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Techniques for Imaging Ca<sup>2+</sup> Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

University of Birmingham

&#x808C;&#x817A;&#x662F;&#x7CBE;&#x5B50;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5185;&#x7684;&#x7535;&#x673A;&#x3002;&#x5728;&#x76EE;&#x524D;&#x7684;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x4E2D;&#x6211;&#x4EEC;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x4E2D;&#x7684;&#x7CBE;&#x5B50;&#xFF0C;&#x514D;&#x8D39;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x819C;&#xFF0C;&#x5728; normozoospermic &#x548C; asthenozoospermic &#x7684;&#x6350;&#x52A9;&#x8005; axoneme &#x5305;&#x542B;&#x5206;&#x6570;&#x7684;&#x808C;&#x817A;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;Axoneme &#x5305;&#x542B;&#x5206;&#x6570;&#x88AB;&#x9694;&#x79BB;&#x4ECE;&#x5065;&#x5EB7;&#x6350;&#x52A9;&#x8005;&#x4E0E; normozoospermia &#x6216;&#x5F31;&#x7CBE;&#x5B50;&#x75C7;&#x3001; &#x7CBE;&#x6DB2;&#x6837;&#x672C;&#xFF0C;&#x5982;&#x4F4E;&#x4E8E; 50%&#x7684;&#x7CBE;&#x5B50;&#x6D3B;&#x529B; (&#x8C01;&#x7B49;&#x7EA7; + b)&#x3002;&#x808C;-ATPase &#x6D3B;&#x6027;&#x6D4B;&#x5B9A;&#xFF0C;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#x3002;Axoneme &#x5305;&#x542B;&#x5206;&#x6570;&#x4E2D;&#x7684;&#x808C;&#x817A;&#x6D3B;&#x52A8;&#x88AB;&#x786E;&#x5B9A;&#x4E3A; Mg2 +-&#x4F9D;&#x8D56; ATPase &#x6D3B;&#x6027;&#x6291;&#x5236; 10 microM &#x9492;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x6291;&#x5236;&#x4F5C;&#x7528;&#x4E5F;&#x4E0D;&#x662F;&#x5F53;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x4E8B;&#x4E0E;&#x53BB;&#x7532;&#x80BE;&#x4E0A;&#x817A;&#x7D20; 1 &#x6BEB;&#x7C73;&#x3002;&#x808C;&#x817A;&#x6D3B;&#x52A8;&#x662F; Mg2 +-&#x4F9D;&#x8D56;&#xFF0C;&#x674E; +-&#x654F;&#x611F;&#x548C; 2 mM &#x54C7;&#x3001; oligomycin&#x3001; microM 1 &#x548C; 1 microM thapsigargin &#x4E0D;&#x533A;&#x5206;&#x5927;&#x5C0F;&#x5199;&#x3002;&#x808C;&#x817A;&#x6D3B;&#x52A8;&#x662F;&#x663E;&#x8457;&#x964D;&#x4F4E; (p &lt; 0.001) &#x4E3A; asthenozoospermic &#x4E0E; normozoospermic &#x6350;&#x52A9;&#x8005;&#x7684;&#x6350;&#x52A9;&#x8005;&#x3002;&#x8FD9;&#x662F;&#x4E00;&#x79CD;&#x7B80;&#x5355;&#x808C;&#x817A;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x53EF;&#x4EE5;&#x7528;&#x4E8E;&#x83B7;&#x53D6;&#x4E34;&#x5E8A;&#x6216;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x8BBE;&#x7F6E;&#x4E2D;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x611F;&#x5174;&#x8DA3;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x3002;

&#x808C; ATPase &#x6D3B;&#x6027;&#x7CBE;&#x5B50;&#x4E2D;&#x751F;&#x5316;&#x9274;&#x5B9A;&#x3002;

Dynein-ATPase is the intracellular motor for sperm motility. In the present work we assayed the dynein-ATPase activity in an axoneme-containing fraction of human sperm, free of plasma membranes, in normozoospermic and asthenozoospermic donors. Axoneme-containing fractions were isolated from semen samples obtained from healthy donors with either normozoospermia or asthenozoospermia, as indicated by a sperm motility lower than 50% (WHO grade a + b). The dynein-ATPase activity was assayed and partially characterized. The dynein-ATPase activity in the axoneme-containing fractions was identified as Mg2+-dependent ATPase activity inhibited by 10 microM vanadate. This inhibition was not seen when the assay was done in the presence of 1 mM norepinephrine. The dynein-ATPase activity is Mg2+-dependent, Li+-sensitive, and insensitive to 2 mM ouabain, 1 microM oligomycin, and 1 microM thapsigargin. The dynein-ATPase activity was significantly lower (p < 0.001) for asthenozoospermic donors as compared to normozoospermic donors. This is a straightforward dynein-ATPase assay that can be used to obtain data of functional interest in clinical or experimental settings.

Biochemical identification of dynein-ATPase activity in human sperm.

Dyn&eacute;ine-ATPase est le moteur intracellulaire de la motilit&eacute; des spermatozo&iuml;des. Dans ce travail nous analys&eacute; l&#39;activit&eacute; de dyn&eacute;ine-ATPase dans une fraction contenant de l&#39;axon&egrave;me du sperme humain, libre des membranes plasmiques, chez les donneurs de normozoospermic et asthenozoospermic. Les fractions contenant de l&#39;axon&egrave;me sont isol&eacute;es dans des &eacute;chantillons de sperme provenant de donneurs sains avec normozoospermie ou classique, comme en t&eacute;moigne une motilit&eacute; des spermatozo&iuml;des inf&eacute;rieure &agrave; 50 % (grade OMS a + b). L&#39;activit&eacute; de la dyn&eacute;ine-ATPase a &eacute;t&eacute; dos&eacute;e et partiellement caract&eacute;ris&eacute;e. L&#39;activit&eacute; de dyn&eacute;ine-ATPase dans les fractions contenant de l&#39;axon&egrave;me a &eacute;t&eacute; identifi&eacute;e comme Mg2 +-d&eacute;pendante activit&eacute; ATPasique inhib&eacute;e par 10 microM vanadate. Cette inhibition n&#39;&eacute;tait pas consid&eacute;r&eacute;e lors de l&#39;essai a &eacute;t&eacute; fait en pr&eacute;sence de nor&eacute;pin&eacute;phrine de 1 mM. L&#39;activit&eacute; de l&#39;ATPase dyn&eacute;ine est Mg2 +-d&eacute;pendante, Li +-sensible et insensible &agrave; l&#39;ouaba&iuml;ne 2 mM et 1 microM oligomycine 1 microM thapsigargine. L&#39;activit&eacute; de l&#39;ATPase dyn&eacute;ine est significativement inf&eacute;rieur (p &lt; 0,001) pour les donneurs d&#39;asthenozoospermic par rapport aux donateurs de normozoospermic. Il s&#39;agit d&#39;un dosage de dyn&eacute;ine-ATPase simple qui permet d&#39;obtenir des donn&eacute;es d&#39;int&eacute;r&ecirc;t fonctionnel dans les milieux cliniques ou exp&eacute;rimentales.

Identification biochimique de l&#39;activit&eacute; de la dyn&eacute;ine-ATPase dans le sperme humain.

Dynein-ATPase ist der intrazellul&auml;ren Motor f&uuml;r Spermien-Motilit&auml;t. In der vorliegenden Arbeit untersucht wir die Dynein-ATPase-Aktivit&auml;t in einem Axonem-haltigen Bruchteil der menschlichen Samenzellen, frei von Plasma-Membranen, in Normozoospermic und Asthenozoospermic Spender. Axonem-haltige Fraktionen wurden von Sperma Proben von gesunden Spendern mit Normozoospermia oder Asthenozoospermia, isoliert, wie durch eine Spermien-Motilit&auml;t, die weniger als 50 % (WHO Grad a + b). Die Dynein-ATPase-Aktivit&auml;t wurde gepr&uuml;ft und teilweise charakterisiert. Die Dynein-ATPase-Aktivit&auml;t im Axonem-haltigen Br&uuml;che wurde identifiziert als Mg2 +-abh&auml;ngigen ATPase-Aktivit&auml;t, die durch 10 MicroM Vanadate gehemmt. Diese Hemmung wurde nicht angezeigt, wenn die Probe in Anwesenheit von 1 mM Noradrenalin durchgef&uuml;hrt wurden. Die Dynein-ATPase-Aktivit&auml;t ist Mg2 +-abh&auml;ngigen, Li +-sensitive und unempfindlich gegen 2 mM Strophanthin, 1 MicroM Oligomycin und 1 MicroM Thapsigargin. Die Dynein-ATPase-Aktivit&auml;t war signifikant niedriger (p &lt; 0.001) f&uuml;r Asthenozoospermic Spender im Vergleich zu Normozoospermic Spender. Dies ist eine einfache Dynein-ATPase-Assay, die verwendet werden kann, um Daten der funktionalen an klinische oder experimentelle Einstellungen zu erhalten.

Biochemische Identifizierung der Dynein-ATPase-Aktivit&auml;t in menschlichen Samenzellen.

Dineina-ATPasi sono il motore intracellulare per la motilit&agrave; degli spermatozoi. Nel presente lavoro abbiamo analizzata l&#39;attivit&agrave; di dineina-ATPasi in una frazione contenente Assonema di sperma umano, privo di membrana plasmatica, in donatori di normozoospermic e asthenozoospermic. Assonema contenenti frazioni sono state isolate da campioni di sperma ottenuti da donatori sani con normozoospermia o astenospermia, come indicato da una motilit&agrave; spermatica inferiore al 50% (che di grado a + b). L&#39;attivit&agrave; di dineina-ATPasi &egrave; stato dosato e parzialmente caratterizzata. L&#39;attivit&agrave; di dineina-ATPasi nelle frazioni contenenti assonema &egrave; stato identificato come Mg2 +-dipendente attivit&agrave; ATPasi inibito da 10 microM vanadato. Questa inibizione non &egrave; stato visto quando il dosaggio &egrave; stato fatto in presenza di noradrenalina 1 mM. L&#39;attivit&agrave; di dineina-ATPasi &egrave; Mg2 +-dipendente, Li +-sensibili e insensibili alla ouabaina 2 mM, 1 microM oligomycin e 1 microM thapsigargin. L&#39;attivit&agrave; dell&#39;ATPasi dineina era significativamente inferiore (p &lt; 0,001) per i donatori di asthenozoospermic rispetto ai normozoospermic donatori. Questo &egrave; un test semplice dineina-ATPasi che pu&ograve; essere utilizzato per ottenere dati di interesse funzionale in contesti clinici o sperimentali.

Identificazione biochimica dell&#39;attivit&agrave; dell&#39;ATPasi dineina in sperma umano.

&#x30C0;&#x30A4;&#x30CB;&#x30F3; ATPase &#x306E;&#x7CBE;&#x5B50;&#x904B;&#x52D5;&#x6027;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x97AD;&#x6BDB;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x306E;&#x5206;&#x6570;&#x306E;&#x3072;&#x3068;&#x7CBE;&#x5B50;&#x3001;&#x30D7;&#x30E9;&#x30BA;&#x30DE;&#x819C;&#x30FB; asthenozoospermic &#x30C9;&#x30CA;&#x30FC;&#x306E;&#x7121;&#x6599;&#x306E;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CB;&#x30F3; ATPase &#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x8A66;&#x91D1;&#x3002;&#x97AD;&#x6BDB;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x753B;&#x5206;&#x306F; 50 &#xFF05; &#x3088;&#x308A;&#x306F;&#x4F4E;&#x3044;&#x7CBE;&#x5B50;&#x904B;&#x52D5;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3001;normozoospermia &#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x7121;&#x529B;&#x3068;&#x5065;&#x5EB7;&#x306A;&#x30C9;&#x30CA;&#x30FC;&#x304B;&#x3089;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x7CBE;&#x6DB2;&#x306E;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x304B;&#x3089;&#x5206;&#x96E2;&#x3055;&#x308C;&#x305F; (&#x30B0;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C9;&#x306E;&#x4EBA;&#x306F; + b&#xFF09;&#x3002;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CB;&#x30F3; ATPase &#x6D3B;&#x6027;&#x8A66;&#x91D1;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x306B;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CB;&#x30F3; atpase &#x97AD;&#x6BDB;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x753B;&#x5206;&#x306E; mg 2 + &#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x8B58;&#x5225;&#x3055;&#x308C;&#x305F;-10 microM &#x30D0;&#x30CA;&#x30B8;&#x30F3;&#x9178;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x6291;&#x5236;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x4F9D;&#x5B58; ATPase &#x6D3B;&#x6027;&#x3002;&#x8A66;&#x91D1;&#x306F; 1 mM &#x306E;&#x30CE;&#x30EB;&#x30A8;&#x30D4;&#x30CD;&#x30D5;&#x30EA;&#x30F3;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067;&#x884C;&#x308F;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3068;&#x304D;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x6291;&#x5236;&#x306F;&#x898B;&#x3089;&#x308C;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CB;&#x30F3; ATPase &#x6D3B;&#x6027; mg 2 + &#x3067;&#x3059;-&#x4F9D;&#x5B58;&#x3001;Li +-&#x654F;&#x611F;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;2 mM &#x30A6;&#x30A2;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x3001;1 microM &#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30A4;&#x30B7;&#x30F3;&#x304A;&#x3088;&#x3073; 1 microM &#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x30D5;&#x30A1;&#x30DF;&#x30EA;&#x30FC;&#x306B;&#x920D;&#x611F;&#x3002;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CB;&#x30F3; ATPase &#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x6709;&#x610F; (p &lt; 0.001) asthenozoospermic &#x30C9;&#x30CA;&#x30FC;&#x904B;&#x52D5;&#x30C9;&#x30CA;&#x30FC;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x3066;&#x4F4E;&#x3044;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x306F;&#x3001;&#x81E8;&#x5E8A;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x5B9F;&#x9A13;&#x306E;&#x8A2D;&#x5B9A;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3078;&#x306E;&#x95A2;&#x5FC3;&#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x53D6;&#x5F97;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x7C21;&#x5358;&#x306A;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CB;&#x30F3; ATPase &#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

&#x3072;&#x3068;&#x7CBE;&#x5B50;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CB;&#x30F3; ATPase &#x6D3B;&#x6027;&#x306E;&#x751F;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x540C;&#x5B9A;&#x3002;

&#xD68C; ATPase &#xC815;&#xC790; &#xC6B4;&#xB3D9; &#xC131;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; &#xBAA8;&#xD130; &#xC774;&#xB2E4;. &#xD604;&#xC7AC; &#xC791;&#xC5C5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC815;&#xC790;, normozoospermic &#xBC0F; asthenozoospermic &#xAE30;&#xC99D;&#xC790;&#xC758; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9;&#xC758; &#xBB34;&#xB8CC;&#xC758; axoneme &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xBD84;&#xC218; &#xD68C; ATPase &#xD65C;&#xB3D9; &#xBD84;&#xC11D;. &#xC815;&#xC790;&#xC758; &#xC6B4;&#xB3D9; &#xC131; 50% &#xBCF4;&#xB2E4; &#xB0AE;&#xC740;&#xC5D0; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB41C; &#xB300;&#xB85C; &#xBD84;&#xC218;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; axoneme normozoospermia &#xB610;&#xB294; asthenozoospermia, &#xAC74;&#xAC15; &#xD55C; &#xAE30;&#xC99D;&#xC790; &#xB85C;&#xBD80;&#xD130; &#xC5BB;&#xC740; &#xC815;&#xC561; &#xC0D8;&#xD50C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACE0;&#xB9BD; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4; (&#xB204;&#xAC00; &#xD559;&#xB144;&#xB97C; + b). &#xD68C; ATPase &#xD65C;&#xB3D9; &#xBD84;&#xC11D; &#xB418;&#xC5C8;&#xACE0; &#xBD80;&#xBD84;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD2B9;&#xC9D5;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. Axoneme &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xBD84;&#xC218;&#xC5D0; &#xD68C; ATPase &#xD65C;&#xB3D9;&#xC73C;&#xB85C; Mg2 + &#xD655;&#xC778; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;-&#xC885;&#xC18D; ATPase &#xD65C;&#xB3D9; 10 microM &#xBC14;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC800;&#xD574;. &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; 1mm norepinephrine &#xC874;&#xC7AC; &#xD560; &#xB54C;&#xC774; &#xC800;&#xD574; &#xD558;&#xC9C0; &#xBCF4;&#xC600;&#xB2E4;. &#xD68C; ATPase &#xD65C;&#xB3D9;&#xC740; Mg2 +-&#xC885;&#xC18D;, Li +-&#xBBFC;&#xAC10;&#xD558;&#xACE0; 2mm ouabain, oligomycin, microM 1 1 microM thapsigargin&#xB97C; &#xAD6C;&#xBD84; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD68C; ATPase &#xD65C;&#xB3D9;&#xC740; &#xD06C;&#xAC8C; (p &lt; 0.001) normozoospermic &#xAE30;&#xC99D;&#xC790;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; asthenozoospermic &#xAE30;&#xC99D;&#xC790;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB0AE;&#xC740;. &#xC774;&#xAC83;&#xC740; &#xC784;&#xC0C1; &#xB610;&#xB294; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC124;&#xC815;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801; &#xAD00;&#xC2EC; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB97C; &#xC5BB;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xAC04;&#xB2E8; &#xD68C; ATPase &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC774;&#xB2E4;.

&#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC815;&#xC790;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD68C; ATPase &#xD65C;&#xB3D9;&#xC758; &#xC0DD; &#xD654; &#xD559;&#xC801; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Dine&iacute;na-ATPasa es el motor intracelular para la motilidad del esperma. En el presente trabajo analizan la actividad de la ATPasa dine&iacute;na en una fracci&oacute;n que contiene el Axonema de esperma humano, libre de las membranas del plasma, en normozoospermic y t&eacute;cnicas de los donantes. Fracciones que contienen Axonema fueron aisladas de muestras de semen de donantes sanos con normozoospermia o Astenozoospermia, seg&uacute;n lo indicado por una menor del 50% de la motilidad esperm&aacute;tica (que grado a + b). La actividad de la ATPasa dine&iacute;na fue ensayarse y caracterizada parcialmente. La actividad de la ATPasa dine&iacute;na en las fracciones que contienen Axonema fue identificada como Mg2 +-actividad de ATPasa dependiente inhibida por 10 microM vanadato. Esta inhibici&oacute;n no vio cuando el ensayo se realiz&oacute; en presencia de noradrenalina de 1 mM. Es la actividad de la ATPasa dine&iacute;na Mg2 +-dependiente, Li +-sensibles e insensibles a ouabain de 2 mM, 1 microM Oligomicina y 1 microM thapsigargin. La actividad de la ATPasa dine&iacute;na fue significativamente inferior (p &lt; 0.001) para los donantes de t&eacute;cnicas en comparaci&oacute;n con los donantes de normozoospermic. Se trata de un ensayo de dine&iacute;na-ATPasa sencillo que puede utilizarse para obtener datos de inter&eacute;s funcional en contextos cl&iacute;nicos o experimentales.

Ruben Peralta-Arias

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