C;&#x8354;&#x679D;&#xFF0C;&#x57FA;&#x672C;&#x4E3A;&#x65E9;&#x671F; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6FC0;&#x9176;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

&#x5728;&#x901A;&#x8FC7;&#x91CF;&#x5316;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;-&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7684;&#x730E;&#x7269;&#x9975; micropatterning &#x540E;&#x7684;&#x518D;&#x5206;&#x914D;&#x3002;

Our understanding of complex biological systems is based on high-quality proteomics tools for the parallelized detection and quantification of protein interactions. Current screening platforms, however, rely on measuring protein interactions in rather artificial systems, rendering the results difficult to confer on the in vivo situation. We describe here a detailed protocol for the design and the construction of a system to detect and quantify interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in living cells. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies to the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput, making it applicable as a screening tool. The proof-of-concept is demonstrated for the interaction between CD4, a major coreceptor in T-cell signaling, and Lck, a protein tyrosine kinase essential for early T-cell signaling.

Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning.

Notre compr&#xE9;hension des syst&#xE8;mes biologiques complexes est bas&#xE9;e sur des outils prot&#xE9;omiques de haute qualit&#xE9; pour la d&#xE9;tection et la quantification des parall&#xE9;lis&#xE9; les interactions entre prot&#xE9;ines. Plates-formes de d&#xE9;pistage actuelles, toutefois, compter sur mesure les interactions entre prot&#xE9;ines dans des syst&#xE8;mes artificiels, plut&#xF4;t, ce qui rend les r&#xE9;sultats difficiles &#xE0; conf&#xE9;rer &#xE0; la situation in vivo. Nous d&#xE9;crivons ici un protocole d&#xE9;taill&#xE9; pour la conception et la construction d&#x26;#39;un syst&#xE8;me pour d&#xE9;tecter et quantifier les interactions entre une prot&#xE9;ine fluorophore marqu&#xE9; (&#xAB;proie&#xBB;) et une prot&#xE9;ine de la membrane (&#xAB;app&#xE2;t&#xBB;) dans les cellules vivantes. Les cellules sont &#xE9;tal&#xE9;es sur des surfaces fonctionnalis&#xE9;es micro&#xE9;lectrodes avec des anticorps &#xE0; domaine app&#xE2;ts exoplasmique. Bait-proies interactions sont analys&#xE9;s par le biais de la redistribution de la proie fluorescente. Le proc&#xE9;d&#xE9; est caract&#xE9;ris&#xE9; par une sensibilit&#xE9; &#xE9;lev&#xE9;e jusqu&#x26;#39;&#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;chelle de la mol&#xE9;cule, la capacit&#xE9; de d&#xE9;tecter les interactions faibles, et un d&#xE9;bit &#xE9;lev&#xE9;, ce qui rend applicable comme outil de d&#xE9;pistage. La preuve de concept est d&#xE9;montr&#xE9;e pour l&#x26;#39;interaction entre les cellules CD4, un cor&#xE9;cepteur majeur dans la signalisation cellulaire T-, et LCK, une prot&#xE9;ine tyrosine kinase essentielle pour les premiers T-cellules de signalisation.

D&#xE9;tection des interactions prot&#xE9;ine-prot&#xE9;ine dans la membrane plasmique de cellules vivantes en quantifiant redistribution Prey Sur micromodelage Bait

Unser Verst&auml;ndnis von komplexen biologischen Systemen basiert auf qualitativ hochwertigen Proteomics Werkzeuge f&uuml;r die parallelisierte Detektion und Quantifizierung von Protein-Interaktionen. Aktuelle Screening-Plattformen beruhen jedoch auf Messung von Protein-Interaktionen in eher k&uuml;nstlichen Systemen, Rendern der Ergebnisse schwierig, &uuml;ber die in-vivo Situation zu &uuml;bertragen. Wir beschreiben hier ein ausf&uuml;hrliches Protokoll f&uuml;r den Entwurf und den Bau eines Systems zu erkennen und zu quantifizieren Interaktionen zwischen einem Fluorophore beschriftet-Protein (&quot;Beute&quot;) und einem Membranprotein (&quot;K&ouml;der&quot;) in lebenden Zellen. Zellen sind auf Micropatterned Oberfl&auml;chen, die Antik&ouml;rper gegen die K&ouml;der Exoplasmic Dom&auml;ne funktionalisierten beschichtet. K&ouml;der-Beute-Interaktionen sind &uuml;ber die Neuverteilung der fluoreszierenden Beute normalisiert. Die Methode zeichnet sich durch hohe Empfindlichkeit bis auf die Ebene einzelner Molek&uuml;le, die F&auml;higkeit zum Erkennen von schwachen Wechselwirkungen und hohen Durchsatz, so dass es als ein Screening-Tool anwendbar. Die Proof-of-Concept zeigt sich f&uuml;r die Interaktion zwischen CD4, eine gro&szlig;e Coreceptor in T-Zelle signalisieren, und Lck, eine Proteintyrosinkinase notwendig f&uuml;r fr&uuml;hen T-Zell-Signalisierung.

Nachweis von Protein-Protein Interaktionen in der live Zellenplasmamembrane von Beute Umverteilung auf K&ouml;der Micropatterning zu quantifizieren.

La nostra comprensione dei sistemi biologici complessi &egrave; basato su strumenti di proteomica di alta qualit&agrave; per il rilevamento parallelizzata e quantificazione delle interazioni della proteina. Attuali piattaforme di screening, tuttavia, si basano su misura le interazioni della proteina nei sistemi piuttosto artificiali, rendendo i risultati difficili da conferire sulla situazione in vivo. Descriviamo qui un protocollo dettagliato per la progettazione e la costruzione di un sistema per rilevare e quantificare le interazioni tra una proteina fluoroforo (&quot;preda&quot;) e una proteina di membrana (&quot;esca&quot;) in cellule viventi. Le cellule sono placcate su superfici micropatterned funzionalizzate con anticorpi al dominio bait exoplasmic. Esca-preda interazioni sono analizzate tramite la ridistribuzione della preda fluorescente. Il metodo &egrave; caratterizzato da elevata sensibilit&agrave; fino a livello di singole molecole, la capacit&agrave; di rilevare le interazioni deboli e produttivit&agrave; elevata, rendendo applicabile come uno strumento di screening. Il proof-of-concept &egrave; dimostrata per l&#39;interazione tra CD4, un importante coreceptor nella segnalazione delle cellule T e Lck, una chinasi della tirosina della proteina essenziale per la segnalazione precoce T-cellulare.

Rilevamento delle interazioni della proteina-proteina nella membrana del plasma cellulare diretta da quantificando preda ridistribuzione su esca micropatterning.

&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x751F;&#x7269;&#x7CFB;&#x306E;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7406;&#x89E3;&#x306F;&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x4E26;&#x5217;&#x5316;&#x691C;&#x51FA;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x9AD8;&#x54C1;&#x8CEA;&#x306A;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30AA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x73FE;&#x5728;&#x306E;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#xB7;&#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x306F;&#x3001;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;in vivo&#x306E;&#x72B6;&#x6CC1;&#x3067;&#x306E;&#x5354;&#x8B70;&#x304C;&#x56F0;&#x96E3;&#x306A;&#x7D50;&#x679C;&#x3092;&#x30EC;&#x30F3;&#x30C0;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x7684;&#x306A;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3067;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x9593;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x30C7;&#x30B6;&#x30A4;&#x30F3;&#x3068;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08; &#x26;quot;&#x7372;&#x7269;&#x26;quot;&#xFF09;&#x3068;&#x3001;&#x751F;&#x304D;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08; &#x26;quot;&#x990C;&#x26;quot;&#xFF09;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x691C;&#x51FA;&#x3057;&#x3001;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3092;&#x69CB;&#x7BC9;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8A73;&#x7D30;&#x306A;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x3092;&#x8A18;&#x8FF0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7D30;&#x80DE;&#x306F;&#x990C;exoplasmic&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x6297;&#x4F53;&#x3067;&#x5B98;&#x80FD;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x8868;&#x9762;&#x4E0A;&#x306B;&#x30E1;&#x30C3;&#x30AD;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x990C; - &#x6355;&#x98DF;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306F;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x7372;&#x7269;&#x306E;&#x5206;&#x914D;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x5206;&#x6790;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306F;&#x3001;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x305D;&#x308C;&#x304C;&#x9069;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3001;&#x5F31;&#x3044;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x691C;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3001;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x306B;&#x81F3;&#x308B;&#x307E;&#x3067;&#x9AD8;&#x611F;&#x5EA6;&#x304C;&#x7279;&#x5FB4;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x6982;&#x5FF5;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x306F;&#x3001;CD4 T&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x306E;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x30B3;&#x30EC;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;Lck&#x304C;&#x3001;&#x521D;&#x671F;&#x306E;T&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x306B;&#x5FC5;&#x9808;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30D9;&#x30A4;&#x30C8;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x6642;&#x306B;&#x306F;&#x7372;&#x7269;&#x306E;&#x518D;&#x914D;&#x5E03;&#x3092;&#x5B9A;&#x91CF;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x751F;&#x7D30;&#x80DE;&#x5F62;&#x8CEA;&#x819C;&#x4E2D;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; - &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;

&#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xD559;&#xC801; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC774;&#xD574; &#xBCD1;&#xB82C;&#xD654; &#xD0D0;&#xC9C0; &#xBC0F; &#xC815;&#xB7C9;&#xD654; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xD488;&#xC9C8; proteomics &#xB3C4;&#xAD6C;&#xB97C; &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; &#xD604;&#xC7AC; &#xC0C1;&#xC601; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC;, &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xACB0;&#xACFC; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74; &#xC0C1;&#xD669;&#xC5D0; &#xBD80;&#xC5EC; &#xD558;&#xAE30; &#xC5B4;&#xB824;&#xC6B4; &#xB80C;&#xB354;&#xB9C1; &#xC624;&#xD788;&#xB824; &#xC778;&#xACF5; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0; &#xCE21;&#xC815;&#xC5D0; &#xC758;&#xC874;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xB514;&#xC790;&#xC778;&#xACFC; &#xAC10;&#xC9C0; &#xD558; &#xC5EC; fluorophore &#xB77C;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (&quot;&#xBA39;&#xC774;&quot;)&#xC640;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (&quot;&#xBBF8;&#xB07C;&quot;) &#xAC04;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xACC4;&#xB7C9; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC758; &#xAC74;&#xC124;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C1;&#xC138;&#xD55C; &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC140; &#xBBF8;&#xB07C; exoplasmic &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xD56D; &#xCCB4;&#xC640; functionalized micropatterned &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0; &#xB3C4;&#xAE08; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBBF8;&#xB07C; &#xBA39;&#xC774; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD615;&#xAD11; &#xBA39;&#xC774;&#xC758; &#xC7AC;&#xBD84;&#xBC30;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xBD84;&#xC11D; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB294; &#xC57D;&#xD55C; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xBC0F; &#xD574;&#xB2F9; &#xC2EC;&#xC0AC; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xB85C; &#xB9CC;&#xB4DC;&#xB294; &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9;&#xC744; &#xAC10;&#xC9C0; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC774; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xC218;&#xC900; &#xB192;&#xC740; &#xAC10;&#xB3C4; &#xC758;&#xD574; &#xD2B9;&#xC9D5;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. CD4, T-&#xC138;&#xD3EC; &#xC2E0;&#xD638;&#xC5D0; &#xC8FC;&#xC694; coreceptor Lck, &#xCD08;&#xAE30; T &#xC138;&#xD3EC; &#xC2DC;&#xADF8;&#xB110;&#xB9C1;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xD0A4; &#xAC04;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC1C;&#xB150; &#xC99D;&#xBA85;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xBBF8;&#xB07C; micropatterning &#xB530;&#xB77C; &#xBA39;&#xC774; &#xC7AC;&#xBC30;&#xD3EC;&#xB97C; &#xCE21;&#xC815; &#xD558; &#xC5EC; &#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC; &#xC6D0;&#xD615;&#xC9C8; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xAC80;&#xCD9C;.

Nuestra comprensi&#xF3;n de los complejos sistemas biol&#xF3;gicos se basa en herramientas de alta calidad prote&#xF3;mica para la detecci&#xF3;n y cuantificaci&#xF3;n paralelizado de las interacciones prote&#xED;na. Plataformas actuales de detecci&#xF3;n, sin embargo, se basan en la medici&#xF3;n de las interacciones de prote&#xED;nas en los sistemas artificiales en lugar, haciendo que los resultados son dif&#xED;ciles de atribuir a la situaci&#xF3;n in vivo. Se describe aqu&#xED; un protocolo detallado para el dise&#xF1;o y la construcci&#xF3;n de un sistema para detectar y cuantificar las interacciones entre una prote&#xED;na marcada con fluor&#xF3;foro (&#x26;quot;presa&#x26;quot;) y una prote&#xED;na de membrana (&#x26;quot;carnada&#x26;quot;) en las c&#xE9;lulas vivas. Las c&#xE9;lulas se cultivaron sobre superficies micropatterned funcionalizados con anticuerpos contra el dominio cebo exoplasmic. Bait-presa se analizan las interacciones a trav&#xE9;s de la redistribuci&#xF3;n de la presa fluorescente. El m&#xE9;todo se caracteriza por una alta sensibilidad al nivel de mol&#xE9;culas individuales, la capacidad de detectar interacciones d&#xE9;biles, y un alto rendimiento, por lo que es aplicable como una herramienta de detecci&#xF3;n. La prueba de concepto se demuestra la interacci&#xF3;n entre los linfocitos CD4, un correceptores importante en la se&#xF1;alizaci&#xF3;n de las c&#xE9;lulas T, y LCK, una prote&#xED;na tirosina quinasa esencial para primeros de c&#xE9;lulas T de se&#xF1;alizaci&#xF3;n.

La detecci&#xF3;n de interacciones prote&#xED;na-prote&#xED;na en la membrana de c&#xE9;lulas plasm&#xE1;ticas en vivo mediante la cuantificaci&#xF3;n de la redistribuci&#xF3;n presa en micropatterning Bait

Article	Year
Dynamic coupling of the putative coiled-coil domain of ORAI1 with STIM1 mediates ORAI1 channel activation. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 18187424	2008
Implementation of alternating excitation schemes in a biochip-reader for quasi-simultaneous multi-color single-molecule detection. Biosensors & bioelectronics\| PubMed ID: 18396033	2008
Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells. Nature methods\| PubMed ID: 18997782	2008
Identification of immobile single molecules using polarization-modulated asynchronous time delay and integration-mode scanning. Analytical chemistry\| PubMed ID: 20380382	2010
Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning. Methods in enzymology\| PubMed ID: 20580963	2010

Clemens Hesch

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