par-clip-method-to-identify-transcriptome-wide-binding-sites-rna

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Rockefeller University

&#x5207;&#x7247;&#x5668;&#x6D3B;&#x6027;&#x7684; RNA &#x8BF1;&#x5BFC;&#x6C89;&#x9ED8;&#x590D;&#x6742;&#x9A7B;&#x7559;&#x5728;&#x5176;&#x963F;&#x8033;&#x6208;&#x82F1;&#x96C4; (Ago) &#x7EC4;&#x4EF6;&#xFF0C;&#x5728; PIWI &#x57DF;&#x6240;&#x63D0;&#x4F9B;&#x7684;&#x5173;&#x4E8E;&#x6307;&#x5357;-&#x94A2;&#x7EDE;&#x7EBF;&#x7684;&#x50AC;&#x5316;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684;&#x7279;&#x5B9A;&#x4E8E;&#x7AD9;&#x70B9;&#x7684;&#x76EE;&#x6807; RNA &#x5288;&#x4E2D;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x4E09;&#x5143;&#x914D;&#x5408;&#x7269;&#x6DC0;&#x7C89;&#x9176;&#x55DC;&#x70ED;&#x6208;&#x50AC;&#x5316;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53; DNA 5&#39;-&#x78F7;&#x9178;&#x5316; 21 &#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x6307;&#x5357;&#x548C;&#x76F8;&#x4E92;&#x8865;&#x5145;&#x7684;&#x76EE;&#x6807;&#x7ED3;&#x6784; RNAs 12&#x3001; 15 &#x548C; 19 &#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x7684;&#x957F;&#x5EA6;&#xFF0C;&#x5B83;&#x5B9A;&#x4E49;&#x4E86; Mg(2+) &#x4FC3;&#x8FDB;&#x76EE;&#x6807;&#x7684;&#x7279;&#x5B9A;&#x4E8E;&#x7AD9;&#x70B9;&#x88C2;&#x89E3;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x57FA;&#x7840;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x6570;&#x636E;&#x900F;&#x89C6;&#x8868;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x57DF;&#x8FD0;&#x52A8;&#x5185;&#x7E41;&#x6B96;&#x6B65;&#x9AA4;&#x4ECE;&#x5F62;&#x6838;&#x524D;&#x5F80;&#x6208;&#x811A;&#x624B;&#x67B6;&#x6307;&#x5357;&#x76EE;&#x6807;&#x53CC;&#x9762;&#x6253;&#x5370;&#x5668;&#x6784;&#x6210;&#xFF0C;&#x8D85;&#x8D8A;&#x4E00;&#x4E2A;&#x4EA4;&#x7684;&#x8981;&#x6C42;&#x91CA;&#x653E;&#x7684; 3&#39; &#x7AEF;&#x7684;&#x4ECE;&#x5DF4;&#x65AF;&#x8896;&#x73CD;&#x6307;&#x5357;&#x7684;&#x87BA;&#x65CB;&#x53CC;&#x9762; zippering&#x3002;&#x5288;&#x88C2;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x5404;&#x79CD;&#x957F;&#x5EA6;&#x7684;&#x76EE;&#x6807;&#x652F;&#x6301;&#x6B64;&#x6A21;&#x578B;&#x548C;&#x7CD6;&#x78F7;&#x9178;&#x9AA8;&#x5E72;&#x4FEE;&#x6539;&#x76EE;&#x6807;&#x80A1;&#x8868;&#x660E;&#x7ED3;&#x6784;&#x548C;&#x50AC;&#x5316;&#x4E8C;&#x4EF7;&#x91D1;&#x5C5E;&#x79BB;&#x5B50;&#x6676;&#x4F53;&#x7ED3;&#x6784;&#x4E2D;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x7684;&#x91CD;&#x8981;&#x6027;&#x3002;

&#x6210;&#x6838;&#x3001; &#x7E41;&#x6B96;&#x548C;&#x5288;&#x88C2;&#x7684;&#x76EE;&#x6807; RNAs &#x5728;&#x6208;&#x6C89;&#x9ED8;&#x914D;&#x5408;&#x7269;&#x3002;

The slicer activity of the RNA-induced silencing complex resides within its Argonaute (Ago) component, in which the PIWI domain provides the catalytic residues governing guide-strand mediated site-specific cleavage of target RNA. Here we report on structures of ternary complexes of Thermus thermophilus Ago catalytic mutants with 5'-phosphorylated 21-nucleotide guide DNA and complementary target RNAs of 12, 15 and 19 nucleotides in length, which define the molecular basis for Mg(2+)-facilitated site-specific cleavage of the target. We observe pivot-like domain movements within the Ago scaffold on proceeding from nucleation to propagation steps of guide-target duplex formation, with duplex zippering beyond one turn of the helix requiring the release of the 3'-end of the guide from the PAZ pocket. Cleavage assays on targets of various lengths supported this model, and sugar-phosphate-backbone-modified target strands showed the importance of structural and catalytic divalent metal ions observed in the crystal structures.

Nucleation, propagation and cleavage of target RNAs in Ago silencing complexes.

Trancheuse l&#x26;#39;activit&#xE9; du complexe ARN-induite silencieux r&#xE9;side dans son Argonaute (Ago) composant, dans laquelle le domaine PIWI fournit les r&#xE9;sidus catalytiques r&#xE9;gissant m&#xE9;di&#xE9;e guidage brin site de clivage sp&#xE9;cifique de l&#x26;#39;ARN cible. Nous rapportons ici sur les structures de complexes ternaires de Thermus thermophilus Ago mutants catalytiques avec 5&#x26;#39;-phosphoryl&#xE9;e d&#x26;#39;ADN de guidage 21-nucl&#xE9;otides et des ARN cibles compl&#xE9;mentaires des 12, 15 et 19 nucl&#xE9;otides de long, qui d&#xE9;finissent la base mol&#xE9;culaire de Mg (2 +) - facilit&#xE9; sp&#xE9;cifique de site de clivage de la cible. On observe en forme de pivot mouvements de domaine dans le Ago &#xE9;chafaudage sur partant de nucl&#xE9;ation &#xE0; &#xE9;tapes de propagation de la formation de duplex de guidage-cible, avec effilochage duplex-del&#xE0; d&#x26;#39;un tour de l&#x26;#39;h&#xE9;lice n&#xE9;cessitant la lib&#xE9;ration de l&#x26;#39;extr&#xE9;mit&#xE9; 3 &#x26;#39;de l&#x26;#39;guidage de la poche PAZ . Essais de clivage sur les objectifs de diff&#xE9;rentes longueurs soutenu ce mod&#xE8;le, et le sucre-phosphate-Backbone-modifi&#xE9;s brins cibles ont montr&#xE9; l&#x26;#39;importance de la structure et catalytique des ions m&#xE9;talliques divalents observ&#xE9;es dans les structures cristallines.

Nucl&#xE9;ation, propagation et clivage de l&#x26;#39;ARN cible dans Ago Complexes Silencing

Die Slicer-Aktivit&auml;t von der RNA-induced silencing Komplex befindet sich innerhalb seiner Argonaut (Ago) Komponente, in der die PIWI-Domain bietet, dass die katalytische R&uuml;ckst&auml;nde, die EZB-F&uuml;hrer-Strang standortspezifische Spaltung der Ziel-RNA vermittelt. Hier berichten wir &uuml;ber Strukturen der tern&auml;re komplexe von Thermus Thermophilus her katalytische Mutanten, die 5&#39;-phosphoryliert 21-Nukleotid-F&uuml;hrer DNA und erg&auml;nzenden Ziel RNAs 12, 15 und 19 Nukleotide in der L&auml;nge, die die molekulare Grundlage f&uuml;r Mg(2+)-erleichtert standortspezifische Spaltung des Ziels definieren. Wir beobachten die Pivot-&auml;hnliche Dom&auml;ne Bewegungen innerhalb der her-Ger&uuml;st auf ausgehend von Keimbildung Vermehrung Schritte duplex-F&uuml;hrer zu den Zielgruppen-Formation mit duplex Zippering &uuml;ber eine Umdrehung der Helix erfordern die Freigabe der 3&#39;-Ende der Anleitung aus der PAZ-Tasche. Spaltbarkeit Proben zu Zielen der verschiedenen L&auml;ngen unterst&uuml;tzt dieses Modell und Zucker-Phosphat-R&uuml;ckgrat ver&auml;nderten Ziel Str&auml;nge zeigte die Bedeutung der strukturellen und katalytische bivalente Metallionen in den Kristallstrukturen beobachtet.

Keimbildung, Fortpflanzung und Spaltung des Ziels RNAs in Schweigen zu komplexe her.

L&#39;attivit&agrave; di sezionamento del RNA-induced silencing complex risiede all&#39;interno della sua componente Argonaute (fa), in cui il dominio PIWI fornisce i residui catalitici direttivo guida-filo mediata scissione site-specific di target RNA. Qui riportiamo su strutture di complessi ternari di Thermus thermophilus fa catalitici mutanti con 5&#39;-fosforilato guida di 21 nucleotidi del DNA e RNAs destinazione complementare di 12, 15 e 19 nucleotidi di lunghezza, che definiscono le basi molecolari per la scissione site-specific Mg(2+) agevolato del bersaglio. Osserviamo movimenti pivot-come dominio entro il patibolo fa sul procedimento da nucleazione a passi di propagazione della formazione duplex guida-target, con tracolla duplex oltre un giro dell&#39;elica che richiedono il rilascio di 3&#39;-estremit&agrave; della guida da tasca PAZ. Dosaggi di clivaggio su obiettivi di varie lunghezze supportato questo modello e fili di zucchero-fosfato-spina dorsale-modifica destinazione ha mostrati l&#39;importanza di strutturali e catalitici bivalenti ioni metallici e osservate delle strutture di cristallo.

Nucleazione, propagazione e scissione della destinazione RNAs in fa tacere complessi.

RNA&#x8A98;&#x5C0E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30EC;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x30B9;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B5;&#x30FC;&#x6D3B;&#x6027;&#x306F;PIWI&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306F;&#x6A19;&#x7684;RNA&#x306E;&#x30AC;&#x30A4;&#x30C9;&#x672C;&#x9396;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x90E8;&#x4F4D;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x958B;&#x88C2;&#x3092;&#x652F;&#x914D;&#x3059;&#x308B;&#x89E6;&#x5A92;&#x6B8B;&#x57FA;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x30A2;&#x30EB;&#x30B4;&#x30CE;&#x30FC;&#x30C8;&#xFF08;AGO&#xFF09;&#x30B3;&#x30F3;&#x30DD;&#x30FC;&#x30CD;&#x30F3;&#x30C8;&#x5185;&#x306B;&#x5B58;&#x5728;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;5&#x26;#39;-&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;21&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x30AC;&#x30A4;&#x30C9;DNA&#x3068;&#x76F8;&#x88DC;&#x7684;&#x306A;&#x6A19;&#x7684;RNA&#x3092;12&#x3001;15&#x304A;&#x3088;&#x3073;Mg&#xFF08;2 +&#xFF09;&#x306E;&#x5206;&#x5B50;&#x57FA;&#x76E4;&#x3092;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x3059;&#x308B;&#x9577;&#x3055;&#x306E;19&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x200B;&#x200B;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x89E6;&#x5A92;&#x5909;&#x7570;&#x30A2;&#x30B4;&#x30FC;Thermus thermophilus&#x7531;&#x6765;&#x306E;&#x4E09;&#x5143;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x3092;&#x5831;&#x544A; - &#x6A19;&#x7684;&#x306E;&#x90E8;&#x4F4D;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x5207;&#x65AD;&#x3092;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;PAZ&#x30DD;&#x30B1;&#x30C3;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x30AC;&#x30A4;&#x30C9;&#x306E;3&#x26;#39;-&#x672B;&#x7AEF;&#x306E;&#x30EA;&#x30EA;&#x30FC;&#x30B9;&#x3092;&#x5FC5;&#x8981;&#x3068;&#x3059;&#x308B;&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E;1&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x3092;&#x8D85;&#x3048;&#x3066;&#x4E8C;&#x91CD;zippering&#x3067;&#x3001;&#x30AC;&#x30A4;&#x30C9;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x4E8C;&#x91CD;&#x5F62;&#x6210;&#x306E;&#x4F1D;&#x64AD;&#x306E;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x306B;&#x6838;&#x304B;&#x3089;&#x9032;&#x3093;&#x3067;&#x30A2;&#x30B4;&#x30FC;&#x8DB3;&#x5834;&#x5185;&#x306E;&#x30D4;&#x30DC;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x52D5;&#x304D;&#x3092;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x9577;&#x3055;&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x5207;&#x65AD;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3092;&#x652F;&#x6301;&#x3057;&#x3001;&#x7CD6; - &#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x30D0;&#x30C3;&#x30AF;&#x30DC;&#x30FC;&#x30F3;&#x4FEE;&#x98FE;&#x6A19;&#x7684;&#x9396;&#x306F;&#x7D50;&#x6676;&#x69CB;&#x9020;&#x3067;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x89E6;&#x5A92;&#x4E8C;&#x4FA1;&#x91D1;&#x5C5E;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x932F;&#x4F53;&#x3092;&#x6D88;&#x3059;&#x524D;&#x306B;&#x3001;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;RNA&#x306E;&#x6838;&#x751F;&#x6210;&#x3001;&#x4F1D;&#x642C;&#x3001;&#x80F8;&#x306E;&#x8C37;&#x9593;

RNA &#xC720;&#xB3C4; &#xC785;&#xC744; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C;&#xC758; &#xC2AC;&#xB77C;&#xC774;&#xC11C; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC740; PIWI &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xC81C;&#xACF5; &#xAC00;&#xC774;&#xB4DC; &#xBB3C;&#xAC00; &#xAD00;&#xB9AC; &#xCD09;&#xB9E4; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; &#xC911;&#xC7AC; &#xB300;&#xC0C1; RNA&#xC758; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xBCC4; &#xBD84;&#xC5F4;&#xC740; Argonaute (&#xC804;) &#xAD6C;&#xC131; &#xB0B4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0C1;&#xC8FC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xB300;&#xC0C1;&#xC758; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xBCC4; &#xBD84;&#xC5F4; Mg(2+) &#xCD09;&#xC9C4;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xBD84;&#xC790; &#xB2E8;&#xC704;&#xB85C; &#xC815;&#xC758; &#xD558;&#xB294; &#xAE38;&#xC774;, 12, 15 &#xBC0F; 19 &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; RNAs Thermus thermophilus 21-&#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xAC00;&#xC774;&#xB4DC; 5&#39;-phosphorylated DNA &#xBC0F; &#xBCF4;&#xC644; &#xB300;&#xC0C1; &#xC804; &#xCD09;&#xB9E4; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xC0BC;&#xD56D; &#xB2E8;&#xC9C0;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC5D0; &#xBCF4;&#xACE0; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC774;&#xC911; zippering &#xB098;&#xC120; &#xD30C;&#xC2A4; &#xD3EC;&#xCF13;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC00;&#xC774;&#xB4DC;&#xC758; 3&#39;-&#xB05D;&#xC758; &#xC11D;&#xBC29;&#xC744; &#xC694;&#xAD6C; &#xD55C; &#xCC28;&#xB840; &#xB118;&#xC5B4;&#xC640; &#xAC00;&#xC774;&#xB4DC; &#xB300;&#xC0C1; &#xC774;&#xC911; &#xD615;&#xC131;&#xC758; &#xC804;&#xD30C; &#xB2E8;&#xACC4;&#xB97C; nucleation&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9C4;&#xD589;&#xC5D0; &#xC804; &#xBE44; &#xACC4; &#xB0B4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD53C;&#xBC97; &#xAC19;&#xC740; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xC6C0;&#xC9C1;&#xC784;&#xC744; &#xAD00;&#xCC30;. &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xAE38;&#xC774;&#xC758; &#xBAA9;&#xD45C;&#xC5D0; &#xBD84;&#xC5F4; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC9C0;&#xC6D0;&#xC774; &#xBAA8;&#xB378;&#xACFC; &#xC124;&#xD0D5; &#xC778;&#xC0B0; &#xC5FC; &#xBC31;&#xBCF8;&#xC774; &#xC218;&#xC815; &#xB300;&#xC0C1; &#xAC00;&#xB2E5; &#xAD6C;&#xC870;&#xC640; &#xCD09;&#xB9E4; divalent &#xAE08;&#xC18D; &#xC774;&#xC628; &#xACB0;&#xC815; &#xAD6C;&#xC870;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xCC30;&#xC758; &#xC911;&#xC694;&#xC131;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC8FC;&#xC5C8;&#xB2E4;.

Nucleation, &#xC804;&#xD30C; &#xBC0F; &#xB300;&#xC0C1; &#xC804; &#xB2E8;&#xC9C0; &#xCE68;&#xBB35;&#xC5D0; Rnas&#xC758; &#xC720; &#xBC29; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xACE8;&#xC9DC;&#xAE30;.

La actividad del complejo rebanadora silenciamiento de ARN inducida reside dentro de su Argonauta (Hace) componente, en el que el dominio PIWI proporciona los residuos catal&#xED;ticos que rigen gu&#xED;a-hebra mediada espec&#xED;fica del sitio de escisi&#xF3;n de ARN diana. Aqu&#xED; nos informe sobre las estructuras de los complejos ternarios de Thermus thermophilus Hace mutantes catal&#xED;ticos con 5&#x26;#39;-fosforilados ADN gu&#xED;a de 21 nucle&#xF3;tidos y ARN complementarios de destino de los 12, 15 y 19 nucle&#xF3;tidos de longitud, que definen la base molecular de Mg (2 +) - facilitado espec&#xED;fica del sitio de escisi&#xF3;n de la diana. Observamos como los movimientos de pivote de dominio dentro del andamiaje Hace procedentes de la nucleaci&#xF3;n en los pasos de propagaci&#xF3;n de la formaci&#xF3;n de d&#xFA;plex gu&#xED;a de destino, con zippering d&#xFA;plex de m&#xE1;s de un giro de la h&#xE9;lice que requiere la liberaci&#xF3;n del extremo 3 &#x26;#39;de la gu&#xED;a del bolsillo PAZ . Ensayos de desdoblamiento de los objetivos de diferentes longitudes apoyado este modelo, y el az&#xFA;car-fosfato-la columna vertebral modificados hebras objetivo de manifiesto la importancia de los iones met&#xE1;licos para uso estructural y catal&#xED;tico divalentes observados en las estructuras cristalinas.

La nucleaci&#xF3;n, propagaci&#xF3;n y escisi&#xF3;n de ARN diana en el Complejo Hace silencios

RNA &#x8A8A;&#x672C;&#x662F;&#x8F6C;&#x5F55;&#x540E;&#x57FA;&#x56E0;&#x76D1;&#x7BA1;&#x6D89;&#x53CA;&#x6570;&#x4EE5;&#x767E;&#x8BA1;&#x7684; RNA &#x7ED3;&#x5408;&#x86CB;&#x767D; (&#x9650;&#x5236;&#x6027;&#x5546;&#x4E1A;&#x60EF;&#x4F8B;) &#x548C;&#x542B;&#x6709; microRNA &#x7684;&#x6838;&#x7CD6;&#x6838;&#x86CB;&#x767D;&#x590D;&#x5408;&#x7269; (miRNPs) &#x8868;&#x793A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7C7B;&#x578B;&#x7684;&#x4F9D;&#x8D56;&#x65B9;&#x5F0F;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F00;&#x53D1;&#x7684;&#x57FA;&#x4E8E;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7684;&#x4EA4;&#x8054;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6765;&#x786E;&#x5B9A;&#x5728;&#x9AD8;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x548C;&#x8F6C;&#x5F55;&#x7EC4;&#x5168;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x9650;&#x5236;&#x6027;&#x5546;&#x4E1A;&#x60EF;&#x4F8B;&#x548C; miRNPs &#x7684;&#x7ED3;&#x5408;&#x70B9;&#x3002;&#x4EA4;&#x8054;&#x7AD9;&#x70B9;&#x4E2D;&#x7F16;&#x5199;&#x4ECE; immunopurified RNPs 4 thiouridine &#x6CBB;&#x7597;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6269;&#x589E;&#x80DE;&#x82F7;&#x8FC7;&#x6E21;&#x5230;&#x80F8;&#x82F7;&#x6240;&#x53D1;&#x73B0;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x51E0;&#x4E2A;&#x7684;&#x5BC6;&#x96C6;&#x7814;&#x7A76;&#x7684;&#x9650;&#x5236;&#x6027;&#x5546;&#x4E1A;&#x60EF;&#x4F8B;&#x548C; miRNPs&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC; PUM2&#x3001; QKI&#x3001; IGF2BP1 3&#x3001; &#x6208;/EIF2C1-4 &#x548C; TNRC6A C.&#x786E;&#x5B9A;&#x7684;&#x7ED3;&#x5408;&#x4F4D;&#x70B9;&#x548C;&#x89C4;&#x7BA1;&#x7684;&#x540E;&#x679C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x663E;&#x793A;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x56E0;&#x7D20;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x6210;&#x5343;&#x4E0A;&#x4E07;&#x7684;&#x7AD9;&#x70B9;&#x5305;&#x542B;&#x5B9A;&#x4E49;&#x7684;&#x5E8F;&#x5217;&#x56FE;&#x6848;&#x4E3A; exonic &#x4E0E;&#x5185;&#x542B;&#x5B50;&#x6216;&#x7F16;&#x7801;&#x4E0E;&#x7FFB;&#x8BD1;&#x6709;&#x4E0D;&#x540C;&#x559C;&#x597D;&#x8C08;&#x8BDD;&#x5185;&#x5BB9;&#x533A;&#x57DF;&#x3002;&#x8DE8;&#x8F6C;&#x5F55;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x7ED3;&#x5408;&#x4F4D;&#x70B9;&#x7684;&#x7CBE;&#x786E;&#x6620;&#x5C04;&#x5C06;&#x8FC5;&#x901F;&#x65B0;&#x5174;&#x6570;&#x636E;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x4E2A;&#x4EBA;&#x548C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x53D8;&#x5316;&#x5982;&#x4F55;&#x8D21;&#x732E;&#x590D;&#x6742;&#x9057;&#x4F20;&#x75BE;&#x75C5;&#x7684;&#x9057;&#x4F20;&#x53D8;&#x5F02;&#x7684;&#x89E3;&#x91CA;&#x7684;&#x5173;&#x952E;&#x3002;

&#x8F6C;&#x5F55;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x5168;&#x7531; PAR &#x526A;&#x8F91; RNA &#x7ED3;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x548C; microRNA &#x76EE;&#x6807;&#x7AD9;&#x70B9;&#x7684;&#x6807;&#x8BC6;&#x3002;

RNA transcripts are subject to posttranscriptional gene regulation involving hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) expressed in a cell-type dependent fashion. We developed a cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs. The crosslinked sites are revealed by thymidine to cytidine transitions in the cDNAs prepared from immunopurified RNPs of 4-thiouridine-treated cells. We determined the binding sites and regulatory consequences for several intensely studied RBPs and miRNPs, including PUM2, QKI, IGF2BP1-3, AGO/EIF2C1-4 and TNRC6A-C. Our study revealed that these factors bind thousands of sites containing defined sequence motifs and have distinct preferences for exonic versus intronic or coding versus untranslated transcript regions. The precise mapping of binding sites across the transcriptome will be critical to the interpretation of the rapidly emerging data on genetic variation between individuals and how these variations contribute to complex genetic diseases.

Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.

Transcrits d&#x26;#39;ARN sont soumis &#xE0; la r&#xE9;gulation des g&#xE8;nes post-transcriptionnelle impliquant des centaines de prot&#xE9;ines liant l&#x26;#39;ARN (pratiques commerciales restrictives) et des complexes ribonucl&#xE9;oprot&#xE9;iques microARN contenant (miRNPs) exprim&#xE9;es de fa&#xE7;on d&#xE9;pendante du type cellulaire. Nous avons d&#xE9;velopp&#xE9; une approche de r&#xE9;ticulation &#xE0; base de cellules pour d&#xE9;terminer &#xE0; haute r&#xE9;solution et du transcriptome &#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;chelle des sites de liaison des pratiques commerciales restrictives cellulaires et miRNPs. Les sites r&#xE9;ticul&#xE9;s sont r&#xE9;v&#xE9;l&#xE9;es par la thymidine &#xE0; des transitions cytidine dans les ADNc pr&#xE9;par&#xE9;s &#xE0; partir de immunopurifi&#xE9; RNP de la 4-thiouridine cellules trait&#xE9;es. Nous avons d&#xE9;termin&#xE9; les sites de liaison et les cons&#xE9;quences r&#xE9;glementaires de plusieurs pratiques commerciales restrictives intens&#xE9;ment &#xE9;tudi&#xE9;es et miRNPs, y compris PUM2, QKI, IGF2BP1-3, AGO/EIF2C1-4 et TNRC6A-C. Notre &#xE9;tude a r&#xE9;v&#xE9;l&#xE9; que ces facteurs se lient des milliers de sites contenant des motifs de s&#xE9;quence d&#xE9;finis et ont des pr&#xE9;f&#xE9;rences distinctes pour exonique contre intronique ou de codage par rapport &#xE0; des r&#xE9;gions non traduites transcription. La cartographie pr&#xE9;cise des sites de liaison &#xE0; travers le transcriptome sera cruciale pour l&#x26;#39;interpr&#xE9;tation des donn&#xE9;es se font jour rapidement sur la variation g&#xE9;n&#xE9;tique entre les individus et la fa&#xE7;on dont ces variations contribuent &#xE0; des maladies g&#xE9;n&#xE9;tiques complexes.

Transcriptome &#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;chelle d&#x26;#39;identification de l&#x26;#39;ARN-binding protein et sites cibles microARN par PAR-CLIP

RNA-Transkripte unterliegen Posttranscriptionale Genregulation bei denen hunderte von RNA-bindende Proteine (RBPs) und MicroRNA-haltigen-Gebiets-komplexe (MiRNPs) in einer Art von Zelle abh&auml;ngigen Weise ausgedr&uuml;ckt. Wir entwickelten einen zellbasierte vernetzender Ansatz um die Bindungsstellen der zellul&auml;ren RBPs und MiRNPs bei hoher Aufl&ouml;sung und Transkriptom-weite zu bestimmen. Die vernetzte Standorte sind durch Thymidin zu Cytidin &Uuml;berg&auml;nge in die cDNAs aus Immunopurified RNPs 4-Thiouridine-behandelte Zellen vorbereitet offenbart. Wir entschlossen die Bindungsstellen und regulatorische Konsequenzen f&uuml;r mehrere intensiv studierte RBPs und MiRNPs, einschlie&szlig;lich PUM2, QKI, IGF2BP1-3, her/EIF2C1-4 und TNRC6A-C. Unsere Studie ergab, dass diese Faktoren binden Tausende von Seiten mit definierten Sequenz Motive und unterschiedliche Vorlieben haben f&uuml;r exonic versus verband intronic oder Codierung gegen&uuml;ber nicht &uuml;bersetzte Abschrift Regionen. Die genaue Zuordnung der Bindung von Websites &uuml;ber das Transkriptom ist entscheidend, um die Interpretation der sich schnell verbreitende Daten auf genetische Variation zwischen Individuen und wie diese Variationen zu komplexen genetischen Erkrankungen beitragen.

Transkriptom-weite Identifikation von RNS-bindene Protein und MicroRNA Ziel-Sites von PAR-CLIP.

Trascrizioni di RNA sono soggetti a regolazione genica posttranscriptional coinvolgendo centinaia di RNA-binding proteins (RBPs) e microRNA contenenti complessi ribonucleoproteina (miRNPs) espressi in modo dipendente dal tipo di cellula. Abbiamo sviluppato un approccio basato sulle celle reticolazione per determinare a livello transcriptome e ad alta risoluzione i siti di legame di RBPs cellulare e miRNPs. I siti di reticolati sono rivelati da timidina a transizioni citidina in cDNAs preparato da immunopurified RNPs di cellule 4-thiouridine-trattati. Abbiamo determinato i siti di legame e conseguenze normative per diversi RBPs intensamente studiato e miRNPs, tra cui PUM2, QKI, IGF2BP1-3, 4-fa/EIF2C1 e TNRC6A-C. Il nostro studio &egrave; emerso che questi fattori legano migliaia di siti che contengono motivi di sequenza definita e hanno preferenze distinte per untranslated esonico versus intronic o codifica versus regioni di trascrizione. La precisa mappatura dei siti di legame attraverso il trascrittoma sar&agrave; fondamentale per l&#39;interpretazione dei dati rapidamente emergenti sulla variazione genetica tra individui e come tali variazioni contribuiscono a malattie genetiche complesse.

Transcriptome identificazione dei siti di RNA-binding protein e microRNA bersaglio da PAR-CLIP.

RNA&#x8EE2;&#x5199;&#x7523;&#x7269;&#x306F;&#x3001;RNA&#x7D50;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08;RBP&#xFF09;&#x3068;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;RNA&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x7D30;&#x80DE;&#x578B;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3059;&#x308B;&#x5F62;&#x3067;&#x8868;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x30EA;&#x30DC;&#x6838;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#xFF08;miRNPs&#xFF09;&#x6570;&#x767E;&#x4EBA;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x8EE2;&#x5199;&#x5F8C;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x5236;&#x5FA1;&#x306E;&#x5BFE;&#x8C61;&#x3068;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x9AD8;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x3084;&#x643A;&#x5E2F;RBPs&#x3068;miRNPs&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30E0;&#x5168;&#x4F53;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x3067;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x30BB;&#x30EB;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x200B;&#x200B;&#x67B6;&#x6A4B;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x67B6;&#x6A4B;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306F;&#x3001;4  - &#x30C1;&#x30AA;&#x30A6;&#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;&#x51E6;&#x7406;&#x3057;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;RNP&#x306F;&#x3092;&#x514D;&#x75AB;&#x7CBE;&#x88FD;&#x304B;&#x3089;&#x8ABF;&#x88FD;&#x3057;&#x305F;cDNA&#x3067;&#x30B7;&#x30C1;&#x30B8;&#x30F3;&#x9077;&#x79FB;&#x306B;&#x30C1;&#x30DF;&#x30B8;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;PUM2&#x3001;QKI&#x3001;IGF2BP1-3&#x3001;AGO/EIF2C1-4&#x3068;TNRC6A-C&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x71B1;&#x5FC3;&#x306B;&#x7814;&#x7A76;RBPs&#x3068;miRNPs&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x898F;&#x5236;&#x306E;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x8981;&#x56E0;&#x304C;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x914D;&#x5217;&#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x4F55;&#x5343;&#x3082;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x3001;&#x30A8;&#x30AF;&#x30BD;&#x30F3;&#x5BFE;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C8;&#x30ED;&#x30F3;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x975E;&#x7FFB;&#x8A33;&#x8EE2;&#x5199;&#x9818;&#x57DF;&#x5BFE;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x55DC;&#x597D;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30E0;&#x9593;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306E;&#x6B63;&#x78BA;&#x306A;&#x30DE;&#x30C3;&#x30D4;&#x30F3;&#x30B0;&#x306F;&#x3001;&#x500B;&#x4EBA;&#x3068;&#x3069;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5909;&#x52D5;&#x306F;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x6027;&#x75BE;&#x60A3;&#x3078;&#x306E;&#x8CA2;&#x732E;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x7684;&#x5909;&#x7570;&#x306B;&#x6025;&#x901F;&#x306B;&#x65B0;&#x8208;&#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306E;&#x89E3;&#x91C8;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;

PAR-CLIP&#x306B;&#x3088;&#x308B;RNA&#x7D50;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3068;microRNA&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30E0;&#x5168;&#x4F53;&#x306E;&#x8B58;&#x5225;

RNA &#xC0AC;&#xBCF8;&#xC744; RNA &#xC758;&#xBB34;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (RBPs)&#xC640; microRNA &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xC218;&#xBC31; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; posttranscriptional &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC870;&#xC808; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; ribonucleoprotein &#xBCF5;&#xD569;&#xBB3C; (miRNPs) &#xC140; &#xD0C0;&#xC785; &#xC885;&#xC18D; &#xD328;&#xC158;&#xC5D0; &#xD45C;&#xD604; &#xB41C;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC140;&#xB8F0;&#xB7EC; RBPs &#xBC0F; Mirnps&#xC758; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xB192;&#xC740; &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; transcriptome &#xC218;&#xC900;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACB0;&#xC815; &#xAC00;&#xAD50; &#xC140; &#xAE30;&#xBC18; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC744; &#xAC1C;&#xBC1C;. Crosslinked &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xD2F0; &#xBBF8; &#xB518; immunopurified 4 thiouridine &#xCE58;&#xB8CC; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; Rnps&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC900;&#xBE44; &#xB41C; Cdnas&#xC5D0; cytidine &#xC804;&#xD658;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xACF5;&#xAC1C; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC2EC;&#xAC01; &#xD558; &#xAC8C; &#xACF5;&#xBD80;&#xC640; miRNPs, PUM2, QKI, IGF2BP1 3, &#xC804;/EIF2C1-4&#xC640; TNRC6A C&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558; &#xC5EC; &#xC5EC;&#xB7EC; RBPs &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xBC0F; &#xADDC;&#xC81C; &#xACB0;&#xACFC; &#xACB0;&#xC815; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xACB0;&#xACFC; &#xBC1D;&#xD600; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC694;&#xC18C; &#xC21C;&#xC11C; &#xB300;&#xB85C; &#xBAA8;&#xD2F0;&#xD504;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC758; &#xC218;&#xCC9C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD558;&#xACE0;, intronic &#xB610;&#xB294; &#xCF54;&#xB529; &#xB300; &#xB300; exonic untranslated&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBA85;&#xBC31;&#xD55C; &#xD2B9;&#xD61C;&#xAC00; &#xC788;&#xB2E4; &#xB300; &#xBCF8; &#xC601;&#xC5ED;. Transcriptome &#xAC78;&#xCCD0; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC815;&#xD655;&#xD55C; &#xB9E4;&#xD551; &#xAC1C;&#xC778;&#xACFC;&#xC774; &#xBCC0;&#xC774; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC9C8;&#xD658;&#xC5D0; &#xAE30;&#xC5EC; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xC720;&#xC804; &#xBCC0;&#xC774;&#xC5D0; &#xAE09;&#xC18D; &#xD558; &#xAC8C; &#xC2E0;&#xD765; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xC758; &#xD574;&#xC11D;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xAC83;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Transcriptome &#xC218;&#xC900; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD30C; &#xD074;&#xB9BD;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; RNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xACFC; microRNA &#xB300;&#xC0C1; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC758;.

Las transcripciones de ARN est&#xE1;n sujetos a la regulaci&#xF3;n de genes postranscripcional que participaron cientos de ARN-prote&#xED;nas de uni&#xF3;n a las pr&#xE1;cticas comerciales restrictivas () y que contienen complejos de microARN-ribonucleoprote&#xED;na (miRNPs) expresados &#x200B;&#x200B;en forma de c&#xE9;lulas de tipo dependiente. Hemos desarrollado un enfoque reticulaci&#xF3;n a base de c&#xE9;lulas para determinar en alta resoluci&#xF3;n y en todo el transcriptoma de los sitios de uni&#xF3;n de las pr&#xE1;cticas comerciales restrictivas y miRNPs celulares. Los sitios reticuladas son reveladas por timidina a las transiciones de citidina en los ADNc preparadas a partir de immunopurified RNPs de 4-tiouridina c&#xE9;lulas tratadas. Se determinaron los sitios de uni&#xF3;n y las consecuencias reglamentarias para varias pr&#xE1;cticas comerciales restrictivas intensamente estudiados y miRNPs, incluyendo PUM2, QKI, IGF2BP1 3, AGO/EIF2C1-4 y TNRC6A-C. Nuestro estudio revel&#xF3; que estos factores se unen miles de sitios que contengan la secuencia de motivos definidos y tienen distintas preferencias de exonic contra intr&#xF3;nica o codificaci&#xF3;n en comparaci&#xF3;n con las regiones no traducidas de transcripci&#xF3;n. La asignaci&#xF3;n exacta de los sitios de uni&#xF3;n de todo el transcriptoma ser&#xE1; fundamental para la interpretaci&#xF3;n de los datos que emergen r&#xE1;pidamente sobre la variaci&#xF3;n gen&#xE9;tica entre los individuos y c&#xF3;mo estas variaciones contribuyen a enfermedades gen&#xE9;ticas complejas.

Article	Year
Nucleation, propagation and cleavage of target RNAs in Ago silencing complexes. Nature\| PubMed ID: 19812667	2009
Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell\| PubMed ID: 20371350	2010

Greg S. Wardle

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