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Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

University of Toronto

&#x55DC;&#x6C34;&#x6C14;&#x5355;&#x80DE;&#x83CC;&#x5206;&#x6CCC;&#x86CB;&#x767D;&#x6BD2;&#x7D20;&#x901A;&#x8FC7;&#x7C7B;&#x578B;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x901A;&#x9053;&#xFF0C;&#x6D89;&#x53CA;&#x5230;&#x7684;&#x81F3;&#x5C11;&#x4E24;&#x4E2A; operons&#xFF0C;exeAB (gspAB) &#x548C; exeC-N (&#x83F2;&#x65AF;&#x7279; N) &#x7684;&#x4EA7;&#x54C1;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x62A5;&#x544A;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6C14;&#x5206;&#x6CCC;&#x8FD8;&#x539F;&#x5230; C5.84&#xFF0C;exeA::Tn5-751 &#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#xFF0C;&#x6240;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684; exeD &#x72EC;&#x81EA;&#x5728;&#x53D8;&#x538B;&#x5668;&#x4E2D;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x8868;&#x660E;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x5E76;&#x4E0D;&#x53CD;&#x6620;&#x7684; ExeAB exeC N &#x64CD;&#x7EB5;&#x5B50;&#x7684;&#x8C03;&#x63A7;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x76F8;&#x53CD;&#xFF0C;&#x514D;&#x75AB;&#x5370;&#x8FF9;&#x6CD5;&#x5206;&#x6790;&#x8868;&#x660E; ExeD &#x786E;&#x5B9E;&#x4E0D;&#x5728; C5.84&#x3001; multimerize &#x548C;&#x819C;&#x5206;&#x79BB;&#x663E;&#x793A;&#x5355;&#x4F53; ExeD &#x4ECD;&#x7136;&#x5728;&#x5185;&#x90E8;&#x7684;&#x819C;&#x3002;Multimeric ExeD&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x4E0E;&#x6C14;&#x5206;&#x6CCC;&#x7684;&#x589E;&#x52A0;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x589E;&#x52A0;&#x5BFC;&#x81F4;&#x7684; ExeAB&#xFF0C;&#x4F46;&#x4E0D;&#x662F;&#x5355;&#x72EC;&#x7684;&#x4ECE; C5.84 &#x8D28;&#x7C92;&#x86CB;&#x767D;&#x8868;&#x8FBE;&#x3002;&#x8109;&#x51B2;&#x5927;&#x901A;&#x5206;&#x6790;&#x8FD8;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x7684; ExeAB &#x5141;&#x8BB8;&#x4EE5;&#x524D;&#x79EF;&#x7D2F;&#x7684;&#x5355;&#x4F53; ExeD multimerization&#x3002;C5.84 &#x7EC6;&#x80DE;&#x9AD8;&#x4EA7; ExeD&#xFF0C;&#x5B83;&#x751A;&#x81F3;&#x5728;&#x6CA1;&#x6709; ExeAB multimerized &#x548C;&#x6700;&#x7559;&#x5728;&#x5185;&#x5FC3;&#x7684;&#x819C;&#xFF0C;&#x867D;&#x7136;&#x6570;&#x989D;&#x76F8;&#x4F3C;&#x5728;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x5916;&#x819C;&#x5206;&#x7EA7;&#x4E0E;&#x5916;&#x819C;&#x4E0A;&#x7684;&#x9AD8;&#x4EA7;&#x7EC6;&#x80DE;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E; exeAB &#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x7684;&#x5206;&#x6CCC;&#x7F3A;&#x9677;&#x662F;&#x65E0;&#x6CD5;&#x7EC4;&#x88C5; ExeD &#x80F0;&#x6CCC;&#x7D20;&#x5916;&#x819C;&#x7684;&#x7ED3;&#x679C;&#x3002;&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x548C; multimerization overproduced ExeD &#x8FD9;&#x4E9B;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x8868;&#x660E;&#x590D;&#x6742;&#x7684; ExeAB &#x5728; ExeD &#x8FD0;&#x8F93;&#x5230;&#x5916;&#x819C;&#x4E2D;&#x626E;&#x6F14;&#x8981;&#x4E48;&#x76F4;&#x63A5;&#x6216;&#x95F4;&#x63A5;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

&#x9700;&#x8981;&#x7684;&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x548C; ExeD &#x5206;&#x6CCC;&#x7AEF;&#x53E3; multimer &#x5927;&#x4F1A;&#x7684;&#x55DC;&#x6C34;&#x6C14;&#x5355;&#x80DE;&#x83CC; ExeAB &#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x5F0F;&#x3002;

Aeromonas hydrophila secretes protein toxins via the type II pathway, involving the products of at least two operons, exeAB (gspAB) and exeC-N (gspC-N). In the studies reported here, aerolysin secretion was restored to C5.84, an exeA::Tn5-751 mutant, by overexpression of exeD alone in trans. Expression studies indicated that these results did not reflect a role of ExeAB in the regulation of the exeC-N operon. Instead, immunoblot analysis showed that ExeD did not multimerize in C5.84, and fractionation of the membranes showed that the monomeric ExeD remained in the inner membrane. Expression of ExeAB, but not either protein alone, from a plasmid in C5.84 resulted in increases in the amount of multimeric ExeD, which correlated with increases in aerolysin secretion. Pulse-chase analysis also suggested that the induction of ExeAB allowed multimerization of previously accumulated monomer ExeD. In C5.84 cells overproducing ExeD, it multimerized even in the absence of ExeAB and, although most remained in the inner membrane, an amount similar to that in wild-type outer membranes fractionated with the outer membrane of the overproducing cells. These results indicate that the secretion defect of exeAB mutants is a result of an inability to assemble the ExeD secretin in the outer membrane. The localization and multimerization of overproduced ExeD in these mutants further suggests that the ExeAB complex plays either a direct or indirect role in the transport of ExeD into the outer membrane.

Expression of the ExeAB complex of Aeromonas hydrophila is required for the localization and assembly of the ExeD secretion port multimer.

Aeromonas hydrophila s&eacute;cr&egrave;te des toxines prot&eacute;iques par la voie de type II, portant sur les produits d&#39;au moins deux op&eacute;rons, exeAB (gspAB) et exeC-N (N-gspC). Dans les &eacute;tudes rapport&eacute;es ici, la s&eacute;cr&eacute;tion d&#39;a&eacute;rolysine a &eacute;t&eacute; restaur&eacute;e &agrave; C5.84, un mutant exeA::Tn5-751, par la surexpression d&#39;exeD seule dans TRANS. &eacute;tudes d&#39;Expression a indiqu&eacute; que ces r&eacute;sultats ne refl&egrave;tent pas un r&ocirc;le de ExeAB dans la r&eacute;gulation de l&#39;op&eacute;ron exeC-N. Au lieu de cela, l&#39;analyse par immunotransfert a montr&eacute; que ExeD n&#39;a pas multimerize dans C5.84, et fractionnement des membranes a montr&eacute; que le monom&egrave;re ExeD reste dans la membrane interne. Expression de ExeAB, mais pas non plus seul, d&#39;un plasmide dans C5.84 de prot&eacute;ine a entra&icirc;n&eacute; une augmentation d&#39;un montant de multim&egrave;res ExeD, corr&eacute;l&eacute;es avec l&#39;augmentation de la s&eacute;cr&eacute;tion a&eacute;rolysine. Analyse pulse-chase a &eacute;galement sugg&eacute;r&eacute; que l&#39;induction de ExeAB a permis &agrave; multimerization de monom&egrave;re pr&eacute;c&eacute;demment accumul&eacute; ExeD. Dans les cellules C5.84 surproduisant ExeD, il multimerized m&ecirc;me en l&#39;absence de ExeAB et, bien que plus est rest&eacute; dans la membrane interne, un montant similaire &agrave; ce que, dans les membranes externes de type sauvage fractionn&eacute;s avec la membrane externe de la surproduction des cellules. Ces r&eacute;sultats indiquent que le d&eacute;faut de s&eacute;cr&eacute;tion des mutants d&#39;exeAB est le r&eacute;sultat d&#39;une incapacit&eacute; &agrave; assembler la s&eacute;cr&eacute;tine ExeD dans la membrane externe. La localisation et la multimerization de surproduite ExeD chez ces mutants encore sugg&egrave;re que le complexe de ExeAB joue soit un r&ocirc;le direct ou indirect dans le transport de ExeD dans la membrane externe.

Expression du complexe ExeAB d&#39;Aeromonas hydrophila est n&eacute;cessaire pour la localisation et l&#39;assemblage de la s&eacute;cr&eacute;tion ExeD port multim&egrave;res.

Die Expression des komplexen ExeAB von Aeromonas hydrophila wird f&#xFC;r die Lokalisierung und die Montage des EXED Sekretion Port Multimer erforderlich.

Aeromonas hydrophila secerne tossine proteiche attraverso la via II tipo, che coinvolgono i prodotti di almeno due operoni, exeAB (gspAB) ed exeC-N (gspC-N). Negli studi riportati qui, Aerolisina secrezione &egrave; stata restaurata a C5.84, un mutante exeA::Tn5-751, da sovraespressione di esso solo in trans espressione studi ha indicato che questi risultati non riflette un ruolo di ExeAB nella regolazione dell&#39;operone exeC-N. Invece, immunoblot analisi ha mostrato che ExeD fatto non multimerize in C5.84, e frazionamento delle membrane hanno mostrato che l&#39;ExeD monomerico rimase nella membrana interna. Espressione di ExeAB, ma non sia da solo, da un plasmide in C5.84 della proteina ha provocato aumenti dell&#39;importo multimerica ExeD, che correlato con un incremento di secrezione Aerolisina. Analisi impulsi-chase ha anche suggerito che l&#39;induzione di ExeAB consentito multimerization del monomero precedentemente accumulato ExeD. In C5.84 cellule sovrapproduzione ExeD, si multimerized anche in assenza di ExeAB e, anche se pi&ugrave; rimasto nella membrana interna, cellule una quantit&agrave; simile a nel selvaggio-tipo outer membrane frazionato con la membrana esterna della sovrapproduzione. Questi risultati indicano che il difetto di secrezione di exeAB mutanti &egrave; il risultato di un&#39;incapacit&agrave; di assemblare la secretina esso nella membrana esterna. La localizzazione e multimerization di sovrapproduzione ExeD in questi mutanti ulteriore suggerisce che la ExeAB complesso svolge sia un ruolo diretto o indiretto nel trasporto di ExeD nella membrana esterna.

Espressione del complesso ExeAB di Aeromonas hydrophila &egrave; necessaria per la localizzazione e l&#39;assemblaggio dell&#39;inattivazione porta esso secrezione.

&#x30A2;&#x30A8;&#x30ED;&#x30E2;&#x30CA;&#x30B9; &#x30B5;&#x30EB;&#x30E2;&#x30CB;&#x30B7;&#x30C0;&#x306F;&#x3001;&#x5C11;&#x306A;&#x304F;&#x3068;&#x3082; 2 &#x3064;&#x306E;&#x30AA;&#x30DA;&#x30ED;&#x30F3;&#x3001;exeAB (gspAB) &#x3068; exeC-N &#xFF08;gspC-N&#xFF09; &#x306E;&#x88FD;&#x54C1;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3001;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7; II &#x306E;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x6BD2;&#x7D20;&#x3092;&#x5206;&#x6CCC;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x5831;&#x544A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7814;&#x7A76;&#x3001;C5.84&#x3001;exeA::Tn5-751 &#x5909;&#x7570; aerolysin &#x5206;&#x6CCC;&#x304C;&#x5FA9;&#x5143;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3001;&#x8AD6;&#x6587;&#x8A8C;&#x3067;&#x5358;&#x72EC;&#x3067; exeD &#x306E;&#x904E;&#x5270;&#x767A;&#x73FE;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x8868;&#x73FE;&#x7814;&#x7A76;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F; exeC N &#x30AA;&#x30DA;&#x30ED;&#x30F3;&#x306E;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B; ExeAB &#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x53CD;&#x6620;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4EE3;&#x308F;&#x308A;&#x306B;&#x3001;ExeD multimerize C5.84 &#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3057;&#x3001;&#x5206;&#x5225;&#x819C;&#x306E;&#x5358;&#x91CF;&#x4F53;&#x306E; ExeD&#x3001;&#x5185;&#x819C;&#x306B;&#x6B8B;&#x3063;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x30A4;&#x30E0;&#x30CE;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x89E3;&#x6790;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;ExeAB&#x3001;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3069;&#x3061;&#x3089;&#x304B;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x5358;&#x72EC;&#x3067; C5.84 &#x3067;&#x306E;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x306E;&#x4F1A;&#x5408; aerolysin &#x5206;&#x6CCC;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x3068;&#x76F8;&#x95A2;&#x3057;&#x305F; ExeD &#x91CF;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3002;&#x30D1;&#x30EB;&#x30B9;&#x8FFD;&#x8DE1;&#x5206;&#x6790;&#x306F;&#x307E;&#x305F; ExeAB &#x306E;&#x8A98;&#x5C0E;&#x4EE5;&#x524D;&#x306B;&#x84C4;&#x7A4D;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30E2;&#x30CE;&#x30DE;&#x30FC; ExeD &#x306E;&#x591A;&#x91CF;&#x4F53;&#x5F62;&#x6210;&#x3092;&#x8A31;&#x53EF;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x63D0;&#x6848;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;ExeD&#x3001;&#x904E;&#x5270;&#x751F;&#x6210; C5.84 &#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x305D;&#x308C; multimerized ExeAB &#x306E;&#x306A;&#x3044;&#x5834;&#x5408;&#x3067;&#x3082;&#x3001;&#x6700;&#x3082;&#x5185;&#x90E8;&#x306E;&#x819C;&#x306B;&#x6B8B;&#x3063;&#x305F;&#x304C;&#x3001;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x5916;&#x819C;&#x3067;&#x3001;&#x904E;&#x5270;&#x751F;&#x6210;&#x306E;&#x5916;&#x5074;&#x306E;&#x819C;&#x3068;&#x3092;&#x5206;&#x5225;&#x3068;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;&#x91CF;&#x3092;&#x7D30;&#x80DE;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;ExeAB &#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306E;&#x5206;&#x6CCC;&#x6B20;&#x9665;&#x304C;&#x5916;&#x819C;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B; ExeD &#x306E;&#x30BB;&#x30AF;&#x30EC;&#x30C1;&#x30F3;&#x3092;&#x7D44;&#x307F;&#x7ACB;&#x3066;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x306A;&#x3044;&#x3053;&#x3068;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x5506;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30EA;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3068;&#x591A;&#x91CF;&#x4F53;&#x5F62;&#x6210;&#x306E;&#x6B32;&#x3057;&#x304C;&#x308C;&#x3070; ExeD &#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x306F;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x8907;&#x96D1;&#x306A; ExeAB &#x3069;&#x3061;&#x3089;&#x304B;&#x76F4;&#x63A5;&#x7684;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x9593;&#x63A5;&#x7684;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x679C;&#x305F;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B; ExeD &#x306E;&#x5916;&#x5074;&#x306E;&#x819C;&#x3078;&#x306E;&#x8F38;&#x9001;&#x306E;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x5F0F;&#x30A2;&#x30A8;&#x30ED;&#x30E2;&#x30CA;&#x30B9; &#x30B5;&#x30EB;&#x30E2;&#x30CB;&#x30B7;&#x30C0;&#x306E; ExeAB &#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x5C40;&#x5728;&#x3068;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA; ExeD &#x5206;&#x6CCC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x591A;&#x91CF;&#x4F53;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5FC5;&#x8981;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

Aeromonas hydrophila &#xC801;&#xC5B4;&#xB3C4; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; operons, exeAB (gspAB) &#xBC0F; exeC-N (gspC N)&#xC758; &#xC81C;&#xD488; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xC720;&#xD615; II &#xD1B5;&#xB85C; &#xD1B5;&#xD574; &#xB3C5; &#xC18C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; secretes. &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0; &#xBCF4;&#xACE0; &#xB41C; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; aerolysin &#xBD84; &#xBE44;&#xB294; C5.84, exeA::Tn5-751 &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xB97C; &#xBCF5;&#xC6D0;, &#xC778;&#xCC9C;&#xD56D;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD63C;&#xC790; exeD&#xC758; overexpression&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC2DD; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xD45C;&#xC2DC; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; exeC N &#xC624; &#xD398;&#xB860;&#xC758; &#xC870;&#xC808;&#xC5D0; Exeab&#xC758; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xBC18;&#xC601; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC558;&#xB2E4;. &#xB300;&#xC2E0;, immunoblot &#xBD84;&#xC11D; Exed&#xC5D0;&#xC11C; C5.84, multimerize &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC558;&#xACE0; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9;&#xC758; &#xBD84;&#xB958; monomeric ExeD &#xB0B4;&#xBD80; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xB0A8;&#xC544; &#xBCF4;&#xC600;&#xB2E4; &#xBCF4;&#xC600;&#xB2E4;. ExeAB, &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; C5.84&#xC5D0; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD63C;&#xC790; &#xD558;&#xC9C0; &#xC5B4;&#xB290; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC2DD; multimeric ExeD, aerolysin &#xBD84; &#xBE44;&#xC758; &#xC99D;&#xAC00;&#xC640; &#xC0C1;&#xAD00;&#xC758; &#xC591;&#xC744; &#xC99D;&#xAC00; &#xADC0;&#xCC29;&#xB418; &#xC5C8; &#xB2E4;. &#xD384;&#xC2A4; &#xCCB4;&#xC774;&#xC2A4; &#xBD84;&#xC11D;&#xC740; &#xB610;&#xD55C; ExeAB &#xC720;&#xB3C4; &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xCD95;&#xC801; &#xB41C; &#xB2E8;&#xC704;&#xCCB4; Exed&#xC758; multimerization &#xD5C8;&#xC6A9; &#xC81C;&#xC548; &#xD588;&#xB2E4;. Overproducing ExeD, C5.84 &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xADF8;&#xAC83;&#xC740; Exeab&#xC758; &#xBD80;&#xC7AC;&#xC5D0;&#xB3C4; multimerized&#xB294; overproducing&#xC758; &#xBC14;&#xAE65;&#xCABD; &#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C; &#xC57C;&#xC0DD;-&#xD0C0;&#xC785; &#xC678;&#xBD80; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9;&#xC5D0;&#xC11C; fractionated&#xB294; &#xBE44;&#xC2B7;&#xD55C; &#xAE08;&#xC561; &#xC140;&#xC758; &#xAC00;&#xC7A5; &#xC548;&#xCABD; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xB0A8;&#xC544;, &#xBE44;&#xB85D; &#xD558;&#xB294; &#xACE0;. &#xC774; &#xACB0;&#xACFC; exeAB &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xCCB4;&#xC758; &#xBD84; &#xBE44; &#xACB0;&#xD568;&#xC774; &#xBC14;&#xAE65;&#xCABD; &#xB9C9;&#xC5D0;&#xC11C; ExeD secretin &#xC870;&#xB9BD; &#xD558;&#xB294; &#xBB34; &#xB2A5;&#xB825;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; &#xBC0F; &#xCD94;&#xAC00; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; overproduced ExeD multimerization &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; ExeAB &#xC911; &#xD558;&#xB098;&#xB97C; &#xC9C1;&#xC811; &#xB610;&#xB294; &#xAC04;&#xC811;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC5ED;&#xD560; &#xC678;&#xBD80; &#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C; Exed&#xC758; &#xC804;&#xC1A1;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD65C;&#xC57D; &#xD558;&#xB294; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Aeromonas hydrophila ExeAB &#xBCF5;&#xD569; &#xC2DD;&#xC740; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; &#xBC0F; ExeD &#xBD84; &#xBE44; &#xD3EC;&#xD2B8; multimer&#xC758; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD544;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Aeromonas hydrophila segrega toxinas prote&iacute;na v&iacute;a el camino de tipo II, relacionados con los productos de al menos dos operones, exeAB (gspAB) y exeC-N (gspC-N). En los estudios divulgados aqu&iacute;, fue restaurada la secreci&oacute;n de aerolysin a C5.84, un mutante exeA::Tn5-751, por la sobreexpresi&oacute;n de exeD sola en transporte. expresi&oacute;n estudios indicaron que estos resultados no reflejaba un papel de ExeAB en la regulaci&oacute;n del operon exeC-N. En cambio, an&aacute;lisis de immunoblot demostr&oacute; que ExeD hizo no multimerize en C5.84, y el fraccionamiento de las membranas demostr&oacute; que el ExeD monom&eacute;rica permaneci&oacute; en la membrana interna. Expresi&oacute;n de ExeAB, pero no cualquier prote&iacute;na solamente, de un pl&aacute;smido en C5.84 dio lugar a aumentos en la cantidad de multim&eacute;rica ExeD, que correlaciona con el aumento de la secreci&oacute;n de aerolysin. Pulso-persiga el an&aacute;lisis tambi&eacute;n sugiri&oacute; que la inducci&oacute;n de ExeAB hab&iacute;a permitido multimerization de mon&oacute;mero previamente acumulado ExeD. En las c&eacute;lulas C5.84 superproductoras ExeD, multimerized incluso en la ausencia de ExeAB y, aunque m&aacute;s permaneci&oacute; en la membrana interna, una cantidad similar a la que en membranas externas salvaje-tipo fraccionada con la membrana externa de la sobreproducci&oacute;n de las c&eacute;lulas. Estos resultados indican que el defecto de la secreci&oacute;n de exeAB mutantes es el resultado de una incapacidad para montar la secretina ExeD en la membrana externa. La localizaci&oacute;n y multimerization de sobreprodujo ExeD en estos mutantes m&aacute;s sugiere que el complejo de ExeAB desempe&ntilde;a bien su papel directo o indirecto en el transporte de ExeD en la membrana externa.

Expresi&oacute;n del complejo ExeAB de Aeromonas hydrophila se requiere para la localizaci&oacute;n y el montaje de la secreci&oacute;n ExeD Puerto multimer.

&#x5C0F;&#x5355;&#x4F53;&#x9176;&#x5BF9;&#x65E9;&#x671F; endosomes &#x548C;&#x529F;&#x80FD;&#x7684;&#x56CA;&#x6CE1;&#x878D;&#x5408;&#x4E8B;&#x4EF6;&#x672C;&#x5730;&#x5316; Rab5 &#x548C; Rab4&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B; Rab &#x86CB;&#x767D;&#x8C03;&#x8282;&#x5185;&#x541E;&#x4F5C;&#x7528;&#x548C;&#x56DE;&#x6536;&#x6216;&#x9000;&#x5316;&#x7684;&#x6D3B;&#x6027;&#x53D7;&#x4F53;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6FC0;&#x9176;&#x5982;&#x8840;&#x5C0F;&#x677F;&#x884D;&#x751F;&#x7684;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x4F53; (&#x53CA;&#x5176;)&#x3002;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;-3 &#x6FC0;&#x9176;&#x7B2C; p85alpha &#x4E9A;&#x5355;&#x4F4D;&#x5305;&#x542B;&#x5E8F;&#x5217;&#x540C;&#x6E90;&#x86CB;&#x767D;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x86CB;&#x767D; (&#x7A7A;&#x767D;) &#x5230;&#x6CE2;&#x9ED1;&#x57DF;&#x4F46;&#x4E0D;&#x662F;&#x4EE5;&#x524D;&#x5DF2;&#x8868;&#x660E;&#x62E5;&#x6709;&#x5DEE;&#x8DDD;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x62A5;&#x544A;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8868;&#x660E;&#xFF0C;p85alpha &#x6709;&#x5DEE;&#x8DDD;&#x6D3B;&#x52A8;&#x671D;&#x7740; Rab5&#x3001; Rab4&#x3001; Rac1 &#x548C; Cdc42 &#x548C;&#x8F83;&#x5C0F;&#x7A0B;&#x5EA6;&#x4E0A; Rab6&#xFF0C;&#x4E0E;&#x5BF9; Rab11 &#x7684;&#x5C0F;&#x5DEE;&#x8DDD;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x7EAF;&#x5316;&#x91CD;&#x7EC4; Rab5 &#x548C; p85alpha &#x53EF;&#x4EE5;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x76F4;&#x63A5;&#x5411;&#x5BF9;&#x65B9;&#x5E76;&#x4E0D;&#x4EE4;&#x4EBA;&#x60CA;&#x8BB6;&#xFF0C;p85alpha &#x7F16;&#x7801;&#x7684;&#x5DEE;&#x8DDD;&#x6D3B;&#x52A8;&#x662F;&#x5728;&#x6CE2;&#x9ED1;&#x7684;&#x57DF;&#x4E2D;&#x3002;&#x56E0;&#x4E3A; p85alpha &#x671F;&#x95F4;&#x53D7;&#x4F53;&#x541E;&#x505C;&#x7559;&#x5230;&#x53CA;&#x5176;&#x7ED1;&#x5B9A;&#xFF0C;p85alpha &#x5C06;&#x8FD8;&#x5230;&#x540C;&#x4E00; Rab5 &#x548C; Rab4 &#x4F5C;&#x4E3A;&#x65E9;&#x671F; endosomal &#x9694;&#x5BA4;&#x8FDB;&#x884C;&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x3002;&#x4E24;&#x8005;&#x5408;&#x8BA1;&#xFF0C;&#x7269;&#x7406;&#x7684;&#x4EA4;&#x611F;&#x795E;&#x7ECF;&#x548C; p85alpha &#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x4F18;&#x5148;&#x523A;&#x6FC0; Rab5 &#x548C; Rab4 &#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x4E0B;&#x8C03;&#x8868;&#x660E;&#x89C4;&#x7BA1;&#x591A;&#x4E45; Rab5 &#x7684; p85alpha &#x548C; Rab4 &#x7559;&#x5728;&#x4ED6;&#x4EEC; GTP &#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684;&#x6D3B;&#x52A8;&#x72B6;&#x6001;&#x3002;&#x8868;&#x793A;&#x6CE2;&#x9ED1;&#x57DF;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x7684; p85 &#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x663E;&#x793A;&#x53CA;&#x5176;&#x9000;&#x5316;&#xFF0C;&#x800C;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; p85 &#x8868;&#x793A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7684;&#x51CF;&#x5C11;&#x7684;&#x7387;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x4E5F;&#x663E;&#x793A;&#x6301;&#x7EED;&#x7684;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x4E1D;&#x88C2;&#x7D20;&#x6D3B;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x6FC0;&#x9176;&#x548C; Akt &#x901A;&#x8DEF;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;p85alpha &#x86CB;&#x767D;&#x53EF;&#x80FD;&#x901A;&#x8FC7; Rab5 &#x548C; Rab4 &#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x5468;&#x671F;&#x65F6;&#x95F4;&#x63A7;&#x5236;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x53D7;&#x4F53;&#x4E0B;&#x8C03;&#x4E2D;&#x53D1;&#x6325;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;-3 &#x6FC0;&#x9176;&#x7B2C; p85alpha &#x4E9A;&#x57FA;&#x5C06;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x5E76;&#x523A;&#x6FC0; Rab &#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x9176;&#x53C2;&#x4E0E;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;

Rab5 and Rab4 are small monomeric GTPases localized on early endosomes and function in vesicle fusion events. These Rab proteins regulate the endocytosis and recycling or degradation of activated receptor tyrosine kinases such as the platelet-derived growth factor receptor (PDGFR). The p85alpha subunit of phosphatidylinositol 3'-kinase contains a BH domain with sequence homology to GTPase activating proteins (GAPs), but has not previously been shown to possess GAP activity. In this report, we demonstrate that p85alpha has GAP activity toward Rab5, Rab4, Cdc42, Rac1 and to a lesser extent Rab6, with little GAP activity toward Rab11. Purified recombinant Rab5 and p85alpha can bind directly to each other and not surprisingly, the p85alpha-encoded GAP activity is present in the BH domain. Because p85alpha stays bound to the PDGFR during receptor endocytosis, p85alpha will also be localized to the same early endosomal compartment as Rab5 and Rab4. Taken together, the physical co-localization and the ability of p85alpha to preferentially stimulate the down-regulation of Rab5 and Rab4 GTPases suggests that p85alpha regulates how long Rab5 and Rab4 remain in their GTP-bound active state. Cells expressing BH domain mutants of p85 show a reduced rate of PDGFR degradation as compared with wild type p85 expressing cells. These cells also show sustained activation of the mitogen-activated protein kinase and Akt pathways. Thus, the p85alpha protein may play a role in the down-regulation of activated receptors through its temporal control of the GTPase cycles of Rab5 and Rab4.

The p85alpha subunit of phosphatidylinositol 3'-kinase binds to and stimulates the GTPase activity of Rab proteins.

Rab5 et Rab4 sont des petites GTPases monom&egrave;re localis&eacute;es sur les endosomes pr&eacute;coces et fonction dans les ph&eacute;nom&egrave;nes de fusion de v&eacute;sicules. Ces prot&eacute;ines Rab r&eacute;glementent l&#39;endocytose et le recyclage ou la d&eacute;gradation d&#39;activ&eacute;s r&eacute;cepteurs tyrosine kinases, telles que le r&eacute;cepteur du facteur de croissance d&eacute;riv&eacute; des plaquettes (PDGFR). La sous-unit&eacute; p85alpha de phosphatidylinositol 3-kinase contient un domaine BH avec une homologie de s&eacute;quence de lancement de GTPase prot&eacute;ines (lacunes), mais n&#39;a pas &eacute;t&eacute; d&eacute;montr&eacute; &agrave; poss&eacute;der une activit&eacute; GAP. Dans ce rapport, nous d&eacute;montrons que p85alpha a une activit&eacute; GAP vers Rab5, Rab4, Cdc42, Rac1 et dans une moindre mesure Rab6, avec peu d&#39;activit&eacute; GAP vers Rab11. Purifi&eacute; recombinant Rab5 et p85alpha pouvez lier directement les uns aux autres et sans surprise, l&#39;activit&eacute; GAP p85alpha cod&eacute; est pr&eacute;sente dans le domaine de la BH. Parce que p85alpha reste li&eacute; &agrave; la PDGFR durant l&#39;endocytose des r&eacute;cepteurs, p85alpha sera &eacute;galement &ecirc;tre localis&eacute;e au m&ecirc;me compartiment endosomal pr&eacute;coce comme Rab5 et Rab4. Pris ensemble, la colocalisation physique et la capacit&eacute; de p85alpha de stimulent pr&eacute;f&eacute;rentiellement la r&eacute;gulation &agrave; la baisse de Rab5 et Rab4 GTPases sugg&egrave;re que p85alpha r&eacute;gule combien de temps Rab5 et Rab4 conservent leur &eacute;tat actif GTP li&eacute; aux. Les cellules exprimant des mutants domaine BH de p85 montrent un taux r&eacute;duit de la d&eacute;gradation de la PDGFR comparativement &agrave; p85 de type sauvage exprimant des cellules. Ces cellules montrent &eacute;galement une activation soutenue des mitogen-activated protein kinase Akt voies. Ainsi, la prot&eacute;ine de p85alpha peut jouer un r&ocirc;le dans la r&eacute;gulation des r&eacute;cepteurs activ&eacute;s par le biais de son contr&ocirc;le temporelle des cycles GTPase de Rab5 et Rab4.

La sous-unit&eacute; p85alpha de phosphatidylinositol 3-kinase lie &agrave; et stimule l&#39;activit&eacute; GTPase de prot&eacute;ines Rab.

Die p85alpha Untereinheit der Phosphatidylinositol 3&#x26;#39;-Kinase bindet an und stimuliert die GTPase-Aktivit&#xE4;t von Rab-Proteinen.

Rab5 e Rab4 sono piccolo GTPases monomerico localizzata su early endosomes e funzione negli eventi di fusione della vescicola. Queste proteine Rab regolano l&#39;endocitosi e il riciclaggio o la degradazione di chinasi tirosina del recettore attivato come il recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFR). La subunit&agrave; p85alpha del fosfatidilinositolo 3-chinasi contiene un dominio BH con omologia di sequenza di GTPase attivando proteine (lacune), ma non &egrave; stato precedentemente dimostrata di possedere attivit&agrave; GAP. In questa relazione, dimostreremo che p85alpha ha attivit&agrave; GAP verso Rab5, Rab4, Cdc42, Rac1 e in misura minore Rab6, con poca attivit&agrave; GAP verso Rab11. Purificato ricombinante Rab5 e p85alpha possono legarsi direttamente a vicenda e non sorprendentemente, l&#39;attivit&agrave; GAP p85alpha codificato &egrave; presente nel dominio BH. Perch&eacute; p85alpha rimane legato al PDGFR durante endocitosi recettore, p85alpha verr&agrave; localizzato anche al vano endosomal primi stesso come Rab5 e Rab4. Presi insieme, la collocazione fisica e la capacit&agrave; di stimolare preferenzialmente la down-regulation di Rab5 e Rab4 GTPases p85alpha suggerisce che p85alpha regola quanto tempo Rab5 e Rab4 rimangono nel loro stato attivo associato a GTP. Le cellule che esprimono mutanti dominio BH di p85 mostrano un ridotto tasso di degradazione della PDGFR, rispetto al wild type p85, esprimendo le cellule. Queste cellule mostrano anche sostenuta attivazione della chinasi di proteina mitogene-attivata e percorsi di Akt. Cos&igrave;, la proteina p85alpha pu&ograve; svolgere un ruolo in down-regulation dei recettori attivati attraverso il suo controllo temporale dei cicli GTPasi Rab5 e Rab4.

La subunit&agrave; p85alpha del fosfatidilinositolo 3-chinasi si lega a e stimola l&#39;attivit&agrave; delle proteine Rab GTPasi.

Rab5 &#x3068; Rab4 &#x65E9;&#x671F;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x3068;&#x5C0F;&#x80DE;&#x306E;&#x878D;&#x5408;&#x30A4;&#x30D9;&#x30F3;&#x30C8;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306B;&#x95A2;&#x3059;&#x308B;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BA;&#x5358;&#x91CF;&#x4F53; Gtpase &#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089; Rab &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306F;&#x3001;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x3068;&#x30EA;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x8840;&#x5C0F;&#x677F;&#x7531;&#x6765;&#x5897;&#x6B96;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53; &#xFF08;&#x2171; &#x76F8;&#x8A66;&#x9A13;&#xFF09; &#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x52A3;&#x5316;&#x3092;&#x5236;&#x5FA1;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;P85alpha &#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8; &#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB; 3&#39;-&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x914D;&#x5217;&#x76F8;&#x540C;&#x6027; gtp &#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA; &#xFF08;&#x30AE;&#x30E3;&#x30C3;&#x30D7;&#xFF09; &#x3092;&#x6301;&#x3064; BH &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x30AE;&#x30E3;&#x30C3;&#x30D7;&#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x3092;&#x6240;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x4EE5;&#x524D;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x5831;&#x544A;&#x3067;&#x306F;, &#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x30AE;&#x30E3;&#x30C3;&#x30D7;&#x6D3B;&#x52D5;&#x306B;&#x5411;&#x3051;&#x3066; Rab5&#x3001;Rab4&#x3001;Cdc42&#x3001;Rac1 &#x3068; Rab11 &#x306B;&#x5411;&#x304B;&#x3063;&#x3066;&#x5C11;&#x3057;&#x30AE;&#x30E3;&#x30C3;&#x30D7;&#x6D3B;&#x52D5;&#x3067;&#x3088;&#x308A;&#x5C11;&#x306A;&#x3044;&#x7A0B;&#x5EA6;&#x306B; Rab6&#x3001;&#x305D;&#x306E; p85alpha &#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3092;&#x30C7;&#x30E2;&#x30F3;&#x30B9;&#x30C8;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048; Rab5 &#x306E;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3057; p85alpha &#x306F;&#x76F8;&#x4E92;&#x306B;&#x76F4;&#x63A5;&#x3068;&#x5F53;&#x7136;&#x306E;&#x3053;&#x3068;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3001;p85alpha &#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9; &#x30AE;&#x30E3;&#x30C3;&#x30D7;&#x6D3B;&#x52D5;&#x306F; BH &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x5185;&#x306B;&#x5B58;&#x5728;&#x3067;&#x3059;&#x3002;P85alpha &#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x4E2D; &#x2171; &#x76F8;&#x8A66;&#x9A13;&#x306B;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x307E;&#x307E;&#x306A;&#x306E;&#x3067;&#x3001;p85alpha &#x306B;&#x540C;&#x3058;&#x521D;&#x671F;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0; &#x30B3;&#x30F3;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8; Rab5 &#x3068; Rab4 &#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3082;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BA;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E00;&#x7DD2;&#x306B;&#x53D6;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3001;&#x7269;&#x7406;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x3068;&#x512A;&#x5148;&#x7684; Rab5 &#x3068; Rab4 &#x8F38;&#x9001;&#x306E;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3;&#x30EC;&#x30AE;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x523A;&#x6FC0;&#x3059;&#x308B; p85alpha &#x306E;&#x80FD;&#x529B;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3069;&#x306E;&#x304F;&#x3089;&#x3044; Rab5 p85alpha &#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3057;&#x3066; Rab4 &#x306E; gtp &#x306E;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306A;&#x72B6;&#x614B;&#x3067;&#x6B8B;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;P85 &#x306E; BH &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x7D30;&#x80DE;&#x767A;&#x73FE;&#x7D30;&#x80DE; &#x2171; &#x76F8;&#x8A66;&#x9A13;&#x52A3;&#x5316;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; p85 &#x306B;&#x6BD4;&#x3079;&#x3066;&#x524A;&#x6E1B;&#x7387;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x306F;&#x307E;&#x305F; mitogen &#x4F5C;&#x52D5;&#x3057;&#x305F;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x304A;&#x3088;&#x3073; Akt &#x7D4C;&#x8DEF;&#x306E;&#x6301;&#x7D9A;&#x7684;&#x306A;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;p85alpha &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3;&#x898F;&#x5236;&#x305D;&#x306E; Rab5 &#x3068; Rab4 &#x306E; gtp &#x30A2;&#x30FC;&#x30BC; &#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x306E;&#x6642;&#x9593;&#x7684;&#x5236;&#x5FA1;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x679C;&#x305F;&#x3059;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

P85alpha &#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8; &#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB; 3&#39;-&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x3001;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA; Rab GTPase &#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x523A;&#x6FC0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

Rab5&#xC640; rab4&#xB294; &#xCD08;&#xAE30; endosomes &#xAE30; &#xD4E8;&#xC804; &#xC774;&#xBCA4;&#xD2B8;&#xC5D0; &#xD568;&#xC218;&#xC5D0; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; &#xB41C; &#xC791;&#xC740; monomeric GTPases. &#xC774; &#xB7A9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC870;&#xC808; endocytosis &#xBC0F; &#xC7AC;&#xD65C;&#xC6A9; &#xB610;&#xB294; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; tyrosine kinases &#xD608;&#xC18C;&#xD310; &#xC720;&#xB798; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; (PDGFR) &#xB4F1;&#xC758; &#xC800;&#xD558;. Phosphatidylinositol 3&#39;-&#xD0A4;&#xC758; p85alpha &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; homology GTPase &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (&#xAC04;&#xACA9;)&#xB97C; &#xAC00;&#xC9C4; BH &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xAC2D; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744;&#xAC00;&#xC9C0;&#xACE0; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;&#xB294; p85alpha&#xAC00; Rab11 &#xD5A5;&#xD574; &#xC791;&#xC740; &#xAC2D; &#xD65C;&#xB3D9; &#xB0AE;&#xC740; &#xBC94;&#xC704; Rab6, Rab5, Rab4, Cdc42, Rac1 &#xD5A5;&#xD574; &#xAC2D; &#xD65C;&#xB3D9; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; Rab5 &#xC815;&#xD654; p85alpha &#xACE0; &#xB2F9;&#xC5F0;&#xD55C; &#xC77C;&#xB85C; &#xC11C;&#xB85C; &#xAC8C; &#xC9C1;&#xC811; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD560; &#xC218;, BH &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xC874;&#xC7AC; &#xD558;&#xB294; p85alpha &#xC778;&#xCF54;&#xB529; &#xAC2D; &#xD65C;&#xB3D9;. &#xC65C;&#xB0D0;&#xD558;&#xBA74; p85alpha &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; endocytosis &#xB3D9;&#xC548; &#xBC14;&#xC6B4;&#xB4DC;&#xB97C; PDGFR, p85alpha &#xB610;&#xD55C; Rab5 &#xBC0F; Rab4 &#xAC19;&#xC740; &#xCD08;&#xAE30; endosomal &#xAD6C;&#xD68D; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD568;&#xAED8; &#xCC0D;&#xC740; &#xC2E4;&#xC81C; co-localization&#xC640; p85alpha&#xC758; &#xB2A5;&#xB825;&#xC744; &#xC6B0;&#xC120;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; Rab5 &#xBC0F; Rab4 Gtpases&#xC758; &#xB2E4;&#xC6B4; &#xADDC;&#xC815;&#xC744; &#xC790;&#xADF9; &#xC81C;&#xC548; p85alpha &#xC870;&#xC808; &#xC5BC;&#xB9C8;&#xB098; Rab5 &#xD558; &#xACE0; Rab4 GTP &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xB41C; &#xD65C;&#xC131; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xB85C; &#xC720;&#xC9C0;. &#xC140;&#xC758; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 BH &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xD45C;&#xD604; PDGFR &#xC800;&#xD558; &#xC640;&#xC77C;&#xB4DC; &#xD615;&#xC2DD; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xBE44;&#xAD50; &#xD558; &#xC5EC; &#xD45C;&#xD604; &#xD558;&#xB294; &#xC140;&#xC758; &#xAC10;&#xC18C; &#xC18D;&#xB3C4; &#xD45C;&#xC2DC;. &#xC774; &#xC138;&#xD3EC; &#xB610;&#xD55C; &#xC9C0;&#xC18D;&#xC801;&#xC778;&#xB41C; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xBB3C;&#xC9C8; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xD55C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; &#xBC0F; Akt &#xACBD;&#xB85C; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, p85alpha &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; GTPase &#xC8FC;&#xAE30; Rab5 &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; rab4&#xC758; &#xADF8;&#xAC83;&#xC758; &#xC2DC;&#xAC04; &#xC81C;&#xC5B4;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB41C; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC758; &#xC544;&#xB798; &#xADDC;&#xC815;&#xC5D0; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Phosphatidylinositol 3&#39;-&#xD0A4;&#xC758; p85alpha &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD558;&#xACE0; &#xB7A9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; GTPase &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xC790;&#xADF9;.

Rab5 y Rab4 son peque&ntilde;as GTPasas monom&eacute;ricas localizada en endosomas tempranos y funci&oacute;n en eventos de fusi&oacute;n de ves&iacute;cula. Estas prote&iacute;nas Rab regulan la endocitosis y reciclaje o degradaci&oacute;n de tirosina quinasas de receptor activado como el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR). La subunidad p85alpha de fosfatidilinositol 3&#39;-quinasa contiene un dominio de BH con homolog&iacute;a de secuencia a GTPasa activando prote&iacute;nas (GAPs), pero no se ha demostrado previamente que poseen actividad GAP. En este informe, demostramos que p85alpha tiene brecha actividad hacia Rab5, Rab4, Cdc42, Rac1 y en menor medida Rab6, con poca actividad de brecha hacia Rab11. Purificada recombinante Rab5 y p85alpha puede enlazar directamente entre s&iacute; y no en vano, la actividad de la brecha p85alpha codificado est&aacute; presente en el dominio de BH. Porque p85alpha se queda obligado a la PDGFR durante la endocitosis del receptor, p85alpha se traducir&aacute; tambi&eacute;n en el mismo compartimiento endosomal temprano como Rab5 y Rab4. Tomados en conjunto, la co-localizaci&oacute;n f&iacute;sica y la capacidad de p85alpha para estimular preferentemente la abajo-regulaci&oacute;n de Rab5 y Rab4 GTPasas sugiere que p85alpha regula cu&aacute;nto Rab5 y Rab4 permanecen en su estado activo de GTP-limite. Las c&eacute;lulas que expresan a mutantes de dominio BH de p85 muestran una tasa reducida de degradaci&oacute;n PDGFR en comparaci&oacute;n con el tipo salvaje p85 expresando las c&eacute;lulas. Estas c&eacute;lulas tambi&eacute;n muestran activaci&oacute;n sostenida de la prote&iacute;na quinasa activada por mit&oacute;geno y v&iacute;as de Akt. As&iacute;, la prote&iacute;na p85alpha puede desempe&ntilde;ar un papel en la regulaci&oacute;n de receptores activados a trav&eacute;s de su control temporal de los ciclos de la GTPasa de Rab5 y Rab4 hacia abajo.

La subunidad p85alpha de fosfatidilinositol 3&#39;-quinasa se une a y estimula la actividad GTPasa de las prote&iacute;nas Rab.

Raf &#x6FC0;&#x9176;&#x53C2;&#x4E0E;&#x8C03;&#x8282;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x4E2D;&#x5BF9;&#x5404;&#x79CD;&#x5404;&#x6837;&#x7684;&#x5916;&#x90E8;&#x523A;&#x6FC0;&#x53CD;&#x5E94;&#x3002;&#x4E0A;&#x6E38;&#x4FE1;&#x53F7;&#x751F;&#x6210;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x7684; Ras GTP&#xFF0C;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x662F; Raf &#x6FC0;&#x9176;&#x5BF9;&#x819C;&#x7684; relocalization&#x3002;&#x5728;&#x5145;&#x5206;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x540E;, Raf &#x6FC0;&#x9176; phosphorylate &#x548C;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x4E0B;&#x6E38;&#x6FC0;&#x9176;&#x4FE1;&#x53F7;&#x901A;&#x8DEF;&#x7684;&#x4E1D;&#x88C2;&#x7D20;&#x6D3B;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x6FC0;&#x9176; (MAPK)&#x3002;Raf &#x6FC0;&#x9176;&#x7684;&#x5BB6;&#x5EAD;&#x6709;&#x4E09;&#x4E2A;&#x6210;&#x5458;&#xFF0C;&#x82F1;&#x56FD;&#x7687;&#x5BB6;&#x7A7A;&#x519B;-1 B-&#x82F1;&#x56FD;&#x7687;&#x5BB6;&#x7A7A;&#x519B;&#x548C; A-&#x82F1;&#x56FD;&#x7687;&#x5BB6;&#x7A7A;&#x519B;&#x3002;&#x82F1;&#x56FD;&#x7687;&#x5BB6;&#x7A7A;&#x519B;-1 &#x548C; B Raf &#x7ED1;&#x5B9A;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x4E1D;&#x6C28;&#x9178; (PS) &#x548C;&#x78F7;&#x8102;&#x9178; (PA) &#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x4E00;&#x76F4;&#x663E;&#x793A;&#x4EE5;&#x4FBF;&#x5229; Raf &#x819C;&#x534F;&#x4F1A;&#x548C;&#x89C4;&#x7BA1; Raf &#x6FC0;&#x9176;&#x6D3B;&#x6027;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5C5E;&#x6027; A-&#x82F1;&#x56FD;&#x7687;&#x5BB6;&#x7A7A;&#x519B;&#x7684;&#x8102;&#x8D28;&#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x4E3A;&#x7279;&#x70B9;&#x7684;&#x82F1;&#x56FD;&#x7687;&#x5BB6;&#x7A7A;&#x519B;-1&#x3002;A-&#x82F1;&#x56FD;&#x7687;&#x5BB6;&#x7A7A;&#x519B;&#x548C;&#x82F1;&#x56FD;&#x7687;&#x5BB6;&#x7A7A;&#x519B;-1 &#x53D1;&#x73B0;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230; 3&#x3001; 4 &#x548C; 5-monophosphorylated [PI (3) P PI (4) P&#xFF0C;&#x548C; (5) P PI] &#x7684;&#x808C;&#x9187;&#x548C;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;-3&#xFF0C;5-&#x4E8C;&#x78F7;&#x9178; [PI(3,5)P(2)]&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;A Raf &#x8FD8;&#x4E13;&#x95E8;&#x5230;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187; 4&#xFF0C;5-&#x548C; 3&#xFF0C;4-bisphosphates [PI(4,5)P(2) &#x548C; PI(3,4)P(2)] &#x548C;&#x7EA6;&#x675F;&#x5230;&#x5BBE;&#x5915;&#x6CD5;&#x5C3C;&#x4E9A;&#x5DDE;A Raf &#x7A81;&#x53D8;&#x5206;&#x6790;&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x4E24;&#x4E2A;&#x57FA;&#x672C;&#x6B8B;&#x7559; &#xFF08;K50 &#x548C; R52&#xFF09; Ras &#x7ED1;&#x5B9A;&#x57DF;&#x5185;&#x7684; PI(4,5)P(2) &#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684;&#x7AD9;&#x70B9;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x7F3A;&#x4E4F;&#x9996;&#x5148; 199 &#x6B8B;&#x7559;&#x7269; A Raf &#x7A81;&#x53D8; [&#x5373;&#x6574;&#x4E2A;&#x5B88;&#x6052;&#x7684;&#x5730;&#x533A; 1 (CR1) &#x57DF;] &#x7ED1;&#x5B9A;&#x76F8;&#x540C;&#x78F7;&#x8102;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x5168;&#x957F; Raf 1&#x3002;&#x8FD9;&#x8868;&#x660E; A Raf &#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x4E4B;&#x95F4; 200 &#x548C; 606 &#x7B2C;&#x4E8C;&#x4E2A;&#x533A;&#x57DF;&#x662F;&#x8D1F;&#x8D23;&#x4E0E; monophosphorylated PIs &#x548C; PI(3,5)P(2) &#x7684;&#x4E92;&#x52A8;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x63D0;&#x9AD8; Raf 1 &#x548C; A Raf &#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x7279;&#x5B9A;&#x808C;&#x9187;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E00;&#x79CD;&#x673A;&#x5236;&#x4EE5;&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x5B83;&#x4EEC;&#x7684;&#x7279;&#x5B9A;&#x819C;&#x5FAE;&#x533A;&#x5728;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x78F7;&#x8102;&#x4E30;&#x5BCC;&#x7684;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x5176;&#x8102;&#x8D28;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x914D;&#x7F6E;&#x6587;&#x4EF6;&#x4E2D;&#x7684;&#x5DEE;&#x5F02;&#x53EF;&#x80FD;&#x4E3A;&#x5176;&#x62DF;&#x8BAE;&#x7684;&#x5F02;&#x6784;&#x4F53;&#x7279;&#x5B9A; Raf &#x804C;&#x80FD;&#x4F5C;&#x51FA;&#x8D21;&#x732E;&#x3002;

&#x5173;&#x952E;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;&#x8102;&#x8D28;&#x7ED3;&#x5408;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x7684; A Raf &#x6FC0;&#x9176;&#x4E2D;&#x7684;&#x6B8B;&#x7559;&#x7684;&#x6807;&#x8BC6;&#x3002;

Raf kinases are involved in regulating cellular signal transduction pathways in response to a wide variety of external stimuli. Upstream signals generate activated Ras-GTP, important for the relocalization of Raf kinases to the membrane. Upon full activation, Raf kinases phosphorylate and activate downstream kinase in the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway. The Raf family of kinases has three members, Raf-1, B-Raf, and A-Raf. The ability of Raf-1 and B-Raf to bind phosphatidylserine (PS) and phosphatidic acid (PA) has been show to facilitate Raf membrane associations and regulate Raf kinase activity. We have characterized the lipid binding properties of A-Raf, as well as further characterized those of Raf-1. Both A-Raf and Raf-1 were found to bind to 3-, 4-, and 5-monophosphorylated phosphoinositides [PI(3)P, PI(4)P, and PI(5)P] as well as phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PI(3,5)P(2)]. In addition, A-Raf also bound specifically to phosphatidylinositol 4,5- and 3,4-bisphosphates [PI(4,5)P(2) and PI(3,4)P(2)] and to PA. A mutational analysis of A-Raf localized the PI(4,5)P(2) binding site to two basic residues (K50 and R52) within the Ras binding domain. Additionally, an A-Raf mutant lacking the first 199 residues [i.e., the entire conserved region 1 (CR1) domain] bound the same phospholipids as full-length Raf-1. This suggests that a second region of A-Raf between amino acids 200 and 606 was responsible for interactions with the monophosphorylated PIs and PI(3,5)P(2). These results raise the possibility that Raf-1 and A-Raf bind to specific phosphoinositides as a mechanism to localize them to particular membrane microdomains rich in these phospholipids. Moreover, the differences in their lipid binding profiles could contribute to their proposed isoform-specific Raf functions.

Identification of key residues in the A-Raf kinase important for phosphoinositide lipid binding specificity.

Kinases RAF sont impliqu&eacute;s dans la r&eacute;gulation des voies de transduction du signal cellulaire en r&eacute;ponse &agrave; une grande vari&eacute;t&eacute; de stimuli externes. Les signaux en amont g&eacute;n&egrave;rent Ras-GTP activ&eacute;e, important pour la relocalisation des kinases de la Raf &agrave; la membrane. Lors de l&#39;activation compl&egrave;te, kinases Raf phosphorylent et activer la kinase en aval dans la kinase mitog&egrave;ne-prot&eacute;ine (MAPK) voie de signalisation. La famille de la Raf de kinases compte trois membres, Raf-1, B-Raf et A-Raf. La capacit&eacute; de la Raf-1 et B-Raf pour lier la phosphatidyls&eacute;rine (PS) et l&#39;acide phosphatidique (PA) a &eacute;t&eacute; &eacute;mission pour faciliter les associations de membrane de Raf et de r&eacute;guler l&#39;activit&eacute; kinase Raf. Nous avons caract&eacute;ris&eacute; la liaison propri&eacute;t&eacute;s d&#39;A-Raf de lipides, ainsi caract&eacute;ris&eacute;s plus avant ceux de la Raf-1. Les A-Raf et Raf-1 ont &eacute;t&eacute; trouv&eacute;s pour lier &agrave; 3 - 4- et 5-monophosphorylated phosphoinositides [P PI (3), PI (4) P et PI P (5)] ainsi que de la phosphatidylinositol 3, 5-bisphosphate [PI(3,5)P(2)]. En outre, A-Raf &eacute;galement li&eacute;e sp&eacute;cifiquement au phosphatidylinositol 4, 5 - et 3,4-bisphosphates [PI(4,5)P(2) et PI(3,4)P(2)] et &agrave; PA Une analyse mutationnelle de Raf-A localis&eacute; le site de liaison de PI(4,5)P(2) &agrave; deux r&eacute;sidus basiques (K50 et R52) dans le domaine de liaison du Ras. En outre, un mutant A-Raf manque les r&eacute;sidus d&#39;abord 199 [c.-&agrave;-d. l&#39;enti&egrave;re r&eacute;gion conserv&eacute;e 1 (CR1) domaine] li&eacute; les phospholipides m&ecirc;mes comme Raf-1 pleine longueur. Cela sugg&egrave;re qu&#39;une seconde r&eacute;gion d&#39;A-Raf entre acides amin&eacute;s 200 et 606 &eacute;tait responsable des interactions avec les PIs de monophosphorylated et PI(3,5)P(2). Ces r&eacute;sultats soul&egrave;vent la possibilit&eacute; que Raf-1 et A-Raf se lient aux phosphoinositides sp&eacute;cifiques en tant que m&eacute;canisme de les localiser &agrave; microdomaines membranaires particuli&egrave;rement riches en ces phospholipides. En outre, les diff&eacute;rences dans leurs profils de liaison des lipides pourraient contribuer &agrave; leurs fonctions de Raf isoforme sp&eacute;cifique propos&eacute;es.

Identification des r&eacute;sidus cl&eacute;s dans la A-Raf kinase importante pour sp&eacute;cificit&eacute; de liaison des lipides phosphoinositides.

Identifizierung der wichtigsten Reste in der A-Raf-Kinase wichtig Phosphoinositid Lipid Bindungsspezifit&#xE4;t.

Chinasi di RAF sono coinvolti nella regolazione della vie di trasduzione del segnale cellulare in risposta a un&#39;ampia variet&agrave; di stimoli esterni. Segnali a Monte generano attivate Ras-GTP, importante per la relocalization della chinasi di Raf alla membrana. All&#39;attivazione completa, chinasi di Raf fosforila e attiva la chinasi a valle nella chinasi di proteina mitogene-attivata (MAPK) signaling pathway. Dispone di tre membri della famiglia di Raf chinasi, Raf-1, B-Raf e A-Raf. La capacit&agrave; di Raf-1 e B-Raf per associare acido fosfatidico (PA) e fosfatidilserina (PS) &egrave; stato spettacolo per facilitare le associazioni membrana Raf e regolano l&#39;attivit&agrave; della chinasi Raf. Noi abbiamo caratterizzato i lipidi associazione delle propriet&agrave; di A-Raf, cos&igrave; come ulteriormente caratterizzato quelle di Raf-1. Sia A-Raf e Raf-1 sono stati trovati da associare al 3 - 4- e 5-monophosphorylated phosphoinositides [PI (3) P, PI (4) P e PI (5) P] cos&igrave; come fosfatidilinositolo 3,5-bisfosfato [PI(3,5)P(2)]. Inoltre, A-Raf legato anche espressamente a fosfatidilinositolo 4,5 - e 3,4-bisphosphates [PI(4,5)P(2) e PI(3,4)P(2)] e al PA Un&#39;analisi mutazionale di A-Raf localizzato il sito di legame di PI(4,5)P(2) a due residui di base (K50 e R52) all&#39;interno del dominio di legame del Ras. Inoltre, un mutante A-Raf mancano i residui prima 199 [cio&egrave;, la regione conservata intera 1 (CR1) dominio] associato i fosfolipidi stessi come album Raf-1. Questo suggerisce che una seconda regione di A-Raf tra aminoacidi 200 e 606 era responsabile per le interazioni con il PIs monophosphorylated e PI(3,5)P(2). Questi risultati aumentare la possibilit&agrave; che Raf-1 e A-Raf associare a phosphoinositides specifici come un meccanismo per localizzare li a membrana particolare microdomains ricca di questi fosfolipidi. Inoltre, le differenze nei loro profili di associazione lipidico potrebbero contribuire alle loro funzioni di Raf isoforma specifica proposte.

Identificazione dei residui chiave nella chinasi Raf A importante per la specificit&agrave; di legame dei lipidi phosphoinositide.

Raf &#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306E;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x5916;&#x90E8;&#x523A;&#x6FC0;&#x5FDC;&#x7B54;&#x306E;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E0A;&#x6D41;&#x306E;&#x4FE1;&#x53F7;&#x306F;&#x3001;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316; Ras GTP&#x3001;Raf &#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x3078;&#x306E;&#x5C40;&#x5728;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5B8C;&#x5168;&#x306A;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x3001;Raf &#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x3092;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x3057;&#x3066;&#x4E0B;&#x6D41;&#x306E;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC; &#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x30DE;&#x30A4;&#x30C8;&#x30B8;&#x30A7;&#x30F3;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC; &#xFF08;MAPK&#xFF09; &#x3092;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;Raf &#x5BB6;&#x65CF;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E; 3 &#x3064;&#x306E;&#x30E1;&#x30F3;&#x30D0;&#x30FC;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x3001;Raf 1 B Raf &#x3068; A Raf&#x3002;Raf 1 &#x3068; B Raf &#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30BB;&#x30EA;&#x30F3; (PS) &#x3068;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30F3;&#x9178; (PA) &#x306B;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3059;&#x308B;&#x80FD;&#x529B;&#x306F;&#x3001;Raf &#x819C;&#x56E3;&#x4F53;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3057;&#x3001;Raf &#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3059;&#x308B;&#x30B7;&#x30E7;&#x30FC;&#x3092;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x304C;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0; &#x30D7;&#x30ED;&#x30D1;&#x30C6;&#x30A3; A Raf &#x306E;&#x8102;&#x8CEA;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x3057;&#x540C;&#x69D8;&#x3055;&#x3089;&#x306B; Raf 1 &#x306E;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7279;&#x5FB4;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;A Raf &#x3068;&#x7A7A;&#x8ECD; 1 &#x306F; 3-&#x3001;4 - &#x3068; 5 monophosphorylated &#x306E;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB;&#x30EA;&#x30F3;&#x8102;&#x8CEA; [PI (3) P (4) P, PI &#x3057;&#x3001;&#xFF08;5&#xFF09; P PI] &#x306B;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB; 3, 5-&#x30D3;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178; [PI(3,5)P(2)] &#x3060;&#x3051;&#x3067;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3059;&#x308B;&#x898B;&#x3064;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;A Raf &#x306F;&#x307E;&#x305F;&#x5177;&#x4F53;&#x7684;&#x306B;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB; 4, 5- &#x3068; 3, 4-bisphosphates [PI(4,5)P(2) &#x30FB; PI(3,4)P(2)] &#x3068; PA &#x3078;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x3066;A Raf &#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x89E3;&#x6790; PI(4,5)P(2) &#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0; &#x30B5;&#x30A4;&#x30C8; 2 &#x3064;&#x306E;&#x57FA;&#x672C;&#x7684;&#x306A;&#x6B8B;&#x6E23; (K50 &#x3068; R52) Ras &#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x5185;&#x306B;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BA;&#x3002;&#x307E;&#x305A; 199 &#x306E;&#x6B8B;&#x57FA;&#x3092;&#x6B20;&#x3051;&#x3066;&#x3001;A Raf &#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x307E;&#x305F;&#x3001;[&#x5168;&#x4F53;&#x306E;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30EA;&#x30FC;&#x30B8;&#x30E7;&#x30F3; 1 (CR1) &#x3059;&#x306A;&#x308F;&#x3061;&#x3001;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;] &#x30D5;&#x30EB;&#x30EC;&#x30F3;&#x30B0;&#x30B9; Raf 1 &#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x540C;&#x3058;&#x30EA;&#x30F3;&#x8102;&#x8CEA;&#x3092;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x306F;&#x3001;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178; 200 &#x3068; 606 &#x9593; A Raf &#x306E; 2 &#x756A;&#x76EE;&#x306E;&#x5730;&#x57DF; monophosphorylated &#x5C0F;&#x50E7;&#x3068; PI(3,5)P(2) &#x3068;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x8CAC;&#x4EFB;&#x304C;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;Raf 1 &#x3068; A Raf &#x306B;&#x3001;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB;&#x30EA;&#x30F3;&#x8102;&#x8CEA;&#x306B;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x8102;&#x8CEA;&#x306E;&#x8C4A;&#x304B;&#x306A;&#x7279;&#x5B9A;&#x819C;&#x306E;&#x30DF;&#x30AF;&#x30ED; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3092;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BA;&#x3059;&#x308B;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3053;&#x3068;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3092;&#x9AD8;&#x3081;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x8102;&#x8CEA;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x30EB;&#x306E;&#x9055;&#x3044;&#x306E;&#x63D0;&#x6848;&#x306E;&#x30A2;&#x30A4;&#x30BD; &#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x7279;&#x7570; Raf &#x95A2;&#x6570;&#x306B;&#x8CA2;&#x732E;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

A Raf &#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC; &#x30DB;&#x30B9;&#x30DB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C1;&#x30C9;&#x8102;&#x8CEA;&#x7D50;&#x5408;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x540C;&#x5B9A;

&#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70; kinases&#xB294; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC678;&#xBD80; &#xC790;&#xADF9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC751;&#xB2F5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC2E0;&#xD638; &#xC804;&#xB2EC; &#xACBD;&#xB85C; &#xC870;&#xC808;&#xC5D0; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C;. &#xC5C5;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB9BC; &#xC2E0;&#xD638; &#xC0DD;&#xC131; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB41C; Ras-GTP, &#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70; kinases&#xB294; &#xB9C9;&#xC758; relocalization&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C;. &#xC644;&#xC804; &#xD55C; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB418; &#xBA74; &#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70; kinases phosphorylate &#xBC0F; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xACBD;&#xB85C; &#xC2E0;&#xD638; &#xBB3C;&#xC9C8; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xD55C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD0A4; (MAPK)&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E4;&#xC6B4;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB9BC; &#xB2C8;. Kinases&#xC758; &#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70; &#xAC00;&#xC871;&#xC740; &#xC138; &#xBA64;&#xBC84;, &#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70; 1 B-&#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70; &#xBC0F; A-&#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70;. &#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70;-1&#xACFC; B-&#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70; phosphatidylserine (PS) &#xBC0F; phosphatidic &#xC0B0; (PA)&#xC758; &#xB2A5;&#xB825; &#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70; &#xB9C9; &#xC5F0;&#xACB0;&#xC744; &#xCD09;&#xC9C4; &#xD558; &#xACE0; Raf kinase &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xADDC;&#xC81C; &#xD558;&#xB294; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC18D;&#xC131; A Raf&#xC758; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xD2B9;&#xC9D5;&#xC73C;&#xB85C; &#xB354; &#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70; 1&#xC758; &#xD2B9;&#xC9D5;. A-&#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70; &#xBC0F; &#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70; 1 &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C;, phosphatidylinositol 3, 5-bisphosphate [PI(3,5)P(2)] 3 &#xCD95;, 4 &#xCD95; &#xBC0F; 5-monophosphorylated phosphoinositides [&#xD30C;&#xC774; (3) P (4) P, &#xD30C;&#xC774; &#xD30C;&#xC774; (5) P]&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD560; &#xBC1C;&#xACAC; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, A &#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70; &#xB610;&#xD55C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xB41C; &#xC544;&#xBE60; &#xD558; &#xACE0; &#xD2B9;&#xBCC4;&#xD788; &#xD558; phosphatidylinositol 4, 5-&#xBC0F; 3, 4-bisphosphates [PI(4,5)P(2) &#xBC0F; PI(3,4)P(2)] A-&#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70; mutational &#xBD84;&#xC11D; Ras &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xB0B4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xAE30;&#xBCF8; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; (K50 &#xBC0F; R52)&#xB97C; PI(4,5)P(2) &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654;. &#xB610;&#xD55C;, A &#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xCC98;&#xC74C; 199 &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; &#xBD80;&#xC871; [&#xC989;, &#xC804;&#xCCB4; &#xBCF4;&#xC874;&#xB41C; &#xC9C0;&#xC5ED; 1 (CR1) &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;] &#xC804;&#xCCB4; &#xAE38;&#xC774; &#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70; 1 &#xAC19;&#xC740; &#xC778;&#xC9C0;&#xC9C8; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xB41C;. &#xC774;&#xAC83;&#xC740; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0;&#xC774; 200 606 &#xC0AC;&#xC774; A Raf&#xC758; &#xB450; &#xBC88;&#xC9F8; &#xC9C0;&#xC5ED; monophosphorylated Pis&#xC640; PI(3,5)P(2)&#xC640;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCC45;&#xC784;&#xC744; &#xC9C0;&#xC9C0; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xACB0;&#xACFC; &#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70; 1&#xACFC; A &#xACF5;&#xAD70; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD560; &#xD2B9;&#xC815; phosphoinositides &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC73C;&#xB85C; &#xD2B9;&#xC815; &#xB9C9; microdomains &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC778;&#xC9C0;&#xC9C8;&#xC774; &#xD48D;&#xBD80;&#xC5D0; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131; &#xC81C;&#xAE30;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC9C0;&#xC9C8; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD504;&#xB85C;&#xD544;&#xC758; &#xCC28;&#xC774; &#xC81C;&#xC548;&#xB41C; isoform &#xAD00;&#xB828; &#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xAE30;&#xC5EC;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

A Raf kinase phosphoinositide &#xC9C0;&#xC9C8; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xD575;&#xC2EC; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC758; &#xC2DD;&#xBCC4;.

Quinasas raf est&aacute;n implicadas en la regulaci&oacute;n de las v&iacute;as de transducci&oacute;n de se&ntilde;al celular en respuesta a una amplia variedad de est&iacute;mulos externos. Se&ntilde;ales ascendente generan Ras activado-GTP, importante para la relocalizaci&oacute;n de quinasas Raf a la membrana. Aer&oacute;bica, quinasas Raf fosforilan y activan quinasas aguas abajo de la quinasa de prote&iacute;nas activadas por mit&oacute;genos (MAPK) v&iacute;a de se&ntilde;alizaci&oacute;n. La familia de la Royal Air Force de quinasas tiene tres miembros, Raf-1, B-Raf y A-Royal Air Force. La capacidad de la Royal Air Force-1 y B-Raf para enlazar la fosfatidilserina (PS) y el &aacute;cido fosfat&iacute;dico (PA) ha sido facilitar asociaciones de membrana de Raf y regular la actividad de la quinasa Raf. Nos hemos caracterizado los l&iacute;pidos vinculante propiedades de A-Royal Air Force, as&iacute; como m&aacute;s caracterizado de la Royal Air Force-1. Tanto A-Royal Air Force y Royal Air Force-1 fueron encontrado para atar a 3, 4 y 5-monophosphorylated fosfoinos&iacute;tidos [P PI (3), PI (4) P y PI (5) P] as&iacute; como fosfatidilinositol 3, 5-bifosfato [PI(3,5)P(2)]. Adem&aacute;s, A-Raf obligado tambi&eacute;n espec&iacute;ficamente a Fosfatidilinositol 4, 5 - y 3,4-bifosfonatos [PI(4,5)P(2) y PI(3,4)P(2)] y PA Un an&aacute;lisis mutacional de la Air Force A hab&iacute;a localizado el sitio de uni&oacute;n de PI(4,5)P(2) a dos residuos b&aacute;sicos (K50 y R52) dentro del dominio de uni&oacute;n de Ras. Adem&aacute;s, un mutante de la Air Force A carecer los residuos primero 199 [es decir, toda la regi&oacute;n conservada 1 (CR1) dominio] obligado los mismos fosfol&iacute;pidos como largometraje Raf-1. Esto sugiere que una segunda regi&oacute;n de A-Royal Air Force entre amino&aacute;cidos 200 y 606 era responsable de las interacciones con el PIs de monophosphorylated y PI(3,5)P(2). Estos resultados plantean la posibilidad que Raf-1 y A-Raf unen a fosfoinos&iacute;tidos espec&iacute;ficos como un mecanismo para localizarles a microdominios de membrana particular rico en estos fosfol&iacute;pidos. Por otra parte, las diferencias en sus perfiles de uni&oacute;n de l&iacute;pidos podr&iacute;an contribuir a sus funciones de Raf isoforma espec&iacute;ficos propuestas.

Identificaci&oacute;n de residuos claves en la quinasa Raf A importante de fosfatidilinositol especificidad de uni&oacute;n de l&iacute;pidos.

Src &#x540C;&#x6E90; 2 (SH2) &#x7684;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;-3 &#x6FC0;&#x9176;&#x7684; p85 &#x4E9A;&#x57FA;&#x57DF;&#x8868;&#x660E;&#x8981;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x78F7;&#x9178;&#x8840;&#x5C0F;&#x677F;&#x884D;&#x751F;&#x7684;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x4F53; (&#x53CA;&#x5176;)&#x3002;&#x4EE5;&#x524D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x6F14;&#x793A;&#x4E86; p85 SH2 &#x57DF;&#x4E5F;&#x53EF;&#x4EE5;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x4E1D;&#x6C28;&#x9178;/&#x82CF;&#x6C28;&#x9178;&#x6FC0;&#x9176; A Raf &#x901A;&#x8FC7;&#x72EC;&#x7279;&#x7684;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x72EC;&#x7ACB;&#x7684;&#x4EA4;&#x4E92;&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x62A5;&#x544A;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x63CF;&#x8FF0;&#x65B0;&#x7684;&#x72EC;&#x7ACB;&#x4E8E;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x7684; p85 SH2-&#x7ED3;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x951A; 3 (Ank3)&#x3002;&#x4E00;&#x822C;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0B;&#xFF0C;ankyrins &#x4E3A;&#x670D;&#x52A1;&#x901A;&#x8FC7;&#x5C06;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x5728;&#x7EC6;&#x80DE;&#x819C;&#x548C;&#x8840;&#x5F71;/fodrin &#x8FD9;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x53EF;&#x5206;&#x5272;&#x7684;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x9AA8;&#x67B6;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x8F83;&#x5C0F;&#x7684;&#x4E9A;&#x578B;&#x7684; Ank3 &#x7F3A;&#x4E4F;&#x819C;&#x57DF;&#x548C;&#x665A; endosomes &#x548C;&#x6EB6;&#x9176;&#x4F53;&#x88AB;&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#xFF0C;p85 &#x7ED1;&#x5B9A;&#x76F4;&#x63A5;&#x5411;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5C0F; 120-&#x548C; 105-kDa Ank3 &#x5F02;&#x6784;&#x4F53;&#x3002;&#x8840;&#x5F71;&#x57DF;&#x548C; Ank3 &#x7684;&#x89C4;&#x7AE0;&#x57DF;&#x53C2;&#x4E0E;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230; p85&#x3002;P85 &#x7684;&#x81F3;&#x5C11;&#x4E24;&#x4E2A;&#x57DF;&#x53EF;&#x4EE5;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230; Ank3&#xFF0C;&#x5E76;&#x53D1;&#x73B0;&#x6D89;&#x53CA; p85 C SH2 &#x57DF;&#x7684;&#x4EA4;&#x4E92;&#xFF0C;&#x65E0;&#x6CD5;&#x72EC;&#x7ACB;&#x4E8E;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x7684;&#x3002;&#x8FC7;&#x5EA6;&#x7684; 120 &#x6216; 105 kDa &#x7684; Ank3 &#x86CB;&#x767D;&#x8868;&#x8FBE;&#x5BFC;&#x81F4;&#x5927;&#x5927;&#x589E;&#x5F3A;&#x7684;&#x53CA;&#x5176;&#x9000;&#x5316;&#x548C;&#x8840;&#x5C0F;&#x677F;&#x884D;&#x751F;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x7684;&#x54CD;&#x5E94;&#x4E2D;&#x6269;&#x6563;&#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x964D;&#x4F4E;&#x3002;Ank3 &#x9AD8;&#x6548;&#x8868;&#x8FBE;&#x4E5F;&#x5DEE;&#x5F02;&#x8C03;&#x8282;&#x53CA;&#x5176;&#x4E0B;&#x6E38;&#x4FE1;&#x53F7;&#x901A;&#x8DEF;&#x3002;&#x6C2F;&#x55B9;&#xFF0C;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x6EB6;&#x9176;&#x4F53;&#x964D;&#x89E3;&#x9014;&#x5F84;&#xFF0C;&#x963B;&#x6B62; Ank3 &#x80FD;&#x591F;&#x589E;&#x5F3A;&#x53CA;&#x5176;&#x9000;&#x5316;&#x3002;&#x514D;&#x75AB;&#x8367;&#x5149;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x8868;&#x660E;&#x8FD9;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5C0F;&#x7684; Ank3 &#x5F02;&#x6784;&#x4F53; colocalized p85 &#x548C;&#x53CA;&#x5176;&#x4E0E;&#x6EB6;&#x9176;&#x4F53;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E; Ank3 &#x6EB6;&#x9176;&#x4F53;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684;&#x53D7;&#x4F53;&#x4E0B;&#x8C03;&#xFF0C;&#x53EF;&#x80FD;&#x901A;&#x8FC7; p85 Ank3 &#x4E92;&#x52A8;&#x4E2D;&#x53D1;&#x6325;&#x7740;&#x91CD;&#x8981;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

&#x951A; 3 &#x5C0F;&#x4E9A;&#x578B;&#x5C06;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x7684;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;-3 &#x6FC0;&#x9176;&#x7684; p85 &#x4E9A;&#x57FA;&#x548C;&#x63D0;&#x5347;&#x8840;&#x5C0F;&#x677F;&#x884D;&#x751F;&#x7684;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x4F53;&#x4E0B;&#x8C03;&#x3002;

The Src homology 2 (SH2) domains of the p85 subunit of phosphatidylinositol 3'-kinase have been shown to bind to the tyrosine-phosphorylated platelet-derived growth factor receptor (PDGFR). Previously, we have demonstrated that p85 SH2 domains can also bind to the serine/threonine kinase A-Raf via a unique phosphorylation-independent interaction. In this report, we describe a new phosphotyrosine-independent p85 SH2-binding protein, ankyrin 3 (Ank3). In general, ankyrins serve a structural role by binding to both integral membrane proteins at the plasma membrane and spectrin/fodrin proteins of the cytoskeleton. However, smaller isoforms of Ank3 lack the membrane domain and are localized to late endosomes and lysosomes. We found that p85 binds directly to these smaller 120- and 105-kDa Ank3 isoforms. Both the spectrin domain and the regulatory domain of Ank3 are involved in binding to p85. At least two domains of p85 can bind to Ank3, and the interaction involving the p85 C-SH2 domain was found to be phosphotyrosine-independent. Overexpression of the 120- or 105-kDa Ank3 proteins resulted in significantly enhanced PDGFR degradation and a reduced ability to proliferate in response to PDGF. Ank3 overexpression also differentially regulated signaling pathways downstream from the PDGFR. Chloroquine, an inhibitor of lysosomal-mediated degradation pathways, blocked the ability of Ank3 to enhance PDGFR degradation. Immunofluorescence experiments demonstrated that both small Ank3 isoforms colocalized with the lysosomal-associated membrane protein and with p85 and the PDGFR. These results suggest that Ank3 plays an important role in lysosomal-mediated receptor down-regulation, likely through a p85-Ank3 interaction.

The smaller isoforms of ankyrin 3 bind to the p85 subunit of phosphatidylinositol 3'-kinase and enhance platelet-derived growth factor receptor down-regulation.

L&#39;homologie Src 2 (SH2) domaines de la sous-unit&eacute; p85 de phosphatidylinositol 3&#39;-kinase auraient d&ucirc; &ecirc;tre divulgu&eacute;s &agrave; se lier aux r&eacute;cepteurs tyrosine-phosphoryl&eacute;e de facteur de croissance d&eacute;riv&eacute; des plaquettes (PDGFR). Auparavant, nous avons d&eacute;montr&eacute; que domaines SH2 p85 peuvent &eacute;galement lier &agrave; la s&eacute;rine/thr&eacute;onine kinase Raf-A par l&#39;interm&eacute;diaire de liens particuliers ind&eacute;pendants de phosphorylation. Dans ce rapport, nous d&eacute;crivons une nouvelle prot&eacute;ine de liaison SH2 phosphotyrosine ind&eacute;pendant p85, ankyrin 3 (Ank3). En g&eacute;n&eacute;ral, ankyrins jouent un r&ocirc;le structurel en liant les deux prot&eacute;ines membranaires intrins&egrave;ques &agrave; la membrane plasmique et de la spectrine/fodrine prot&eacute;ines du cytosquelette. Cependant, les petites isoformes de Ank3 n&#39;ont pas le domaine de la membrane et sont localis&eacute;es aux lysosomes et endosomes fin. Nous avons trouv&eacute; que p85 se lie directement &agrave; ces petits 120 et 105 kDa isoformes de Ank3. Le domaine de la spectrine tant le domaine r&eacute;gulateur de Ank3 sont impliqu&eacute;s dans la liaison &agrave; p85. Au moins deux domaines de p85 peuvent lier &agrave; Ank3, et l&#39;interaction avec le domaine de C-SH2 p85 s&#39;est av&eacute;r&eacute;e pour &ecirc;tre ind&eacute;pendant de la phosphotyrosine. La surexpression de la 120 - ou 105 kDa Ank3 prot&eacute;ines a significativement am&eacute;lior&eacute;e la d&eacute;gradation PDGFR et une diminution de la capacit&eacute; &agrave; prolif&eacute;rer en r&eacute;ponse &agrave; PDGF. Ank3 surexpression r&eacute;glement&eacute;e &eacute;galement diff&eacute;remment les voies de signalisation en aval de la PDGFR. La chloroquine, un inhibiteur des voies de d&eacute;gradation lysosomale m&eacute;diation, bloqu&eacute; la capacit&eacute; d&#39;Ank3 pour am&eacute;liorer la d&eacute;gradation PDGFR. Immunofluorescence exp&eacute;riences ont d&eacute;montr&eacute; que les deux isoformes de Ank3 petites colocalis&eacute; avec la prot&eacute;ine de la membrane lysosomale associ&eacute;s et p85 et le PDGFR. Ces r&eacute;sultats sugg&egrave;rent que la Ank3 joue un r&ocirc;le important dans lysosomal m&eacute;di&eacute;e par les r&eacute;cepteurs down-regulation, probablement par une interaction p85-Ank3.

Petites isoformes d&#39;ankyrin 3 lient &agrave; la sous-unit&eacute; p85 de phosphatidylinositol 3&#39;-kinase et am&eacute;liorent le facteur de croissance d&eacute;riv&eacute; des plaquettes down-r&eacute;gulation des r&eacute;cepteurs.

Die Src-Homologie 2 (SH2) Bereiche der p85-Untereinheit des Phosphatidylinositol 3&#39;-Kinase sind gezeigt worden, zum Binden an den Rezeptor Tyrosin-phosphoryliert Platelet-derived Growth Factor (PDGFR). Zuvor haben wir bewiesen, dass p85 SH2-Dom&auml;nen auch an die Serin/Threonin-Kinase A-Raf &uuml;ber eine einzigartige Phosphorylierung-unabh&auml;ngige Interaktion gebunden werden k&ouml;nnen. In diesem Bericht beschreiben wir ein neues Phosphotyrosine-unabh&auml;ngige p85 SH2-verbindliches Protein, Ankyrin 3 (Ank3). Ankyrins dienen in der Regel eine strukturelle Rolle durch die Bindung an beide integrale Membranproteine an der Plasmamembran und Spektrin/Fodrin Proteine des Zytoskeletts. Jedoch kleinere Isoformen des Ank3 fehlt die Membran-Dom&auml;ne und sp&auml;ten Endosomen und Lysosomen lokalisiert sind. Wir fanden, dass das p85 direkt zu diesen kleineren 120 - und 105-kDa Ank3 Isoformen bindet. Bindung an p85 sind sowohl der Spektrin und der regulatorischen Dom&auml;ne von Ank3 beteiligt. Mindestens zwei Dom&auml;nen des p85 k&ouml;nnen an Ank3 binden und die Interaktion mit die p85-C-SH2-Dom&auml;ne wurde festgestellt, dass die um Phosphotyrosine unabh&auml;ngig zu werden. Eine &Uuml;berexpression von der 120 - oder 105-kDa Ank3 Proteine f&uuml;hrte zu wesentlich verbesserten PDGFR Abbau- und eine reduzierte F&auml;higkeit zur Reaktion auf PDGF vermehren. Ank3-&Uuml;berexpression reguliert auch differentiell Signalwege stromabw&auml;rts von der PDGFR. Chloroquin, ein Inhibitor der lysosomalen-vermittelte Erniedrigung Wege, blockiert die F&auml;higkeit von Ank3, PDGFR-Abbau zu verbessern. Immunofluoreszenz-Experimente zeigten, dass sowohl kleinen Ank3-Isoformen mit der lysosomalen-assoziiertes Membranprotein und p85 und die PDGFR colocalized. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Ank3 in lysosomale-vermittelte Rezeptor Herunterregulation, wahrscheinlich durch eine p85-Ank3-Interaktion eine wichtige Rolle spielt.

Die kleineren Isoformen von Ankyrin 3 binden an das p85-Untereinheit des Phosphatidylinositol 3&#39;-Kinase und Platelet-derived Growth Factor Rezeptor Herunterregulation verbessern.

La Src homology 2 (SH2) domini della subunit&agrave; p85 di fosfatidilinositolo 3-chinasi hanno dimostrato di legarsi al recettore tirosina fosforilata di fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFR). In precedenza, abbiamo dimostrato che i domini SH2 p85 anche possono associare a serina/treonina chinasi A-Raf tramite un&#39;unica interazione indipendente dalla fosforilazione. In questo rapporto, descriviamo un nuovo indipendente phosphotyrosine p85 SH2-binding protein, ankyrin 3 (Ank3). In generale, ankyrins servire un ruolo strutturale mediante l&#39;associazione di due proteine integrali di membrana alla membrana plasmatica e spettrina/fodrin proteine del citoscheletro. Tuttavia, pi&ugrave; piccoli isoforme di Ank3 mancano il dominio di membrana e sono localizzati ai lisosomi e late endosomes. Abbiamo trovato che p85 associa direttamente a questi piccoli 120 - e 105-kDa Ank3 isoforme. Sia il dominio spectrina e il dominio normativo di Ank3 sono coinvolti nell&#39;associazione per p85. Almeno due domini di p85 possono associare a Ank3, e l&#39;interazione che coinvolgono il dominio C-SH2 p85 &egrave; stato trovato per essere indipendente dal phosphotyrosine. Sovraespressione del 120 - o 105-kDa Ank3 proteine ha portato degrado PDGFR significativamente migliorata e una ridotta capacit&agrave; di proliferare in risposta al PDGF. Ank3 sovraespressione regolato anche differenzialmente segnalazione percorsi a valle dal PDGFR. Clorochina, un inibitore delle vie di degradazione lisosomiale-mediata, bloccato la possibilit&agrave; di aumentare la degradazione di PDGFR Ank3. Esperimenti di immunofluorescenza hanno dimostrato che entrambi isoforme Ank3 piccoli colocalized con la proteina di membrana lisosomiale associata e p85 e il PDGFR. Questi risultati suggeriscono che Ank3 svolge un ruolo importante nel lisosomiale mediata dal recettore down-regulation, probabilmente attraverso un&#39;interazione p85-Ank3.

Le isoforme pi&ugrave; piccoli di ankyrin 3 associare la subunit&agrave; p85 del fosfatidilinositolo 3&#39;-chinasi e migliorare il fattore di crescita derivato dalle piastrine del recettore down-regulation.

Src &#x30DB;&#x30E2;&#x30ED;&#x30B8;&#x30FC; 2 (SH2) &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3; &#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB;&#x306E; p85 &#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E; 3&#39;-&#x3001;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x304C;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x8840;&#x5C0F;&#x677F;&#x7531;&#x6765;&#x5897;&#x6B96;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53; &#xFF08;&#x2171; &#x76F8;&#x8A66;&#x9A13;&#xFF09; &#x3092;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3059;&#x308B;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x304C;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4EE5;&#x524D;&#x306F;&#x3001;p85 SH2 &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x304C;&#x30BB;&#x30EA;&#x30F3;/&#x30B9;&#x30EC;&#x30AA;&#x30CB;&#x30F3; &#x30FB; &#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x6D3B;&#x6027; A Raf &#x30E6;&#x30CB;&#x30FC;&#x30AF;&#x306A;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x306A;&#x3044;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x3082;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30EC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30DB;&#x30B9;&#x30DB;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x72EC;&#x7ACB; p85 &#x306E; SH2 &#x7D50;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x3001;&#x30A2;&#x30F3;&#x30AD;&#x30EA;&#x30F3; 3 (Ank3) &#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E00;&#x822C;&#x306B;&#x3001;ankyrins &#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x7D30;&#x80DE;&#x9AA8;&#x683C;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x7A4D;&#x5206;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x819C;&#x30B9;&#x30DA;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EA;&#x30F3;/fodrin &#x3067;&#x9023;&#x7D50;&#x3057;&#x3066;&#x30B5;&#x30FC;&#x30D6;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x5C0F;&#x3055;&#x3044;&#x30A2;&#x30A4;&#x30BD; &#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0; Ank3 &#x306E;&#x819C;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3092;&#x6B20;&#x3044;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3001;&#x5F8C;&#x671F;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x3068;&#x30EA;&#x30BD;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306B;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BA;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x305D;&#x306E; p85 &#x76F4;&#x63A5;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x3088;&#x308A;&#x5C0F;&#x3055;&#x3044; 120-&#x3001;105 kDa &#x306B; Ank3 &#x30A2;&#x30A4;&#x30BD; &#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x304C;&#x898B;&#x3064;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30B9;&#x30DA;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EA;&#x30F3; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3068; Ank3 &#x306E;&#x898F;&#x5236;&#x9818;&#x57DF; p85 &#x3078;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;P85 &#x306E;&#x5C11;&#x306A;&#x304F;&#x3068;&#x3082; 2 &#x3064;&#x306E;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306F; Ank3 &#x306B;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3067;&#x304D;&#x3001;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528; p85 C SH2 &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30DB;&#x30B9;&#x30DB;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x72EC;&#x7ACB;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x898B;&#x3064;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x904E;&#x5270;&#x767A;&#x73FE;&#x306E; 120- &#x307E;&#x305F;&#x306F; 105 kDa &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; Ank3 &#x2171; &#x76F8;&#x8A66;&#x9A13;&#x52A3;&#x5316;&#x3092;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x5F37;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3068; PDGF &#x306B;&#x5FDC;&#x3048;&#x3066;&#x5897;&#x6B96;&#x529B;&#x306E;&#x4F4E;&#x4E0B;&#x3092;&#x3082;&#x305F;&#x3089;&#x3057;&#x305F;&#x3002;Ank3 &#x904E;&#x5270;&#x767A;&#x73FE;&#x3082;&#x4E0B;&#x6D41;&#x3001;&#x2171; &#x76F8;&#x8A66;&#x9A13;&#x304B;&#x3089;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x3092;&#x5236;&#x5FA1;&#x3002;&#x30AF;&#x30ED;&#x30ED;&#x30AD;&#x30F3;, &#x30EA;&#x30BD;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x5206;&#x89E3;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306E;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x306F;&#x3001;&#x2171; &#x76F8;&#x8A66;&#x9A13;&#x306E;&#x52A3;&#x5316;&#x3092;&#x5F37;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x80FD;&#x529B; Ank3 &#x306E;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x3002;&#x86CD;&#x5149;&#x6297;&#x4F53;&#x6CD5;&#x5B9F;&#x9A13;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x5C0F;&#x3055;&#x306A; Ank3 &#x306E;&#x30A2;&#x30A4;&#x30BD; &#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x304C;&#x30EA;&#x30BD;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3068; p85 &#x3068;&#x3001;&#x2171; &#x76F8;&#x8A66;&#x9A13;&#x3068;&#x7D50;&#x679C;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;Ank3 &#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x30EA;&#x30BD;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3;-&#x898F;&#x5236;&#x3001;p85 Ank3 &#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3067;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x679C;&#x305F;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x5506;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x30A2;&#x30F3;&#x30AD;&#x30EA;&#x30F3; 3 &#x306E;&#x5C0F;&#x3055;&#x3044;&#x30A2;&#x30A4;&#x30BD; &#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0; &#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9; &#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB; p85 &#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306B; 3&#39;-&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068;&#x8840;&#x5C0F;&#x677F;&#x7531;&#x6765;&#x5897;&#x6B96;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3;&#x30EC;&#x30AE;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x5F37;&#x5316;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

Src homology 2 (SH2) &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; phosphorylated &#xD608;&#xC18C;&#xD310; &#xC720;&#xB798; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; (PDGFR) &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD560; phosphatidylinositol 3&#39;-&#xD0A4;&#xC758; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC758; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC8FC;&#xB294; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 SH2 &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xACE0;&#xC720; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654; &#xB3C5;&#xB9BD;&#xC801;&#xC778; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xB5A0;&#xB4E4;&#xACE0;/&#xD2B8;&#xB808;&#xC624;&#xB2CC; &#xB2C8; A-&#xC601;&#xAD6D; &#xACF5;&#xAD70;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD560; &#xC218;&#xB3C4; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; phosphotyrosine &#xB3C5;&#xB9BD; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 SH2 &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;, ankyrin 3 (Ank3) &#xC124;&#xBA85;. &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;, ankyrins&#xB294; cytoskeleton&#xC758; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; spectrin/fodrin&#xC5D0;&#xC11C; &#xB450; &#xC815;&#xC218; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD558;&#xC5EC; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, ank3&#xC758; &#xC791;&#xC740; isoforms &#xB9C9; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xBD80;&#xC871; &#xD558; &#xACE0; &#xB2A6;&#xAC8C; endosomes&#xC640; &#xB9AC;&#xC18C;&#xC880;&#xC744; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD574;&#xB2F9; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC9C1;&#xC811;&#xC5D0; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC791;&#xC740; 120-&#xBC0F; 105-kDa Ank3 isoforms&#xB97C; &#xCC3E;&#xC558;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. Spectrin &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xBC0F; ank3&#xC758; &#xADDC;&#xC81C; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C;&#xB2E4;. &#xB450; &#xAC1C; &#xC774;&#xC0C1;&#xC758; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85&#xC758; Ank3&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD558;&#xACE0; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 C SH2 &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; phosphotyrosine &#xB3C5;&#xB9BD;&#xC801;&#xC778; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0AC;&#xB2E4;. Overexpression&#xC758;&#xB294; 120-&#xB610;&#xB294; 105-kDa Ank3 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD06C;&#xAC8C; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; PDGFR &#xC800;&#xD558;&#xC640; PDGF&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC751;&#xB2F5;&#xC73C;&#xB85C; &#xACA9; &#xC99D; &#xAC10;&#xC18C; &#xB2A5;&#xB825; &#xACB0;&#xACFC;. Ank3 overexpression&#xB294; &#xB610;&#xD55C; &#xCC28;&#xB3D9; &#xC2E0;&#xD638; &#xACBD;&#xB85C; &#xD558;&#xB958;&#xB294; PDGFR&#xC5D0;&#xC11C; &#xADDC;&#xC81C;. &#xD074;&#xB85C;&#xB85C;&#xD038;, lysosomal &#xC911;&#xC7AC; &#xC800;&#xD558; &#xACBD;&#xB85C;&#xC758; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C; PDGFR &#xC800;&#xD558;&#xB97C; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xD558;&#xB294; ank3&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5; &#xCC28;&#xB2E8;. &#xBA74;&#xC5ED; &#xD615;&#xAD11; &#xAC80;&#xC0AC; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xB450; &#xC791;&#xC740; Ank3 isoforms&#xB97C; colocalized lysosomal &#xAD00;&#xB828; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBC0F; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85&#xC640; PDGFR&#xB97C; &#xC2DC;&#xC5F0; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; Ank3 lysosomal &#xC911;&#xC7AC; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xB2E4;&#xC6B4; &#xADDC;&#xC81C;, &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85-Ank3 &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xD55C;&#xB2E4; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Ankyrin 3&#xC758; &#xC791;&#xC740; isoforms phosphatidylinositol 3&#39;-&#xD0A4;&#xC758; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD558;&#xACE0; &#xD608;&#xC18C;&#xD310; &#xC720;&#xB798; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xB2E4;&#xC6B4; &#xB808; &#xADE4; &#xB808;&#xC774; &#xC158;&#xC744; &#xD5A5;&#xC0C1;.

La homolog&iacute;a Src 2 (SH2) dominios de la subunidad p85 de fosfatidilinositol 3&#39;-quinasa se ha demostrado que se unen al receptor de la tirosina-phosphorylated factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR). Previamente, hemos demostrado que los dominios SH2 p85 tambi&eacute;n pueden enlazar a la cinasa de serina/treonina Air Force A trav&eacute;s de una &uacute;nica interacci&oacute;n independiente de la fosforilaci&oacute;n. En este informe, describimos una nueva prote&iacute;na de uni&oacute;n a SH2 phosphotyrosine-independiente p85, ankyrin 3 (Ank3). En general, ankyrins servir un papel estructural enlazando a ambas prote&iacute;nas integrales de la membrana en la membrana plasm&aacute;tica y la Espectrina/fodrin las prote&iacute;nas del citoesqueleto. Sin embargo, menores isoformas de Ank3 falta el dominio de la membrana y se localizan finales endosomas y lisosomas. Encontramos que p85 se une directamente a estos peque&ntilde;os 120 - 105-kDa e isoformas de Ank3. El dominio de la Espectrina tanto el dominio regulador de Ank3 participan en Uni&oacute;n a p85. Por lo menos dos dominios de p85 pueden enlazar a Ank3, y la interacci&oacute;n que implica el dominio de C-SH2 p85 fue encontrada para ser independiente de fosfotirosina. Sobreexpresi&oacute;n de las prote&iacute;nas Ank3 de 120 o 105 kDa dio lugar a la degradaci&oacute;n de PDGFR significativamente mejorada y una capacidad reducida para proliferar en respuesta a PDGF. Sobreexpresi&oacute;n de Ank3 tambi&eacute;n diferencialmente hab&iacute;a regulada v&iacute;as de se&ntilde;alizaci&oacute;n aguas abajo de la PDGFR. Cloroquina, un inhibidor de las v&iacute;as de degradaci&oacute;n lisosomal-mediada, bloquea la capacidad de Ank3 para mejorar la degradaci&oacute;n PDGFR. Experimentos de inmunofluorescencia demostraron que ambas isoformas de Ank3 peque&ntilde;os colocalized con la prote&iacute;na de la membrana lisosomal asociada y p85 y el PDGFR. Estos resultados sugieren que el Ank3 desempe&ntilde;a un papel importante en lysosomal mediada por receptor abajo-regulaci&oacute;n, probablemente con una interacci&oacute;n p85-Ank3.

Las isoformas menores de ankyrin 3 se unen a la subunidad p85 de fosfatidilinositol 3&#39;-quinasa y mejoran la regulaci&oacute;n del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas.

&#x5728;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x7684;&#x8840;&#x5C0F;&#x677F;&#x884D;&#x751F;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50; (PDGF) &#x53D7;&#x4F53;&#x7684;&#x5185;&#x541E;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF0C;&#x671F;&#x95F4;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;-3 &#x6FC0;&#x9176; (&#x808C;&#x9187;&#xFF09; &#x4FDD;&#x6301;&#x4E0E;&#x8BE5;&#x53D7;&#x4F53;&#x76F8;&#x5173;&#x8054;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0; p85 PI3 &#x6FC0;&#x9176;&#x7684; alpha &#x5206;&#x80A1;&#x5C06;&#x76F4;&#x63A5;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230; Rab5 &#x548C;&#x62E5;&#x6709;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x86CB;&#x767D; (GAP) &#x6D3B;&#x52A8;&#x671D;&#x7740; Rab5 &#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x3002;Rab5 &#x662F;&#x5C0F;&#x7684;&#x5355;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x53C2;&#x4E0E;&#x8C03;&#x8282;&#x56CA;&#x6CE1;&#x878D;&#x5408;&#x4E8B;&#x4EF6;&#x671F;&#x95F4;&#x53D7;&#x4F53;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684;&#x5185;&#x541E;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7528;&#x4E24;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6765;&#x63CF;&#x8FF0;&#x5728;&#x5404;&#x79CD;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x675F;&#x7F1A;&#x6001; Rab5 &#x4E0E; p85 &#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F4;&#x63A5;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x3002;&#x5728;&#x7B2C;&#x4E00;&#x6B21;&#x68C0;&#x6D4B;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x5C06;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230; Rab5 p85 &#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x662F;&#x4F7F;&#x7528;&#x9176;&#x8054;&#x9176;&#x8054;&#x514D;&#x75AB;&#x5438;&#x9644;&#x6CD5; (ELISA) &#x6765;&#x8861;&#x91CF;&#x7684;&#x3002;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x6B21;&#x68C0;&#x6D4B;&#x662F;&#x5728;&#x54EA;&#x4E9B;&#x5546;&#x54C1;&#x53CA;&#x670D;&#x52A1;&#x7A0E; Rab5 &#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x4E2D;&#x5404;&#x79CD;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x72B6;&#x6001;&#x5141;&#x8BB8;&#x7ED1;&#x5B9A; p85 &#x7684;&#x8C37;&#x80F1;&#x7518;&#x80BD; S-&#x8F6C;&#x79FB;&#x9176; (GST) &#x4E0B;&#x62C9;&#x5217;&#x8868;&#x529E;&#x6CD5;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x4E24;&#x79CD;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684; p85 &#x68C0;&#x6D4B;&#x5230;&#x4F7F;&#x7528;&#x6297; p85 &#x6297;&#x4F53;&#x3002;

&#x6D4B;&#x91CF;&#x4E0E; Rab5 &#x7684;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;-3 &#x6FC0;&#x9176;&#x7684; p85alpha &#x4E9A;&#x57FA;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

During endocytosis of the activated platelet-derived growth factor (PDGF) receptor, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) remains associated with the receptor. We found that the p85 alpha subunit of PI3 kinase binds directly to Rab5 and possesses GTPase activating protein (GAP) activity toward Rab5. Rab5 is a small monomeric GTPase involved in regulating vesicle fusion events during receptor-mediated endocytosis. We used two methods to characterize the direct binding between Rab5 in various nucleotide-bound states and the p85 protein. In the first assay, the ability of p85 to bind to Rab5 is measured using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The second assay is a glutathione S-transferase (GST) pull-down approach in which GST-Rab5 proteins in various nucleotide-bound states are allowed to bind p85. In both instances, bound p85 is detected using anti-p85 antibodies.

Measurement of the interaction of the p85alpha subunit of phosphatidylinositol 3-kinase with Rab5.

Au cours de l&#39;endocytose des r&eacute;cepteurs activ&eacute;s le facteur de croissance d&eacute;riv&eacute; des plaquettes (PDGF), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) reste associ&eacute; par le r&eacute;cepteur. Nous avons trouv&eacute; que la sous-unit&eacute; alpha p85 de PI3 kinase se lie directement &agrave; Rab5 et poss&egrave;de l&#39;activit&eacute; de la prot&eacute;ine (GAP) vers Rab5 lancement de GTPase. Rab5 est une petite GTPase monom&egrave;re intervenant dans la r&eacute;gulation des &eacute;v&eacute;nements de fusion de v&eacute;sicules au cours de l&#39;endocytose. Nous avons utilis&eacute; deux m&eacute;thodes pour caract&eacute;riser la liaison directe entre Rab5 dans divers &Eacute;tats de nucl&eacute;otides li&eacute;s et la prot&eacute;ine p85. Dans le premier essai, la capacit&eacute; de p85 &agrave; lier &agrave; Rab5 est mesur&eacute;e &agrave; l&#39;aide d&#39;un enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Le deuxi&egrave;me test est une approche de menu d&eacute;roulant glutathion S-transf&eacute;rase (GST) dans lequel GST-Rab5 prot&eacute;ines dans divers &Eacute;tats de nucl&eacute;otides li&eacute;s sont autoris&eacute;s &agrave; lier p85. Dans les deux cas, p85 li&eacute; est d&eacute;tect&eacute; &agrave; l&#39;aide d&#39;anticorps anti-p85.

Mesure de l&#39;interaction de la sous-unit&eacute; de la p85alpha de la phosphatidylinositol 3-kinase avec Rab5.

W&auml;hrend Endozytose des Rezeptors aktivierte Platelet-derived Growth Factor (PDGF) bleibt die Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K) des Rezeptors zugeordnet. Wir fanden, dass die p85-alpha-Untereinheit des PI3-Kinase direkt an Rab5 bindet und besitzt GTPase aktivierendes Protein (GAP)-Aktivit&auml;t in Richtung Rab5. Rab5 ist eine kleine Monomere GTPase Regulierung des Vesicle Fusion Ereignisse w&auml;hrend der Rezeptor-vermittelte Endozytose beteiligt. Wir haben zwei Methoden um die direkte Bindung zwischen Rab5 in verschiedenen Nukleotid-gebundenen Staaten und das p85-Protein zu charakterisieren. In der ersten Probe wird die F&auml;higkeit des p85 binden an Rab5 anhand eines Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). Die zweite Probe ist ein Glutathion S-Transferase (GST) Pulldown-Ansatz in die GST-Rab5 Proteine in verschiedenen Nukleotid-gebundenen Staaten p85 binden d&uuml;rfen. In beiden F&auml;llen ist gebundenen p85 anhand der Anti-p85 Antik&ouml;rper erkannt.

Messung der Interaktion von der p85alpha-Untereinheit der Phosphatidylinositol-3-Kinase mit Rab5.

Durante l&#39;endocitosi del recettore attivato fattore crescita derivato dalle piastrine (PDGF), fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) rimane associata con il recettore. Abbiamo trovato che la subunit&agrave; alfa p85 del PI3 chinasi si lega direttamente al Rab5 e possiede d&#39;attivazione attivit&agrave; proteina (GAP) verso Rab5 GTPase. Rab5 &egrave; un piccola GTPasi monomerica coinvolti nella regolazione della eventi di fusione della vescicola durante endocitosi recettore-mediata. Abbiamo utilizzato due metodi per caratterizzare il legame diretto tra Rab5 in vari Stati associati a nucleotide e la proteina p85. Nel primo saggio, la capacit&agrave; di associare alla Rab5 p85 &egrave; misurata usando un&#39;analisi enzima-collegata dell&#39;immunosorbente (ELISA). Il secondo saggio &egrave; un approccio di pull-down S-transferasi (GST) di glutatione nel quale GST-Rab5 proteine in vari Stati associati a nucleotide sono consentite per associare p85. In entrambi i casi, p85 associato viene rilevato utilizzando anticorpi anti-p85.

Misura dell&#39;interazione della subunit&agrave; p85alpha del fosfatidilinositolo 3-chinasi con Rab5.

&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x8840;&#x5C0F;&#x677F;&#x7531;&#x6765;&#x6210;&#x9577;&#x56E0;&#x5B50; (PDGF) &#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x4E2D;&#x3001;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB; 3-&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC; &#xFF08;PI3K&#xFF09; &#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3068;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x307E;&#x307E;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; p85 &alpha; &#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8; PI3 &#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E; Rab5 &#x306B;&#x76F4;&#x63A5;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3059;&#x308B; GTPase &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA; &#xFF08;&#x30AE;&#x30E3;&#x30C3;&#x30D7;&#xFF09; &#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x3092; Rab5 &#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x3092;&#x6240;&#x6709;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x308F;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;Rab5 &#x306F;&#x5C0F;&#x3055;&#x306A;&#x5358;&#x91CF;&#x4F53; GTPase &#x306E;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x4E2D;&#x306E;&#x30D9;&#x30B7;&#x30AF;&#x30EB;&#x878D;&#x5408;&#x30A4;&#x30D9;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;&#x8ABF;&#x6574;&#x306B;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x308B;&#x3067;&#x3059;&#x3002;Rab5 &#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x7D50;&#x5408;&#x72B6;&#x614B;&#x3068; p85 &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x9593;&#x306E;&#x76F4;&#x63A5;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x3065;&#x3051;&#x308B; 2 &#x3064;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x521D;&#x306E;&#x8A66;&#x9A13;&#x3067;&#x306F;&#x3001;p85 Rab5 &#x306B;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3059;&#x308B;&#x80FD;&#x529B;&#x3092;&#x9175;&#x7D20;&#x6297;&#x4F53;&#x6CD5; (elisa) &#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;2 &#x756A;&#x76EE;&#x306E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306F;&#x3001;GST Rab5 &#x306E;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x7D50;&#x5408;&#x72B6;&#x614B;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; p85 &#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3092;&#x8A31;&#x53EF;&#x3067;&#x3059;&#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3; s-&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; (GST) &#x30D7;&#x30EB;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3; &#x30FB; &#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30B9;&#x3067;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x305F; p85 &#x30A2;&#x30F3;&#x30C1; p85 &#x6297;&#x4F53;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x691C;&#x51FA;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

Rab5 &#x3068;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB; 3-&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E; p85alpha &#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3002;

&#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB41C; &#xD608;&#xC18C;&#xD310; &#xC720;&#xB798; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; (PDGF) &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC758; endocytosis &#xC911; phosphatidylinositol 3-&#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; (PI3K) &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC640; &#xAD00;&#xB828; &#xC720;&#xC9C0;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xBC1C;&#xACAC; PI3 kinase&#xC758; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xC54C;&#xD30C; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; rab5&#xC5D0; &#xC9C1;&#xC811; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4; GTPase Rab5 &#xD5A5;&#xD574; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (GAP) &#xD65C;&#xB3D9; &#xD65C;&#xC131;&#xD654;&#xB97C; &#xC18C;&#xC720;&#xD55C; &#xB2E4;. Rab5&#xB294; &#xC791;&#xC740; monomeric GTPase &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;-&#xC911;&#xC7AC; endocytosis &#xC911; &#xAE30; &#xD4E8;&#xC804; &#xC774;&#xBCA4;&#xD2B8; &#xC870;&#xC808;&#xC5D0; &#xAD00;&#xC5EC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xB41C; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC5D0;&#xC11C; rab5&#xC640; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xC9C1;&#xC811; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xCCAB; &#xBC88;&#xC9F8; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB41C; immunosorbent &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; (ELISA)&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; rab5&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD560; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xB2A5;&#xB825; &#xCE21;&#xC815;. &#xB450; &#xBC88;&#xC9F8; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; GST Rab5 &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xB41C; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD560; &#xD5C8;&#xC6A9; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4; glutathione S-&#xC804;&#xC774; (GST) &#xD480;-&#xB2E4;&#xC6B4; &#xC811;&#xADFC; &#xC774;&#xB2E4;. &#xB450; &#xC778;&#xC2A4;&#xD134;&#xC2A4; &#xBAA8;&#xB450;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xB41C; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xC548;&#xD2F0; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xD56D; &#xCCB4;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xAC80;&#xC0C9; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Rab5 phosphatidylinositol 3-kinase&#xC758; p85alpha &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; &#xC0C1;&#xD638;&#xC758; &#xCE21;&#xC815;.

Durante la endocitosis del receptor activado factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) permanece asociada con el receptor. Encontramos que la subunidad alfa de la p85 de PI3 quinasa se une directamente a Rab5 y posee GTPasa activando la actividad de la prote&iacute;na (GAP) hacia Rab5. Rab5 es una peque&ntilde;a GTPasa monom&eacute;rica interviene en la regulaci&oacute;n de eventos de la fusi&oacute;n de ves&iacute;culas durante la endocitosis mediada por receptor. Se utilizaron dos m&eacute;todos para caracterizar el enlace directo entre Rab5 en distintos Estados de nucle&oacute;tidos enlazados y la prote&iacute;na p85. En el primer ensayo, se mide la capacidad de p85 enlazar a Rab5 utilizando un ensayo inmunoenzim&aacute;tico (ELISA). El segundo ensayo es un enfoque de pull-down de glutati&oacute;n S-transferasa (GST) en que GST-Rab5 prote&iacute;nas en diferentes Estados de nucle&oacute;tidos enlazados se permitieron enlazar p85. En ambos casos, se detecta p85 encuadernado usando los anticuerpos anti-p85.

Medida de la interacci&oacute;n de la subunidad p85alpha de la fosfatidilinositol 3-quinasa con Rab5.

Rab5 &#x662F;&#x5C0F;&#x7684;&#x5355;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x53C2;&#x4E0E;&#x8C03;&#x8282;&#x56CA;&#x6CE1;&#x878D;&#x5408;&#x4E8B;&#x4EF6;&#x671F;&#x95F4;&#x53D7;&#x4F53;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684;&#x5185;&#x541E;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x5728;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x7684;&#x8840;&#x5C0F;&#x677F;&#x884D;&#x751F;&#x7684;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x4F53;&#x7684;&#x5185;&#x541E;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF0C;&#x671F;&#x95F4;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;-3 &#x6FC0;&#x9176; (&#x808C;&#x9187;&#xFF09; &#x4FDD;&#x6301;&#x4E0E;&#x8BE5;&#x53D7;&#x4F53;&#x76F8;&#x5173;&#x8054;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0; p85 &#x808C;&#x9187;&#x7684; alpha &#x5206;&#x80A1;&#x5C06;&#x76F4;&#x63A5;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230; Rab5 &#x548C;&#x62E5;&#x6709;&#x671D;&#x5411; Rab5 &#x86CB;&#x767D;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x86CB;&#x767D; (GAP) &#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5C06;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x4E24;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7528;&#x6765;&#x63CF;&#x7ED8; Rab5 &#x86CB;&#x767D;&#x5BF9; p85 &#x7684;&#x5DEE;&#x8DDD;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x7B2C;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x662F;&#x7A33;&#x6001;&#x95F4;&#x9699;&#x6D4B;&#x5B9A;&#xFF0C;&#x7528;&#x4E8E;&#x663E;&#x793A; p85 alpha &#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5DF2;&#x671D;&#x7740; Rab5 &#x5DEE;&#x8DDD;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x662F;&#x50AC;&#x5316;&#x7387; Rab5 GTP &#x6C34;&#x89E3;&#x6216;&#x4E0D; p85 alpha &#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x5355;&#x4E00;&#x8425;&#x4E1A;&#x989D;&#x5DEE;&#x8DDD;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x548C;&#x63AA;&#x65BD;&#x53D8;&#x5316;&#x3002;

&#x6D4B;&#x5B9A;&#x548C; Rab5 &#x86CB;&#x767D;&#x7531; p85 alpha &#x4E9A;&#x57FA;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;-3 &#x6FC0;&#x9176;&#x7684;&#x523A;&#x6FC0;&#x3002;

Rab5 is a small monomeric GTPase involved in regulating vesicle fusion events during receptor-mediated endocytosis. During endocytosis of the activated platelet-derived growth factor receptor, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) remains associated with the receptor. We have found that the p85 alpha subunit of PI3K binds directly to Rab5 and possesses GTPase-activating protein (GAP) activity toward Rab5. We describe two methods used to characterize the GAP activity of p85 toward the Rab5 protein. The first method is a steady-state GAP assay, used to show that the p85 alpha protein has GAP activity toward Rab5. The second method is a single turnover GAP assay and measures changes in the catalytic rate of Rab5 GTP hydrolysis with or without the p85 alpha protein.

Assay and stimulation of the Rab5 GTPase by the p85 alpha subunit of phosphatidylinositol 3-kinase.

Rab5 est une petite GTPase monom&egrave;re intervenant dans la r&eacute;gulation des &eacute;v&eacute;nements de fusion de v&eacute;sicules au cours de l&#39;endocytose. Au cours de l&#39;endocytose du r&eacute;cepteur de facteur de croissance d&eacute;riv&eacute; des plaquettes activ&eacute;es, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) reste associ&eacute; par le r&eacute;cepteur. Nous avons trouv&eacute; que la sous-unit&eacute; alpha de p85 de PI3K se lie directement &agrave; Rab5 et poss&egrave;de une activit&eacute; GTPase-activating protein (GAP) vers Rab5. Nous d&eacute;crivons deux m&eacute;thodes utilis&eacute;es pour caract&eacute;riser l&#39;activit&eacute; de l&#39;&eacute;cart de p85 vers la prot&eacute;ine Rab5. La premi&egrave;re m&eacute;thode est un dosage d&#39;&eacute;cart de stationnaire, utilis&eacute; pour montrer que la prot&eacute;ine alpha p85 a une activit&eacute; GAP vers Rab5. La deuxi&egrave;me m&eacute;thode est un simple chiffre d&#39;affaires GAP dosage et mesures des changements du taux catalytique de l&#39;hydrolyse du GTP Rab5 avec ou sans la prot&eacute;ine alpha p85.

Dosage et stimulation de la GTPase Rab5 par la sous-unit&eacute; alpha p85 de phosphatidylinositol 3-kinase.

Rab5 ist eine kleine Monomere GTPase Regulierung des Vesicle Fusion Ereignisse w&auml;hrend der Rezeptor-vermittelte Endozytose beteiligt. W&auml;hrend der Endozytose des aktivierten Platelet-derived Growth Factor Rezeptors, Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K) bleibt der Rezeptor zugeordnet. Wir haben festgestellt, dass die p85-alpha-Untereinheit des PI3K direkt an Rab5 bindet und GTPase-Aktivierung von Protein (GAP) T&auml;tigkeit in Richtung Rab5 besitzt. Wir beschreiben zwei Methoden verwendet, um die L&uuml;cke-Aktivit&auml;t des p85 Richtung Rab5 Proteins charakterisieren. Die erste Methode ist ein Flie&szlig;gleichgewicht L&uuml;cke Assay, verwendet, um anzuzeigen, dass das p85-alpha-Protein L&uuml;cke Aktivit&auml;t in Richtung Rab5 hat. Die zweite Methode ist eine einzelne Umsatz L&uuml;cke Assay und Ma&szlig;nahmen Ver&auml;nderungen in der katalytischen Rate von Rab5 GTP-Hydrolyse mit oder ohne das p85-alpha-Protein.

Assay und Stimulierung der Rab5 GTPase durch das p85-alpha-Untereinheit des Phosphatidylinositol-3-Kinase.

Rab5 &egrave; un piccola GTPasi monomerica coinvolti nella regolazione della eventi di fusione della vescicola durante endocitosi recettore-mediata. Durante l&#39;endocitosi del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine attivate, fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) rimane associata con il recettore. Abbiamo trovato che la subunit&agrave; alfa p85 della PI3K si lega direttamente al Rab5 e possiede Gap proteina (GAP) attivit&agrave; verso Rab5. Descriviamo due metodi utilizzati per caratterizzare l&#39;attivit&agrave; GAP di p85 verso la proteina Rab5. Il primo metodo &egrave; un dosaggio GAP stazionario, utilizzato per dimostrare che la proteina alfa p85 ha attivit&agrave; GAP verso Rab5. Il secondo metodo &egrave; un singolo fatturato GAP analisi e misure cambiamenti nel tasso di idrolisi di GTP Rab5 con o senza la proteina alfa p85 catalitico.

Dosaggio e stimolazione della GTPasi Rab5 per la subunit&agrave; alfa p85 del fosfatidilinositolo 3-chinasi.

Rab5 &#x306F;&#x5C0F;&#x3055;&#x306A;&#x5358;&#x91CF;&#x4F53; GTPase &#x306E;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x4E2D;&#x306E;&#x30D9;&#x30B7;&#x30AF;&#x30EB;&#x878D;&#x5408;&#x30A4;&#x30D9;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;&#x8ABF;&#x6574;&#x306B;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x308B;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x8840;&#x5C0F;&#x677F;&#x7531;&#x6765;&#x5897;&#x6B96;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x4E2D;&#x3001;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB; 3-&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC; &#xFF08;PI3K&#xFF09; &#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3068;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x307E;&#x307E;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x3001;p85 &alpha; &#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8; PI3K &#x306E; Rab5 &#x306B;&#x76F4;&#x63A5;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3057;&#x3066; gtp &#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; (GAP) &#x4F5C;&#x7528; Rab5 &#x306B;&#x5411;&#x304B;&#x3063;&#x3066;&#x6240;&#x6709;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x767A;&#x898B;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;P85 Rab5 &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306B;&#x5411;&#x304B;&#x3063;&#x3066;&#x306E;&#x30AE;&#x30E3;&#x30C3;&#x30D7;&#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B; 2 &#x3064;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x521D;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;p85 &alpha; &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; Rab5 &#x30AE;&#x30E3;&#x30C3;&#x30D7;&#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3001;&#x5B9A;&#x5E38;&#x72B6;&#x614B;&#x306E;&#x30AE;&#x30E3;&#x30C3;&#x30D7;&#x5206;&#x6790;&#x3067;&#x3059;&#x3002;2 &#x756A;&#x76EE;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;p85 &alpha; &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x6709;&#x7121;&#x306B;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A; Rab5 GTP &#x306E;&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x306E;&#x89E6;&#x5A92;&#x7387;&#x306E;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x30EB;&#x58F2;&#x308A;&#x4E0A;&#x3052;&#x9AD8;&#x306E;&#x30AE;&#x30E3;&#x30C3;&#x30D7; &#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3068;&#x30E1;&#x30B8;&#x30E3;&#x30FC;&#x5909;&#x66F4;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB; 3-&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E; p85 &alpha; &#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066; Rab5 GTPase &#x306E;&#x523A;&#x6FC0;&#x3002;

Rab5&#xB294; &#xC791;&#xC740; monomeric GTPase &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;-&#xC911;&#xC7AC; endocytosis &#xC911; &#xAE30; &#xD4E8;&#xC804; &#xC774;&#xBCA4;&#xD2B8; &#xC870;&#xC808;&#xC5D0; &#xAD00;&#xC5EC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB41C; &#xD608;&#xC18C;&#xD310; &#xC720;&#xB798; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC758; endocytosis &#xC911; phosphatidylinositol 3-&#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; (PI3K) &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC640; &#xAD00;&#xB828; &#xC720;&#xC9C0;. &#xC6B0;&#xB9AC; pi3k&#xC758; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xC54C;&#xD30C; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; rab5&#xC5D0; &#xC9C1;&#xC811; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBC0F; Rab5 &#xD5A5;&#xD574; GTPase &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (GAP) &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xBCF4;&#xC720; &#xD558; &#xACE0; &#xBC1C;&#xACAC; &#xD588;&#xB2E4;. &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; Rab5 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xD5A5;&#xD574; p85 &#xAC2D; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC758; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xCCAB; &#xBC88;&#xC9F8; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xC54C;&#xD30C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC740; rab5&#xB85C; &#xAC2D; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xC0AC;&#xC6A9;, &#xC815;&#xC0C1; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC758; &#xAC2D; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC;. &#xB450; &#xBC88;&#xC9F8; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; Rab5 GTP &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xC54C;&#xD30C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC720;&#xBB34;&#xC758; &#xCD09;&#xB9E4; &#xC18D;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xB9E4;&#xCD9C; &#xACA9;&#xCC28; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xBC0F; &#xB300;&#xCC45; &#xBCC0;&#xACBD;.

&#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xBC0F; phosphatidylinositol 3-kinase&#xC758; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xC54C;&#xD30C; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; Rab5 Gtpase&#xC758; &#xC790;&#xADF9;.

Rab5 es una peque&ntilde;a GTPasa monom&eacute;rica interviene en la regulaci&oacute;n de eventos de la fusi&oacute;n de ves&iacute;culas durante la endocitosis mediada por receptor. Durante la endocitosis del receptor del factor de crecimiento derivado de las plaquetas activadas, fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) permanece asociada con el receptor. Hemos encontrado que la subunidad alfa de la p85 de PI3K se une directamente a Rab5 y posee actividad GTPasa-activaci&oacute;n de la prote&iacute;na (GAP) hacia Rab5. Describimos dos m&eacute;todos utilizados para caracterizar la actividad de la brecha de p85 hacia la prote&iacute;na Rab5. El primer m&eacute;todo es un ensayo de brecha de estado estacionario, utilizado para demostrar que la prote&iacute;na alfa p85 tiene actividad brecha hacia Rab5. El segundo m&eacute;todo es una facturaci&oacute;n solo GAP an&aacute;lisis y medidas cambios en la tasa catal&iacute;tica de hidr&oacute;lisis de GTP Rab5 con o sin la prote&iacute;na alfa p85.

Ensayo y estimulaci&oacute;n de la GTPasa Rab5 por la subunidad alfa de la p85 del fosfatidilinositol 3-quinasa.

Rab &#x86CB;&#x767D;&#x671F;&#x95F4;&#x5185;&#x541E;&#x3001; &#x56DE;&#x6536;&#x548C;&#x964D;&#x89E3;&#x6D3B;&#x6027;&#x53D7;&#x4F53;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6FC0;&#x9176;&#x7684;&#x8C03;&#x8282;&#x56CA;&#x6CE1;&#x878D;&#x5408;&#x4E8B;&#x4EF6;&#x3002;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;-3 &#x6FC0;&#x9176;&#x7B2C; p85alpha &#x4E9A;&#x57FA;&#x5DF2;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x86CB;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#x6D3B;&#x6027;&#x8D70;&#x5411; Rab5 &#x548C; Rab4&#xFF0C;&#x4E25;&#x91CD;&#x51CF;&#x5C11;&#x4E86;&#x5355;&#x70B9;&#x7A81;&#x53D8; (p85-R274A&#xFF09; &#x7684;&#x4E00;&#x9879;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;P85 R274A &#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x5BFC;&#x81F4;&#x589E;&#x52A0;&#x7684;&#x8840;&#x5C0F;&#x677F;&#x884D;&#x751F;&#x7684;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x4F53; (&#x53CA;&#x5176;) &#x6FC0;&#x6D3B;&#x548C;&#x4E0B;&#x6E38;&#x4FE1;&#x53F7; &#xFF08;Akt &#x548C; MAPK&#xFF09;&#xFF0C;&#x5728;&#x51CF;&#x5C11;&#x53CA;&#x5176;&#x9000;&#x5316;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x73B0;&#x5728;&#x62A5;&#x544A; p85 R274A &#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x540E;&#x679C;&#x5BFC;&#x81F4;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8F6C;&#x5316;&#x6240;&#x786E;&#x5B9A;&#x7684;&#x4E0B;&#x5217;&#xFF1A; &#x5F02;&#x5E38;&#x5F62;&#x6001;&#x5B66;&#x8868;&#x578B;&#x3001; &#x63A5;&#x89E6;&#x6291;&#x5236;&#x3001; &#x8F6F;&#x743C;&#x8102;&#x4E2D;&#x7684;&#x751F;&#x957F;&#x53CA;&#x88F8;&#x9F20;&#x4F53;&#x5185;&#x80BF;&#x7624;&#x5F62;&#x6210;&#x7684;&#x635F;&#x5931;&#x3002;&#x514D;&#x75AB;&#x7EC4;&#x5316;&#x663E;&#x793A;&#x80BF;&#x7624;&#x5305;&#x542B;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x53CA;&#x5176;&#x4E0E;&#x6D3B;&#x5316; Akt &#x7684;&#x9AD8;&#x6C34;&#x5E73;&#x3002;&#x5171;&#x8868;&#x8FBE;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5360;&#x4E3B;&#x5BFC;&#x5730;&#x4F4D;&#x7684;&#x6D88;&#x6781; Rab5 S34N &#x7A81;&#x53D8;&#x51CF;&#x6BD2;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x8F6C;&#x6362;&#x7684;&#x5C5E;&#x6027;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x7531;&#x4E8E;&#x5355;&#x70B9;&#x7A81;&#x53D8; (R274A) p85alpha RabGAP &#x529F;&#x80FD;&#x7D0A;&#x4E71;&#x8DB3;&#x4EE5;&#x9020;&#x6210;&#x5C40;&#x90E8;&#x626D;&#x8F6C;&#x7531; Rab5 S34N &#x8868;&#x8FBE;&#x5F0F;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;-3 &#x6FC0;&#x9176;&#x72EC;&#x7ACB;&#x673A;&#x5236;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8F6C;&#x5316;&#x3002;P85 Rab &#x529F;&#x80FD;&#x8C03;&#x8282;&#x5728;&#x8FD9;&#x5173;&#x952E;&#x7684;&#x65B0;&#x4F5C;&#x7528;&#x8868;&#x660E; p85 &#x5728;&#x65B0;&#x578B;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x63A7;&#x5236;&#x53D7;&#x4F53;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x548C;&#x8D29;&#x8FD0;&#x901A;&#x8FC7; Rab GTPases &#x5BF9;&#x5176;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;

&#x7834;&#x574F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8F6C;&#x5316;&#x4E2D;&#x7684;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;-3 &#x6FC0;&#x9176;&#x7ED3;&#x679C;&#x7B2C; p85 &#x4E9A;&#x57FA;&#x7684; RabGAP &#x51FD;&#x6570;&#x3002;

Rab proteins regulate vesicle fusion events during the endocytosis, recycling, and degradation of activated receptor tyrosine kinases. The p85alpha subunit of phosphatidylinositol 3-kinase has GTPase-activating protein activity toward Rab5 and Rab4, an activity severely reduced by a single point mutation (p85-R274A). Expression of p85-R274A resulted in increased platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) activation and downstream signaling (Akt and MAPK) and in decreased PDGFR degradation. We now report that the biological consequences of p85-R274A expression cause cellular transformation as determined by the following: aberrant morphological phenotype, loss of contact inhibition, growth in soft agar, and tumor formation in nude mice. Immunohistochemistry shows that the tumors contain activated PDGFR and high levels of activated Akt. Coexpression of a dominant negative Rab5-S34N mutant attenuated these transformed properties. Our results demonstrate that disruption of the RabGAP function of p85alpha due to a single point mutation (R274A) is sufficient to cause cellular transformation via a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism partially reversed by Rab5-S34N expression. This critical new role for p85 in the regulation of Rab function suggests a novel role for p85 in controlling receptor signaling and trafficking through its effects on Rab GTPases.

Disrupted RabGAP function of the p85 subunit of phosphatidylinositol 3-kinase results in cell transformation.

Prot&eacute;ines Rab r&eacute;gulent l&#39;&eacute;v&eacute;nements de fusion de v&eacute;sicules au cours de l&#39;endocytose, le recyclage et la d&eacute;gradation de la tyrosine kinase activ&eacute;e. La sous-unit&eacute; p85alpha de phosphatidylinositol 3-kinase a une activit&eacute; de prot&eacute;ines GTPase-activating vers Rab5 et Rab4, une activit&eacute; s&eacute;v&egrave;rement r&eacute;duite par une mutation ponctuelle (p85-R274A). Expression de p85-R274A entra&icirc;n&eacute; en facteur de croissance d&eacute;riv&eacute; des plaquettes accru l&#39;activation du r&eacute;cepteur (PDGFR) et en aval de signalisation (Akt et MAPK) et en diminue la d&eacute;gradation PDGFR. Nous rapportons maintenant que les cons&eacute;quences biologiques d&#39;expression p85-R274A provoquent une transformation cellulaire tel que d&eacute;termin&eacute; par ce qui suit : ph&eacute;notype morphologique aberrante, perte de l&#39;inhibition de contact, la croissance en g&eacute;lose molle et la formation de tumeurs chez la souris nude. Immunohistochemistry il signale que les tumeurs contiennent activ&eacute; PDGFR et des niveaux &eacute;lev&eacute;s d&#39;Akt activ&eacute;. Coexpression d&#39;un mutant de Rab5-S34N n&eacute;gative dominante a att&eacute;nu&eacute; ces propri&eacute;t&eacute;s transform&eacute;es. Nos r&eacute;sultats d&eacute;montrent que la perturbation de la fonction RabGAP de la p85alpha due &agrave; une mutation ponctuelle (R274A) est suffisante pour provoquer une transformation cellulaire par un m&eacute;canisme ind&eacute;pendant 3-kinase de phosphatidylinositol partiellement renvers&eacute; par Rab5-S34N expression. Ce nouveau r&ocirc;le critique pour p85 dans la r&eacute;gulation de la fonction de Rab sugg&egrave;re un nouveau r&ocirc;le pour p85 en contr&ocirc;lant les r&eacute;cepteurs de signalisation et le trafic par le biais de ses effets sur les Rab GTPases.

Perturb&eacute; la fonction RabGAP de la sous-unit&eacute; p85 desr&eacute;sultats phosphatidylinositol 3-kinase dans la transformation des cellules.

Rab-Proteine regulieren des Vesicle Fusion Ereignisse w&auml;hrend der Endozytose, recycling und Verschlechterung der aktivierten Rezeptor-Tyrosin-Kinasen. Die p85alpha-Untereinheit der Phosphatidylinositol-3-Kinase hat GTPase-Aktivierung von Protein-Aktivit&auml;t gegen&uuml;ber Rab5 und Rab4, eine T&auml;tigkeit, die eine einzelne Punkt-Mutation (p85-R274A) stark reduziert. Ausdruck des p85-R274A f&uuml;hrte erh&ouml;hte Platelet-derived Growth Factor (PDGFR)-Rezeptor-Aktivierung und nachgeschaltete Signalling (Akt und MAPK) und PDGFR-Abbau zur&uuml;ckgegangen. Wir berichten nun, dass die biologischen folgen p85-R274A Ausdrucks zellul&auml;ren Transformation festgelegt durch die folgenden f&uuml;hren: aberrant morphologischen Ph&auml;notyp, Verlust von Kontakt-Hemmung, Wachstum in weiche N&auml;hrboden und Tumorbildung in nackte M&auml;use. Immunohistochemistry zeigt, die die Tumoren enthalten aktiviert PDGFR und ein hohes Ma&szlig; der aktivierten Akt. Coexpression von einer dominierenden negativen Rab5-S34N Mutante abgeschw&auml;cht diese transformierten Eigenschaften. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Unterbrechung der RabGAP Funktion des p85alpha Punktmutationen einzelne (R274A) ausreicht, um zellul&auml;re Transformation &uuml;ber einen Phosphatidylinositol 3-Kinase-unabh&auml;ngigen Mechanismus teilweise r&uuml;ckg&auml;ngig gemacht, von Rab5-S34N Ausdruck verursachen. Diese wichtige neue Rolle f&uuml;r p85 bei der Regulierung der Rab-Funktion schl&auml;gt eine neuartige Rolle f&uuml;r p85 in Rezeptor Signalisierung und Menschenhandel durch ihre Auswirkungen auf Rab GTPases steuern.

RabGAP-Funktion von der p85-Untereinheit der Phosphatidylinositol-3-Kinase-Ergebnisse in Zelle Transformation gest&ouml;rt.

Proteine Rab regolano eventi di fusione della vescicola durante l&#39;endocitosi, il riciclaggio e la degradazione della chinasi tirosina del recettore attivato. La subunit&agrave; p85alpha del fosfatidilinositolo 3-chinasi ha attivit&agrave; di proteina Gap verso Rab5 e Rab4, un&#39;attivit&agrave; gravemente ridotta da una singola mutazione puntiforme (p85-R274A). Espressione di p85-R274A portato nell&#39;attivazione del recettore (PDGFR) maggiore fattore di crescita derivato dalle piastrine e a valle, segnalazione (Akt e MAPK) e nella diminuita degradazione PDGFR. Riportiamo ora che le conseguenze biologiche dell&#39;espressione p85-R274A causano trasformazione cellulare come determinato dalla seguente: aberrante fenotipo morfologico, perdita di contatto inibizione, crescita in agar molle e la formazione di tumori nei topi nudi. Immunoistochimica dimostra che i tumori contengono attivato PDGFR e alti livelli di Akt attivato. Coexpression di un dominante negativo Rab5-S34N mutante attenuato queste propriet&agrave; trasformate. I nostri risultati dimostrano che la perturbazione della funzione RabGAP della p85alpha a causa di una singola mutazione puntiforme (R274A) &egrave; sufficiente a provocare la trasformazione cellulare tramite un meccanismo di fosfatidilinositolo 3-chinasi-indipendente parzialmente invertito dall&#39;espressione Rab5-S34N. Questo nuovo ruolo critico per p85 nella regolazione della funzione di Rab suggerisce un ruolo romanzo per p85 nel controllo receptor signaling e il traffico attraverso i suoi effetti su Rab GTPases.

Funzione RabGAP turbativa della subunit&agrave; p85 deirisultati fosfatidilinositolo 3-chinasi nella trasformazione delle cellule.

&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;-3 &#x6FC0;&#x9176; (&#x808C;&#x9187;&#xFF09; &#x4FE1;&#x53F7;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x901A;&#x8DEF;&#x88AB;&#x64A4;&#x9500;&#x5728;&#x8BB8;&#x591A;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7684;&#x75BE;&#x75C5;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x764C;&#x75C7;&#x3001; &#x7CD6;&#x5C3F;&#x75C5;&#x3001; &#x80A5;&#x80D6;&#x3001; &#x548C;&#x81EA;&#x8EAB;&#x514D;&#x75AB;&#x3002;&#x808C;&#x9187;&#x7531;&#x7B2C; 110 &#x9875;&#x50AC;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x548C;&#x7A33;&#x5B9A;&#x548C;&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x7684;&#x7B2C; 110 &#x9875;&#x808C;&#x9187;&#x6D3B;&#x52A8;&#x6240;&#x9700;&#x7684; p85alpha &#x8C03;&#x8282;&#x86CB;&#x767D;&#x7EC4;&#x6210;&#x3002;&#x7B2C; 110 &#x9875;&#x808C;&#x9187;&#x9176;&#x751F;&#x6210;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8102;&#x8D28;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;-3,4,5-&#x5185;&#xFF0C;&#x8FD9; dephosphorylated &#x7684; PI3-&#x78F7;&#x9178;&#x9176; PTEN &#x7684;&#x5173;&#x952E;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x663E;&#x793A;&#x4E3A; p85alpha &#x8C03;&#x8282;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x53E6;&#x4E00;&#x4E2A;&#x51FD;&#x6570;&#xFF1A; &#x5B83;&#x76F4;&#x63A5;&#x5411;&#x7ED1;&#x5B9A;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4E14;&#x589E;&#x5F3A;&#x4E86; PTEN &#x8102;&#x8D28;&#x78F7;&#x9178;&#x9176;&#x6D3B;&#x6027;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BC1;&#x660E;&#xFF0C;ectopically &#x8868;&#x793A;&#x6807;&#x5FD7;&#x6807;&#x8BB0; p85 coimmunoprecipitates &#x5185;&#x6E90;&#x6027;&#x6291;&#x764C;&#x57FA;&#x56E0; PTEN &#x5728;&#x8868;&#x76AE;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x7684;&#x4F9B;&#x517B;&#x65B9;&#x5F0F;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FD8;&#x5728;&#x764C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x663E;&#x793A;&#x5185;&#x6E90;&#x6027; p85 &#x548C; pten &#x57FA;&#x56E0;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x8868;&#x76AE;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D6;&#x51B3;&#x4E8E; coimmunoprecipitation&#x3002;&#x56E0;&#x6B64; p85 &#x4F5C;&#x4E86;&#x89C4;&#x5B9A;&#xFF0C;&#x7B2C; 110 &#x9875;&#x808C;&#x9187;&#x548C; pten &#x86CB;&#x767D;&#x78F7;&#x9178;&#x9176;&#x901A;&#x8FC7;&#x76F4;&#x63A5;&#x7684;&#x4E92;&#x52A8;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E00;&#x7ED3;&#x8BBA;&#x5F3A;&#x8C03;&#x5FC5;&#x987B;&#x8C28;&#x614E;&#x5730;&#x5206;&#x6790;&#x808C;&#x9187;&#x6D3B;&#x52A8;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x53CD; p85 immunoprecipitations &#x53EF;&#x80FD;&#x5305;&#x542B;&#x4E24;&#x4E2A; p85:p110-&#x808C;&#x9187;&#x548C; p85:PTEN-&#x78F7;&#x9178;&#x9176;&#x9176;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x8861;&#x91CF;&#x51C0;&#x808C;&#x9187;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BC6;&#x522B; N &#x7EC8;&#x7AEF; SH3 BH &#x533A;&#x57DF;&#x7684; p85alpha&#xFF0C;&#x7F3A;&#x5E2D;&#x4E2D;&#x8F83;&#x5C0F;&#x7684; p55alpha &#x548C; p50alpha &#x5F02;&#x6784;&#x4F53;&#xFF0C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4ECB;&#x5BFC; PTEN &#x7ED1;&#x5B9A;&#x548C;&#x89C4;&#x4F8B;&#x7684;&#x5730;&#x533A;&#x3002;P85DeltaSH3 BH &#x7684;&#x8702;&#x7A9D;&#x8868;&#x8FBE;&#x5F0F;&#x7684;&#x7ED3;&#x679C;&#x5927;&#x5927;&#x589E;&#x52A0;&#x7684;&#x89C4;&#x6A21;&#x548C; pAkt &#x6C34;&#x5E73;&#x5BF9;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x523A;&#x6FC0;&#x53CD;&#x5E94;&#x7684;&#x6301;&#x7EED;&#x65F6;&#x95F4;&#x3002;P85 &#x7ED1;&#x5B9A;&#x548C;&#x76F4;&#x63A5;&#x7BA1;&#x5236;&#x7B2C; 110 &#x9875;&#x808C;&#x9187;&#x548C;&#x6291;&#x764C;&#x57FA;&#x56E0; PTEN-PI3-&#x78F7;&#x9178;&#x9176;&#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x4F7F;&#x6211;&#x4EEC;&#x80FD;&#x591F;&#x89E3;&#x91CA;&#x81EA;&#x76F8;&#x77DB;&#x76FE;&#x7684;&#x80F0;&#x5C9B;&#x7D20;&#x4FE1;&#x53F7;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5C0F;&#x9F20;&#x4E0E;&#x51CF;&#x5C11;&#x7684;&#x808C;&#x9187;&#x6216;&#x6291;&#x764C;&#x57FA;&#x56E0; PTEN &#x86CB;&#x767D;&#x8868;&#x578B;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E00;&#x53D1;&#x73B0;&#x5C06;&#x4F1A;&#x5F71;&#x54CD;&#x6B63;&#x5728;&#x8FDB;&#x884C;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x7528;&#x9488;&#x5BF9;&#x808C;&#x9187;/PTEN/Akt &#x901A;&#x8DEF;&#x7684;&#x7597;&#x6CD5;&#x3002;

&#x76F4;&#x63A5;&#x79EF;&#x6781;&#x8C03;&#x8282;&#x7684;&#x6291;&#x764C;&#x57FA;&#x56E0; PTEN &#x7684;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;-3 &#x6FC0;&#x9176;&#x7B2C; p85 &#x4E9A;&#x57FA;&#x3002;

The phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway is deregulated in many human diseases including cancer, diabetes, obesity, and autoimmunity. PI3K consists of a p110 catalytic protein and a p85alpha regulatory protein, required for the stabilization and localization of p110-PI3K activity. The p110-PI3K enzyme generates the key signaling lipid phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, which is dephosphorylated by the PI3-phosphatase PTEN. Here we show another function for the p85alpha regulatory protein: it binds directly to and enhances PTEN lipid phosphatase activity. We demonstrate that ectopically expressed FLAG-tagged p85 coimmunoprecipitates endogenous PTEN in an epidermal growth factor dependent manner. We also show epidermal growth factor dependent coimmunoprecipitation of endogenous p85 and PTEN proteins in HeLa cells. Thus p85 regulates both p110-PI3K and PTEN-phosphatase enzymes through direct interaction. This finding underscores the need for caution in analyzing PI3K activity because anti-p85 immunoprecipitations may contain both p85:p110-PI3K and p85:PTEN-phosphatase enzymes and thus measure net PI3K activity. We identify the N-terminal SH3-BH region of p85alpha, absent in the smaller p55alpha and p50alpha isoforms, as the region that mediates PTEN binding and regulation. Cellular expression of p85DeltaSH3-BH results in substantially increased magnitude and duration of pAkt levels in response to growth factor stimulation. The ability of p85 to bind and directly regulate both p110-PI3K and PTEN-PI3-phosphatase allows us to explain the paradoxical insulin signaling phenotypes observed in mice with reduced PI3K or PTEN proteins. This discovery will impact ongoing studies using therapeutics targeting the PI3K/PTEN/Akt pathway.

Direct positive regulation of PTEN by the p85 subunit of phosphatidylinositol 3-kinase.

La voie de signalisation phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) est d&eacute;r&eacute;glement&eacute;e dans plusieurs maladies humaines, y compris le cancer, le diab&egrave;te, l&#39;ob&eacute;sit&eacute; et l&#39;auto-immunit&eacute;. PI3K se compose d&#39;une prot&eacute;ine catalytique p110 et une prot&eacute;ine r&eacute;gulatrice de la p85alpha, requis pour la stabilisation et la localisation de l&#39;activit&eacute; p110-PI3K. L&#39;enzyme PI3K-p110 g&eacute;n&egrave;re la cl&eacute; signalisation lipidique phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, qui est d&eacute;phosphoryl&eacute;e par le PTEN PI3-phosphatase. Ici, nous montrons une autre fonction de la prot&eacute;ine r&eacute;gulatrice de la p85alpha : il se lie directement &agrave; et am&eacute;liore l&#39;activit&eacute; de la phosphatase lipidique PTEN. Nous d&eacute;montrons que celle exprim&eacute;e fa&ccedil;on ectopique p85 tag drapeau coimmunoprecipitates PTEN endog&egrave;ne d&#39;une mani&egrave;re d&eacute;pendante de facteur de croissance &eacute;pidermique. Nous montrons aussi facteur de croissance &eacute;pidermique co-immunopr&eacute;cipitation d&eacute;pendant de p85 endog&egrave;ne et prot&eacute;ines PTEN dans les cellules HeLa. Donc p85 r&eacute;glemente les p110-PI3K et enzymes de PTEN-phosphatase par interaction directe. Ce constat souligne la n&eacute;cessit&eacute; de faire preuve de prudence dans l&#39;analyse des activit&eacute; de PI3K parce qu&#39;anti-p85 immunopr&eacute;cipitation peut contenir les deux p85:p110-PI3K et p85:PTEN-enzymes phosphatase et donc mesure net activit&eacute; PI3K. Nous identifions la r&eacute;gion N-terminale SH3-BH p85alpha, absent dans les plus petites isoformes de p55alpha et p50alpha, comme la r&eacute;gion qui intervient dans la r&eacute;gulation et liaison de PTEN. Expression cellulaire du p85DeltaSH3-BH entra&icirc;ne une augmentation substantielle des amplitude et dur&eacute;e des niveaux pAkt en r&eacute;ponse &agrave; la stimulation du facteur de croissance. La capacit&eacute; de p85 de lier et de r&eacute;gler directement le p110-PI3K et PI3-PTEN-phosphatase nous permet d&#39;expliquer l&#39;insuline paradoxale des ph&eacute;notypes observ&eacute;s chez les souris avec PI3K r&eacute;duite ou PTEN, prot&eacute;ines de signalisation. Cette d&eacute;couverte aura un impact des &eacute;tudes en cours &agrave; l&#39;aide de m&eacute;thodes th&eacute;rapeutiques ciblant la voie PTEN/PI3K/Akt.

R&eacute;glementation positive directe du g&egrave;ne PTEN par la sous-unit&eacute; p85 de phosphatidylinositol 3-kinase.

Der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)-Signalweg ist in vielen menschlichen Krankheiten, einschlie&szlig;lich Krebs, Diabetes, Fettleibigkeit und Autoimmunit&auml;t dereguliert. PI3K besteht eine katalytische p110-Protein und ein p85alpha regelndes Protein, f&uuml;r die Stabilisierung und Lokalisierung von p110-PI3K Aktivit&auml;t erforderlich. Das Enzym p110-PI3K generiert den Schl&uuml;ssel Signalisierung Lipid Phosphatidylinositol 3,4,5-Trisphosphate, die von der PI3-Phosphatase PTEN dephosphorylated ist. Hier zeigen wir eine andere Funktion f&uuml;r die p85alpha regelndes Protein: bindet direkt an und verbessert die PTEN Lipid-Phosphatase-Aktivit&auml;t. Wir zeigen, dass ectopically ausgedr&uuml;ckt Flagge markiert p85 Coimmunoprecipitates endogene PTEN epidermalen Wachstumsfaktor abh&auml;ngigen Weise. Wir zeigen auch epidermalen Wachstumsfaktor abh&auml;ngige Coimmunoprecipitation endogene p85 und PTEN Proteine in HeLa-Zellen. So regelt p85 p110-PI3K und PTEN-Phosphatase Enzyme durch direkte Interaktion. Diese Feststellung unterstreicht die Notwendigkeit zur Vorsicht PI3K Aktivit&auml;t zu analysieren, da Anti-p85 Immunpr&auml;zipitation m&ouml;glicherweise beide P85:p110 enthalten-PI3K und P85:PTEN-Phosphatase Enzyme und damit die Ma&szlig;nahme net PI3K Aktivit&auml;t. Wir identifizieren die N-terminalen SH3-BH-Region von p85alpha, fehlt in den kleineren p55alpha und p50alpha-Isoformen, als der Region, die PTEN Bindung und Verordnung vermittelt. Zellul&auml;re Ausdruck des p85DeltaSH3-BH f&uuml;hrt zu deutlich erh&ouml;hten Helligkeit und Dauer der pAkt Ebenen in Reaktion auf Wachstumsfaktor Stimulation. Die F&auml;higkeit des p85 binden und direkt regulieren p110-PI3K und PTEN-PI3-Phosphatase erm&ouml;glicht es uns, das Paradoxe Insulin Signalisierung Ph&auml;notypen beobachtet bei M&auml;usen mit reduzierten PI3K oder PTEN Proteine zu erkl&auml;ren. Diese Entdeckung wird laufende Studien mit Therapeutika, die gezielt die PTEN/PI3K/Akt-Signalweg auswirken.

Direkte positive Regulierung PTEN durch die p85-Untereinheit der Phosphatidylinositol-3-Kinase.

La via di segnalazione fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) &egrave; liberalizzata in molte malattie umane, tra cui il cancro, diabete, obesit&agrave; e autoimmunit&agrave;. PI3K &egrave; costituito da una proteina catalitica p110 e p85alpha regolamentare per una proteina, la stabilizzazione e la localizzazione di attivit&agrave; p110-PI3K. L&#39;enzima PI3K p110 genera la chiave segnalazione lipidico fosfatidilinositolo 3, 4,5-trifosfato, che &egrave; defosforilata dalla PI3-fosfatasi PTEN. Qui vi mostriamo un&#39;altra funzione per la proteina di p85alpha regolamentare: si lega direttamente a e migliora PTEN lipidi fosfatasi attivit&agrave;. Dimostriamo che ectopically espresso coimmunoprecipitates tagged bandiera p85 PTEN endogeno in maniera dipendente dal fattore di crescita epidermico. Mostriamo anche fattore di crescita epidermico dipendente coimmunoprecipitation p85 endogeno e PTEN proteine in cellule HeLa. Cos&igrave; p85 regola sia p110-PI3K ed enzimi fosfatasi PTEN attraverso l&#39;interazione diretta. Questa constatazione sottolinea la necessit&agrave; di attenzione nell&#39;analizzare PI3K attivit&agrave; perch&eacute; anti-p85 immunoprecipitazione pu&ograve; contenere entrambi p85:p110-PI3K e p85:PTEN-enzimi fosfatasi e quindi misura net PI3K attivit&agrave;. Identifichiamo la regione N-terminale SH3-BH p85alpha, assente in isoforme minori di p55alpha e p50alpha, come la regione che media associazione PTEN e regolamento. Cellulare espressione dei risultati p85DeltaSH3-BH in entit&agrave; sostanzialmente aumentato e la durata del patto livelli in risposta alla stimolazione del fattore di crescita. La capacit&agrave; di p85 associare e regolare direttamente sia p110-PI3K e PTEN-PI3-fosfatasi ci permette di spiegare l&#39;insulina paradossale fenotipi osservati nei topi con PI3K ridotta o PTEN proteine di segnalazione. Questa scoperta avr&agrave; un impatto in corso studi utilizzando terapie targeting il pathway PI3K/PTEN/Akt.

Regolamento positivo diretto di PTEN dalla subunit&agrave; p85 del fosfatidilinositolo 3-chinasi.

&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB; 3-&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC; &#xFF08;PI3K&#xFF09; &#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306F;&#x3001;&#x304C;&#x3093;&#x3001;&#x7CD6;&#x5C3F;&#x75C5;, &#x80A5;&#x6E80;, &#x3068;&#x81EA;&#x5DF1;&#x514D;&#x75AB;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x75C5;&#x6C17;&#x306E;&#x81EA;&#x7531;&#x5316;&#x3067;&#x3059;&#x3002;PI3K &#x306E; p110 &#x89E6;&#x5A92;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3068; p85alpha &#x306E;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;, &#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x304A;&#x3088;&#x3073; PI3K &#x306E; p110 &#x6D3B;&#x6027;&#x306E;&#x5C40;&#x5728;&#x306B;&#x5FC5;&#x8981;&#x306A;&#x3067;&#x69CB;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;P110 PI3K &#x9175;&#x7D20;&#x306F; PI3 &#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC; PTEN &#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x8131;&#x71D0;&#x9178;&#x5316;&#x8102;&#x8CEA;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB; 3,4,5-&#x4E09;&#x3001;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0; &#x30AD;&#x30FC;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x4ED6;&#x306E;&#x95A2;&#x6570; p85alpha &#x8ABF;&#x7BC0;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x8868;&#x793A;: &#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x76F4;&#x63A5;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3057;&#x3066; PTEN &#x8102;&#x8CEA;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x5897;&#x5F37;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x306F;&#x57F9;&#x990A;&#x30D5;&#x30E9;&#x30B0;&#x4ED8;&#x3051; p85 coimmunoprecipitates &#x8868;&#x73FE;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x4E0A;&#x76AE;&#x6210;&#x9577;&#x56E0;&#x5B50;&#x4F9D;&#x5B58;&#x7684;&#x3067;&#x5185;&#x751F; PTEN&#x3002;HeLa &#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x4E0A;&#x76AE;&#x6210;&#x9577;&#x56E0;&#x5B50;&#x4F9D;&#x5B58; coimmunoprecipitation &#x5185;&#x56E0;&#x6027; p85 &#x3068; PTEN &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x307E;&#x305F;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3046;&#x3057;&#x3066; p85 PI3K &#x306E; p110 &#x3068; PTEN &#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;&#x9175;&#x7D20;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x76F4;&#x63A5;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x767A;&#x898B;&#x306E;&#x5FC5;&#x8981;&#x6027;&#x3092;&#x53CD; p85 immunoprecipitations &#x4E21;&#x65B9;&#x306E; p85:p110 &#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x306E;&#x3067; PI3K &#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D3;&#x30C6;&#x30A3;&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x306B;&#x6CE8;&#x610F;&#x3092;&#x5F37;&#x8ABF;-PI3K &#x3068; p85:PTEN-net PI3K &#x6D3B;&#x52D5;&#x30A2;&#x30EB;&#x30AB;&#x30EA;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x3053;&#x3046;&#x3057;&#x3066;&#x30E1;&#x30B8;&#x30E3;&#x30FC;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306E; p85alpha&#x3001;SH3 BH N &#x30BF;&#x30FC;&#x30DF;&#x30CA;&#x30EB;&#x9818;&#x57DF;&#x6B20;&#x5E2D;&#x5C0F;&#x3055;&#x3044; p55alpha &#x3068; p50alpha &#x30A2;&#x30A4;&#x30BD; &#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x3067; PTEN &#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x3068;&#x898F;&#x5236;&#x3092;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B;&#x5730;&#x57DF;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x8B58;&#x5225;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x643A;&#x5E2F;&#x5F0F; p85DeltaSH3 BH &#x7D50;&#x679C;&#x3092;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x9AD8;&#x3081;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x5927;&#x304D;&#x3055;&#x3068;&#x6210;&#x9577;&#x56E0;&#x5B50;&#x523A;&#x6FC0;&#x5FDC;&#x7B54;&#x306E; pAkt &#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x306E;&#x671F;&#x9593;&#x306E;&#x3002;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3057;&#x3001;PI3K &#x306E; p110 &#x3068; PTEN PI3 &#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;&#x3092;&#x76F4;&#x63A5;&#x898F;&#x5236;&#x3059;&#x308B; p85 &#x306E;&#x80FD;&#x529B;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x524A;&#x6E1B; PI3K &#x307E;&#x305F;&#x306F; PTEN &#x306E;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3092;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3057;&#x305F;&#x8868;&#x73FE;&#x578B;&#x3092;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x9006;&#x8AAC;&#x7684;&#x306A;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x767A;&#x898B; PI3K/PTEN/Akt &#x7D4C;&#x8DEF;&#x3092;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x6CBB;&#x7642;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x9032;&#x884C;&#x4E2D;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB; 3-&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E; p85 &#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306B;&#x3088;&#x308B; PTEN &#x306E;&#x76F4;&#x63A5;&#x6B63;&#x306E;&#x898F;&#x5236;&#x3002;

Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) &#xC2E0;&#xD638; &#xD1B5;&#xB85C; &#xB9CE;&#xC740; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC9C8;&#xBCD1; &#xC554;, &#xB2F9;&#xB1E8;&#xBCD1;, &#xBE44;&#xB9CC; &#xBC0F; &#xC790;&#xAC00; &#xBA74;&#xC5ED; &#xB4F1;&#xC758; &#xADDC;&#xC81C; &#xC644;&#xD654;. PI3K p110 &#xCD09;&#xB9E4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC548;&#xC815;&#xD654; &#xBC0F; p110 PI3K &#xD65C;&#xB3D9;&#xC758; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654;&#xC5D0; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; p85alpha &#xADDC;&#xC815; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAD6C;&#xC131; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. P110 PI3K &#xD6A8;&#xC18C; PI3-&#xC778;&#xC0B0; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD6A8;&#xC18C; PTEN, dephosphorylated&#xB294; trisphosphate-&#xC9C0;&#xC9C8; phosphatidylinositol 3,4,5, &#xC2E0;&#xD638; &#xD0A4;&#xB97C; &#xC0DD;&#xC131; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC; p85alpha &#xADDC;&#xC81C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB2E4;&#xB978; &#xAE30;&#xB2A5; &#xD45C;&#xC2DC;: &#xADF8;&#xAC83;&#xC5D0; &#xC9C1;&#xC811; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD558;&#xACE0; PTEN &#xC9C0;&#xC9C8; &#xC778;&#xC0B0; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD6A8;&#xC18C; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xC2DC;&#xD0B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; ectopically &#xD50C;&#xB798;&#xADF8; &#xD0DC;&#xADF8; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 coimmunoprecipitates &#xD45C;&#xD604; &#xC124;&#xBA85; &#xC0DD; PTEN &#xD45C; &#xD53C; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; &#xC758;&#xC874; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC5D0;&#xC11C;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB610;&#xD55C; &#xD5EC;&#xB7EC; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0DD; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 PTEN &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC885;&#xC18D; coimmunoprecipitation&#xC744; &#xD45C; &#xD53C; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 p110 pi3k&#xC640; &#xC9C1;&#xC811; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; PTEN &#xC778;&#xC0B0; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD6A8;&#xC18C; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC870;&#xC808;. &#xC774; &#xCC3E;&#xB294; &#xC548;&#xD2F0; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 immunoprecipitations p85:p110 &#xBAA8;&#xB450; &#xD3EC;&#xD568; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC73C;&#xBBC0;&#xB85C; PI3K &#xD65C;&#xB3D9; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xC8FC;&#xC758; &#xB300; &#xD55C; &#xD544;&#xC694;&#xC131;&#xC744; &#xBC11;&#xC904;-PI3K &#xBC0F; p85:PTEN-&#xC778;&#xC0B0; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD6A8;&#xC18C; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC640; &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; &#xCE21;&#xC815; net PI3K &#xD65C;&#xB3D9;. &#xC6B0;&#xB9AC; p85alpha, N-&#xD130;&#xBBF8;&#xB110; SH3 BH &#xC9C0;&#xC5ED; &#xACB0; &#xC11D;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xC791;&#xC740; p55alpha&#xC640; p50alpha isoforms PTEN &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xBC0F; &#xB808; &#xADE4; &#xB808;&#xC774; &#xC158;&#xC744; &#xC911;&#xC7AC; &#xD558;&#xB294; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xC73C;&#xB85C;. P85DeltaSH3 BH&#xC758; &#xC140;&#xB8F0;&#xB7EC; &#xC2DD;&#xC758; &#xC2E4;&#xC9C8;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC99D;&#xAC00; &#xADDC;&#xBAA8;&#xC640; &#xAE30;&#xAC04; pAkt &#xC218;&#xC900; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; &#xC790;&#xADF9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC751;&#xB2F5;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC;. &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD558;&#xACE0; p110 PI3K &#xBC0F; PTEN PI3 &#xC778;&#xC0B0; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD6A8;&#xC18C;&#xB97C; &#xC9C1;&#xC811; &#xC870;&#xC808; &#xB2A5;&#xB825; &#xACE0;&#xAE30; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAC10;&#xC18C; PI3K &#xB610;&#xB294; PTEN &#xB9C8;&#xC6B0;&#xC2A4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xCC30; &#xB41C; &#xC2E0;&#xD638; &#xC5ED;&#xC124;&#xC801; &#xC778;&#xC290;&#xB9B0;&#xC744; &#xC124;&#xBA85;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBC1C;&#xACAC; PI3K/PTEN/Akt &#xACBD;&#xB85C; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xCE58;&#xB8CC;&#xC81C;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC9C0;&#xC18D;&#xC801;&#xC778; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC904; &#xAC83; &#xC774;&#xB2E4;.

Phosphatidylinositol 3-kinase&#xC758; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; PTEN&#xC758; &#xC9C1;&#xC811; &#xAE0D;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xADDC;&#xC81C;.

La v&iacute;a de se&ntilde;alizaci&oacute;n fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) est&aacute; desregulada en muchas enfermedades humanas, incluyendo el c&aacute;ncer, diabetes, obesidad y autoinmunidad. PI3K consiste en una prote&iacute;na catal&iacute;tica p110 y una prote&iacute;na reguladora de p85alpha, necesaria para la estabilizaci&oacute;n y la localizaci&oacute;n de la actividad de PI3K-p110. La enzima PI3K-p110 genera la clave se&ntilde;alizaci&oacute;n l&iacute;pidos fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato, que es defosforilaciones por el PTEN PI3-fosfatasa. A continuaci&oacute;n os mostramos otra funci&oacute;n de la prote&iacute;na reguladora de p85alpha: se une directamente al y aumenta la actividad de la fosfatasa de l&iacute;pidos PTEN. Demostramos que expresaron ect&oacute;picamente p85 con etiquetas bandera coimmunoprecipitates PTEN end&oacute;gena de una manera dependiente del factor de crecimiento epid&eacute;rmico. Tambi&eacute;n mostramos coimmunoprecipitation dependiente de factor de crecimiento epid&eacute;rmico de p85 end&oacute;geno y PTEN prote&iacute;nas en c&eacute;lulas HeLa. As&iacute; p85 regula tanto p110-PI3K y enzimas de PTEN-fosfatasa a trav&eacute;s de una interacci&oacute;n directa. Este hallazgo subraya la necesidad de precauci&oacute;n al analizar la actividad de PI3K porque anti-p85 immunoprecipitations puede contener ambos p85:p110-PI3K y p85:PTEN-enzimas fosfatasa y as&iacute; medida neto actividad PI3K. Identificamos la regi&oacute;n N-terminal SH3-BH de p85alpha, ausente en las isoformas de p55alpha y p50alpha m&aacute;s peque&ntilde;as, como la regi&oacute;n que media la regulaci&oacute;n y vinculante de PTEN. Expresi&oacute;n celular de p85DeltaSH3-BH resulta en un aumento sustancial de la magnitud y duraci&oacute;n de los niveles pAkt en respuesta al est&iacute;mulo del factor de crecimiento. La capacidad de p85 para atar y regular directamente tanto p110-PI3K y PTEN-PI3-fosfatasa nos permite explicar la insulina parad&oacute;jica fenotipos observados en los ratones con PI3K reducida o PTEN prote&iacute;nas de se&ntilde;alizaci&oacute;n. Este descubrimiento impactar&aacute; los estudios utilizando terapias dirigidas a la v&iacute;a de PI3K/Akt/PTEN.

Regulaci&oacute;n positiva directa de PTEN por la subunidad p85 de fosfatidilinositol 3-quinasa.

&#x6FC0;&#x6D3B;&#x53D7;&#x4F53;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6FC0;&#x9176;&#x62DB;&#x52DF;&#x8BB8;&#x591A;&#x4FE1;&#x53F7;&#x86CB;&#x767D;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x4E0B;&#x6E38;&#x7EC6;&#x80DE;&#x589E;&#x6B96;&#x548C;&#x751F;&#x5B58;&#x7684;&#x51FA;&#x8DEF;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x808C;&#x9187;-3 &#x6FC0;&#x9176; (&#x808C;&#x9187;&#xFF09; p85 &#x8C03;&#x8282;&#x86CB;&#x767D;&#x548C;&#x7B2C; 110 &#x9875;&#x50AC;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7EC4;&#x6210;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x6700;&#x8FD1;&#x5C55;&#x793A;&#x4E86; p85alpha &#x86CB;&#x767D;&#x4E5F;&#x5DF2;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x86CB;&#x767D; (GAP) &#x6D3B;&#x52A8;&#x671D;&#x7740; Rab5 &#x548C; Rab4&#x3001; &#x8C03;&#x8282;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x53D7;&#x4F53;&#x56CA;&#x6CE1;&#x8D29;&#x5356;&#x4EBA;&#x53E3;&#x4E8B;&#x4EF6;&#x7684;&#x5C0F;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x4F53;&#x5916;&#x86CB;&#x767D;&#x3002;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x5DEE;&#x8DDD;&#x6709;&#x7F3A;&#x9677;&#x7A81;&#x53D8;&#xFF0C;p85R274A&#xFF0C;&#x5BFC;&#x81F4;&#x6301;&#x7EED;&#x7684;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x8840;&#x5C0F;&#x677F;&#x884D;&#x751F;&#x7684;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x4F53; (PDGFRs)&#xFF0C;&#x5E76;&#x52A0;&#x5F3A;&#x4E0B;&#x6E38;&#x4FE1;&#x53F7;&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x62A5;&#x544A;&#x4E2D;&#x6211;&#x4EEC;&#x6709;&#x7279;&#x70B9; Rab5 &#x548C; Rab4 &#x4ECB;&#x5BFC;&#x53CA;&#x5176;&#x8D29;&#x8FD0;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; p85 &#x548C;&#x5DEE;&#x8DDD;&#x6709;&#x7F3A;&#x9677;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53; p85R274A &#x8868;&#x793A;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x3002;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; p85 &#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5DF2;&#x7ECF;&#x6162;&#x53CA;&#x5176;&#x8D29;&#x8FD0;&#x4E0E;&#x589E;&#x5F3A;&#x5DEE;&#x8DDD;&#x6D3B;&#x52A8;&#x505C;&#x7528; Rab5 &#x548C; Rab4 &#x6765;&#x963B;&#x6B62;&#x5176;&#x56CA;&#x6CE1;&#x8D29;&#x8FD0;&#x804C;&#x80FD;&#x76F8;&#x4E00;&#x81F4;&#x3002;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53; p85R274A &#x8868;&#x8FBE;&#x589E;&#x52A0;&#x5185;&#x5728;&#x5316;&#x7387;&#x7684; PDGFRs&#xFF0C;&#x4E00;&#x4E2A;&#x4F9D;&#x8D56; Rab5 &#x7684;&#x8FC7;&#x7A0B;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4E14;&#x4E0D;&#x4F1A;&#x963B;&#x6B62;&#x53CA;&#x5176;&#x6CDB;&#x3002;&#x514D;&#x75AB;&#x8367;&#x5149;&#x6CD5;&#x7814;&#x7A76;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x8868;&#x660E; p85R274A &#x8868;&#x793A;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x663E;&#x793A; Rab5 &#x79EF;&#x7D2F;&#x5728;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5185;&#x7684;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x3002;&#x4E0B;&#x62C9;&#x5217;&#x8868;&#x548C;&#x8131;&#x8272; &#xFF08;&#x8367;&#x5149;&#x5149;&#x6F02;&#x767D;&#x540E;&#x7684;&#x6062;&#x590D;&#xFF09; &#x5B9E;&#x9A8C;&#x8868;&#x660E;&#x8FD9;&#x662F;&#x53EF;&#x80FD;&#x819C;&#x5173;&#x8054; Rab5-GTP&#xFF0C;p85R274A &#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x6301;&#x7EED;&#x4E0B;&#x964D;&#x7684; p85 &#x5DEE;&#x8DDD;&#x6D3B;&#x52A8;&#x6240;&#x81F4;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x4E5F;&#x66FE;&#x5927;&#x91CF;&#x6FC0;&#x6D3B; PDGFRs Rab4 &#x79EF;&#x6781;&#x56DE;&#x6536; endosomes &#x4E2D;&#xFF0C;&#x901A;&#x5E38;&#x5305;&#x542B;&#x4E3B;&#x8981;&#x7684;&#x8F66;&#x53A2;&#x7A7F;&#x5B54;-&#x505C;&#x7528;/dephosphorylated &#x53D7;&#x4F53;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E; p85 &#x7684;&#x5DEE;&#x8DDD;&#x53CA;&#x5176;&#x76F8;&#x5173;&#x6D3B;&#x52A8;&#x8C03;&#x8282;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5F71;&#x54CD;&#x7684;&#x6D3B;&#x5316;&#x53CA;&#x5176;&#x901A;&#x8FC7; endosomal &#x8F66;&#x53A2;&#x8FD0;&#x52A8;&#x7684; Rab5 &#x548C; Rab4 &#x4E24;&#x79CD;&#x529F;&#x80FD;&#x3002;&#x4E2D;&#x65AD;&#x6B64;&#x8C03;&#x8282; p85R274A &#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x53CA;&#x5176;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;/&#x8131;&#x78F7;&#x3001; &#x964D;&#x89E3;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x548C;&#x901A;&#x8FC7;&#x6539;&#x53D8;&#x65F6;&#x95F4;&#x53D7;&#x4F53;&#x4E0B;&#x6E38;&#x4FE1;&#x53F7;&#x82B1;&#x5728;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5185; endosomal &#x8F66;&#x53A2;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E; p85alpha &#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x8D29;&#x5356;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x5C06;&#x663E;&#x8457;&#x5F71;&#x54CD;&#x53D7;&#x4F53;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x548C;&#x9000;&#x5316;&#x7684; Rab &#x4ECB;&#x5BFC;&#x53CA;&#x5176;&#x91CD;&#x8981;&#x8C03;&#x8282;&#x5668;&#x3002;

&#x653E;&#x677E;&#x7BA1;&#x5236; Rab5 &#x548C; Rab4 &#x86CB;&#x767D; p85R274A &#x8868;&#x793A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7684;&#x6539;&#x53D8;&#x53CA;&#x5176;&#x8D29;&#x8FD0;&#x3002;

Activated receptor tyrosine kinases recruit many signaling proteins to activate downstream cell proliferation and survival pathways, including phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) consisting of a p85 regulatory protein and a p110 catalytic protein. We have recently shown the p85alpha protein also has in vitro GTPase activating protein (GAP) activity towards Rab5 and Rab4, small GTPases that regulate vesicle trafficking events for activated receptors. Expression of a GAP-defective mutant, p85R274A, resulted in sustained levels of activated platelet-derived growth factor receptors (PDGFRs) and enhanced downstream signaling. In this report we have characterized Rab5- and Rab4-mediated PDGFR trafficking in cells expressing wild type p85 and GAP-defective mutant p85R274A. Wild type p85 overexpressing cells had slower PDGFR trafficking consistent with enhanced GAP activity deactivating Rab5 and Rab4 to block their vesicle trafficking functions. Mutant p85R274A expression increased the internalization rate of PDGFRs, a Rab5-dependent process, without preventing PDGFR ubiquitination. Immunofluorescence studies further demonstrated that p85R274A-expressing cells showed Rab5 accumulation at intracellular locations. Pull-down and FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) experiments indicate this is likely membrane-associated Rab5-GTP, sustained due to decreased p85 GAP activity for the p85R274A mutant. These cells also had substantial amounts of activated PDGFRs in Rab4-positive recycling endosomes, a compartment that usually contains primarily deactivated/dephosphorylated receptors. Our results suggest that the PDGFR-associated GAP activity of p85 regulates both Rab5 and Rab4 functions in cells to influence the movement of activated PDGFR through endosomal compartments. Disruption of this regulation by p85R274A expression impacts PDGFR phosphorylation/dephosphorylation, degradation kinetics and downstream signaling by altering the time receptors spend in specific intracellular endosomal compartments. These results demonstrate that the p85alpha protein is an important regulator of Rab-mediated PDGFR trafficking, which significantly impacts receptor signaling and degradation.

Deregulation of Rab5 and Rab4 proteins in p85R274A-expressing cells alters PDGFR trafficking.

Tyrosine kinase activ&eacute;e recrute plusieurs prot&eacute;ines de signalisation pour activer les voies de la prolif&eacute;ration et la survie cellulaire en aval, y compris phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) consistant en une prot&eacute;ine r&eacute;gulatrice p85 et une prot&eacute;ine catalytique p110. Nous avons r&eacute;cemment montr&eacute; que la prot&eacute;ine p85alpha a aussi le lancement de GTPase in vitro l&#39;activit&eacute; prot&eacute;ine (GAP) vers Rab5 et des Rab4, des petites GTPases qui r&eacute;gulent les &eacute;v&egrave;nements de trafic v&eacute;siculaire pour r&eacute;cepteurs activ&eacute;s. Expression d&#39;un mutant de GAP-d&eacute;fectueux, p85R274A, a donn&eacute; lieu &agrave; des niveaux soutenus d&#39;activation de r&eacute;cepteurs de facteur de croissance d&eacute;riv&eacute; des plaquettes (PDGFRs) et am&eacute;lior&eacute; la signalisation en aval. Dans le pr&eacute;sent rapport, nous avons caract&eacute;ris&eacute; par Rab5 et Rab4 PDGFR traite des cellules exprimant p85 de type sauvage et p85R274A mutant GAP-d&eacute;fectueux. Cellules surexprimant p85 de type sauvage &eacute;taient plus lent PDGFR trafic conforme &agrave; l&#39;activit&eacute; accrue de GAP d&eacute;sactivation Rab5 et Rab4 pour bloquer leurs fonctions trafic v&eacute;siculaire. Mutant p85R274A expression augmente le taux de l&#39;internalisation de PDGFRs, un processus d&eacute;pendant du Rab5, sans pour autant emp&ecirc;cher l&#39;ubiquitination PDGFR. &Eacute;tudes d&#39;immunofluorescence encore d&eacute;montr&eacute; que les cellules exprimant p85R274A Rab5 accumulation intracellulaire endroits. D&eacute;roulant et FRAP (r&eacute;cup&eacute;ration de fluorescence apr&egrave;s photoblanchiment) exp&eacute;riences indiquent que cela est probablement associ&eacute;e &agrave; la membrane Rab5-GTP, subie en raison de l&#39;activit&eacute; GAP p85 une diminution pour le mutant p85R274A. Ces cellules a &eacute;galement eu des quantit&eacute;s substantielles de PDGFRs activ&eacute;s dans les endosomes de recyclage Rab4 positifs, un compartiment qui contient habituellement essentiellement d&eacute;sactiv&eacute;/d&eacute;phosphoryl&eacute; r&eacute;cepteurs. Nos r&eacute;sultats sugg&egrave;rent que l&#39;activit&eacute; GAP PDGFR-associ&eacute;s de p85 r&eacute;gule des fonctions fois Rab5 et Rab4 dans les cellules d&#39;influer sur la circulation des PDGFR activ&eacute; par l&#39;interm&eacute;diaire de compartiments endosomale. Perturbation du pr&eacute;sent r&egrave;glement par l&#39;expression p85R274A effets PDGFR phosphorylation/d&eacute;phosphorylation, cin&eacute;tique de d&eacute;gradation et de signalisation en aval en alt&eacute;rant les r&eacute;cepteurs du temps passent dans des compartiments sp&eacute;cifiques endosomale intracellulaire. Ces r&eacute;sultats d&eacute;montrent que la prot&eacute;ine p85alpha est un r&eacute;gulateur important du PDGFR Rab m&eacute;di&eacute;e par le trafic, qui a des r&eacute;percussions beaucoup de signalisation du r&eacute;cepteur et de la d&eacute;gradation.

D&eacute;r&eacute;glementation des prot&eacute;ines Rab5 et Rab4 dans les cellules exprimant p85R274A modifie PDGFR traite.

Aktivierte Rezeptor-Tyrosin-Kinasen rekrutieren viele signalisierende Proteine um nachgeschaltete Zelle Proliferation und &Uuml;berleben-Wege, einschlie&szlig;lich Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K) bestehend aus einem p85 regelndes Protein und einer katalytischen p110-Protein zu aktivieren. Wir haben k&uuml;rzlich gezeigt, dass das p85alpha-Protein hat auch in-vitro-GTPase aktivierendes Protein (GAP)-Aktivit&auml;t in Richtung Rab5 und Rab4, kleinen GTPasen, die Vesikel Menschenhandel Ereignisse f&uuml;r aktivierte Rezeptoren regulieren. Ausdruck der GAP-Genen Mutanten, p85R274A, f&uuml;hrte zu anhaltend Belastung des Platelet-derived Growth Factor-Rezeptoren (PDGFRs) aktiviert und verbessert nachgelagerte signalisieren. In diesem Bericht haben wir Rab5 - und Rab4-vermittelter PDGFR Menschenhandel Zellen Wildtyp p85 und GAP-Genen mutant p85R274A Ausdr&uuml;cken gekennzeichnet. Wildtyp p85 overexpressing Zellen hatten langsamer PDGFR Menschenhandel mit gesteigerte Aktivit&auml;t und GAP Deaktivieren von Rab5 und Rab4 um ihre Vesikel-Menschenhandel-Funktionen zu blockieren. Mutant p85R274A Ausdruck erh&ouml;ht die Internalisierung Rate der PDGFRs, ein Rab5-abh&auml;ngigen Prozess, ohne PDGFR Ubiquitination zu verhindern. Immunofluoreszenz Studien zeigten weiter, dass p85R274A-Ausdruck Zellen Rab5 Anh&auml;ufung an intrazellul&auml;re Standorten zeigte. Pulldown- und FRAP (Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photobleaching) Experimente zeigen, dass dies wahrscheinlich Membran-assoziierte Rab5-GTP, den p85R274A-Mutanten aufgrund verringerter p85 L&uuml;cke Aktivit&auml;t gleichbleibend ist. Diese Zellen hatte auch erhebliche Mengen an aktivierten PDGFRs in Rab4-Positive recycling Endosomen, ein Fach, das in erster Linie enth&auml;lt in der Regel deaktiviert/dephosphorylated Rezeptoren. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die L&uuml;cke PDGFR-assoziierte Aktivit&auml;t des p85 Rab5 und Rab4 Funktionen in Zellen regelt, die Bewegung der aktivierten PDGFR durch Endosomen F&auml;cher zu beeinflussen. Unterbrechung dieser Verordnung durch p85R274A Ausdruck wirkt PDGFR Phosphorylierung/Dephosphorylierung, Abbau Kinetik und nachgeschaltete Signalisierung durch die Ver&auml;nderung der Rezeptoren Zeit verbringen Sie in bestimmte intrazellul&auml;re Endosomen F&auml;cher. Diese Ergebnisse zeigen, dass das p85alpha-Protein ein wichtiger Regulator des Rab-vermittelte PDGFR Menschenhandel ist, Rezeptor Signalgebung und Abbau erheblich auswirkt.

Deregulierung von Rab5 und Rab4 Proteine in den Zellen p85R274A-Ausdruck &auml;ndert PDGFR Menschenhandel.

Attivazione del recettore tirosina chinasi reclutano molte proteine di segnalazione per attivare percorsi proliferazione e sopravvivenza delle cellule a valle, tra cui fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) costituito da una proteina normativo p85 e una proteina catalitica p110. Recentemente abbiamo dimostrato che la proteina p85alpha ha anche in vitro GTPase attivando attivit&agrave; di proteina (GAP) verso Rab5 e Rab4, piccolo GTPases che regolano gli eventi traffico vescicola per recettori attivati. Espressione di un mutante di GAP-difettoso, p85R274A, portato a livelli sostenuti di attivata i recettori del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRs) e migliorato di segnalazione a valle. In questa relazione noi abbiamo caratterizzato Rab5 e Rab4-mediata PDGFR traffico in cellule che esprimono p85 wild type e mutanti p85R274A GAP-difettoso. Wild type p85 cellule all erano pi&ugrave; lento PDGFR traffico coerente con una maggiore attivit&agrave; GAP disattivando Rab5 e Rab4 per bloccare le loro funzioni traffico vescicola. Espressione del mutante p85R274A aumentato il tasso di interiorizzazione di PDGFRs, un processo Rab5-dipendente, senza impedire ubiquitination PDGFR. Immunofluorescenza studi ulteriori hanno dimostrato che le cellule che esprimono p85R274A ha mostrato Rab5 accumulo in localit&agrave; intracellulare. Pull-down e FRAP (recupero della fluorescenza dopo photobleaching) esperimenti indicano che questo &egrave; probabilmente associata a membrana Rab5-GTP, sostenuta a causa di attivit&agrave; GAP p85 &egrave; diminuito per il mutante p85R274A. Queste cellule avevano anche notevoli quantit&agrave; di PDGFRs attivata nel riciclaggio endosomes Rab4-positivi, un vano che solitamente contiene principalmente disattivato/defosforilata recettori. I nostri risultati suggeriscono che l&#39;attivit&agrave; di PDGFR-associated GAP di p85 regola le funzioni sia Rab5 e Rab4 nelle celle per influenzare il movimento di PDGFR attivato attraverso compartimenti endosomal. Interruzione del presente regolamento dall&#39;espressione p85R274A impatti PDGFR fosforilazione/defosforilazione, cinetica di degradazione e di segnalazione a valle, alterando i recettori tempo spendere in compartimenti specifico intracellulare endosomal. Questi risultati dimostrano che la proteina p85alpha &egrave; un regolatore importante del Rab-mediata PDGFR traffico, che impatta significativamente receptor signaling e degrado.

Deregolamentazione delle proteine Rab5 e Rab4 in cellule che esprimono p85R274A altera PDGFR traffico.

&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC; &#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB; 3-&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC; &#xFF08;PI3K&#xFF09;&#x300C;p85 &#x8ABF;&#x7BC0;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3068; p110 &#x89E6;&#x5A92;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x304B;&#x3089;&#x6210;&#x308B;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x4E0B;&#x6D41;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x5897;&#x6B96;&#x3068;&#x751F;&#x5B58;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x52DF;&#x96C6;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x6700;&#x8FD1; p85alpha &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3082; in vitro GTPase &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA; (GAP) &#x6D3B;&#x52D5;&#x306B;&#x5411;&#x3051;&#x3066; Rab5 &#x3068; Rab4&#x3001;&#x5C0F;&#x80DE;&#x4EBA;&#x8EAB;&#x58F2;&#x8CB7;&#x30A4;&#x30D9;&#x30F3;&#x30C8;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3092;&#x898F;&#x5236;&#x3059;&#x308B; Gtpase &#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5F0F;&#x306E;&#x6301;&#x7D9A;&#x7684;&#x306A;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3067;&#x8D77;&#x56E0;&#x3057;&#x305F;&#x30AE;&#x30E3;&#x30C3;&#x30D7;&#x6B20;&#x640D;&#x5909;&#x7570;&#x306F;&#x3001;p85R274A&#x3001;&#x8840;&#x5C0F;&#x677F;&#x7531;&#x6765;&#x6210;&#x9577;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53; (PDGFRs) &#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x3057;&#x3001;&#x4E0B;&#x6D41;&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x5F37;&#x5316;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x672C;&#x5831;&#x544A;&#x3067;&#x306F;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; p85 &#x3068;&#x30AE;&#x30E3;&#x30C3;&#x30D7;&#x6B20;&#x640D;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x4F53; p85R274A &#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x4EBA;&#x8EAB;&#x58F2;&#x8CB7; Rab5 &#x3068; Rab4 &#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F; &#x2171; &#x76F8;&#x8A66;&#x9A13;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; p85 mn-sod &#x3092;&#x9AD8;&#x767A;&#x73FE;&#x7D30;&#x80DE; Rab5 &#x3068; Rab4 &#x305D;&#x306E;&#x5C0F;&#x80DE;&#x306E;&#x4EBA;&#x8EAB;&#x58F2;&#x8CB7;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x3059;&#x308B;&#x7121;&#x52B9;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x62E1;&#x5F35;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30AE;&#x30E3;&#x30C3;&#x30D7; &#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D3;&#x30C6;&#x30A3;&#x3092;&#x4E00;&#x8CAB;&#x6027;&#x306E;&#x3042;&#x308B;&#x4EBA;&#x8EAB;&#x58F2;&#x8CB7;&#x9045;&#x3044; &#x2171; &#x76F8;&#x8A66;&#x9A13;&#x304C;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x5909;&#x7570; p85R274A &#x5F0F; PDGFRs&#x3001;Rab5 &#x4F9D;&#x5B58;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306E;&#x5185;&#x9762;&#x5316;&#x7387; &#x2171; &#x76F8;&#x8A66;&#x9A13;&#x306E;&#x30E6;&#x30D3;&#x30AD;&#x30C1;&#x30F3;&#x5316;&#x3092;&#x59A8;&#x3052;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306A;&#x304F;&#x304C;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x86CD;&#x5149;&#x6297;&#x4F53;&#x6CD5;&#x306F;&#x3055;&#x3089;&#x306B; p85R274A &#x3092;&#x767A;&#x73FE;&#x3059;&#x308B;&#x7D30;&#x80DE; Rab5 &#x84C4;&#x7A4D;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x306E;&#x5834;&#x6240;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30D7;&#x30EB;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3;&#x304A;&#x3088;&#x3073; FRAP &#xFF08;&#x9000;&#x8272;&#x5F8C;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x56DE;&#x5FA9;&#xFF09; &#x5B9F;&#x9A13;&#x3053;&#x308C;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x819C;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x305F; Rab5 - &#x6E1B;&#x5C11; p85 &#x30AE;&#x30E3;&#x30C3;&#x30D7;&#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6301;&#x7D9A;&#x7684;&#x306A; p85R274A &#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306F; GTP&#x3001;&#x3042;&#x308B;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x306F;&#x3001;&#x307E;&#x305F; Rab4 &#x967D;&#x6027;&#x30EA;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB; &#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x3067;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316; PDGFRs &#x306E;&#x5B9F;&#x8CEA;&#x7684;&#x306A;&#x91D1;&#x984D;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x305F;, &#x8131;&#x71D0;&#x9178;&#x901A;&#x5E38;&#x4E3B;&#x306B;&#x542B;&#x3080;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x304C;&#x975E;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306B;/&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x5316;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;P85 &#x306E;&#x30AE;&#x30E3;&#x30C3;&#x30D7; &#x2171; &#x76F8;&#x8A66;&#x9A13;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x6D3B;&#x52D5;&#x304C;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0; &#x30B3;&#x30F3;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316; &#x2171; &#x76F8;&#x8A66;&#x9A13;&#x306E;&#x52D5;&#x304D;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53CA;&#x307C;&#x3059;&#x7D30;&#x80DE; Rab5 &#x3068; Rab4 &#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x5506;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E; p85R274A &#x5F0F;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x898F;&#x5236;&#x306E;&#x4E2D;&#x65AD; &#x2171; &#x76F8;&#x8A66;&#x9A13;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x3068;&#x8131;&#x71D0;&#x9178;&#x5316;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x3001;&#x52A3;&#x5316;&#x52D5;&#x614B;&#x3068;&#x6642;&#x9593;&#x306E;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3092;&#x5909;&#x3048;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x4E0B;&#x6D41;&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x7279;&#x5B9A;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x4ED5;&#x5207;&#x308A;&#x306E;&#x4E2D;&#x3092;&#x904E;&#x3054;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;P85alpha &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F; &#x2171; &#x76F8;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3068;&#x52A3;&#x5316;&#x3092;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x4EBA;&#x8EAB;&#x58F2;&#x8CB7;&#x3001;Rab &#x5A92;&#x4ECB;&#x8A66;&#x9A13;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x56E0;&#x5B50;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x5506;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

Rab5 &#x3068; Rab4 &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA; p85R274A &#x3092;&#x767A;&#x73FE;&#x3059;&#x308B;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x898F;&#x5236;&#x7DE9;&#x548C;&#x306F;&#x3001;&#x2171; &#x76F8;&#x8A66;&#x9A13;&#x3092;&#x4EBA;&#x8EAB;&#x58F2;&#x8CB7;&#x3092;&#x5909;&#x66F4;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB41C; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; tyrosine kinases &#xB9CE;&#xC740; &#xC2E0;&#xD638; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB2E4;&#xC6B4;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB9BC; &#xC138;&#xD3EC; &#xC99D;&#xC2DD;&#xACFC; &#xC0DD;&#xC874; &#xACBD;&#xB85C;, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xADDC;&#xC81C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xACFC; p110 &#xCD09;&#xB9E4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xAD6C;&#xC131; &#xB4F1;&#xC744; &#xBAA8;&#xC9D1; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xCD5C;&#xADFC;&#xC5D0; p85alpha &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0;&#xB294; &#xB610;&#xD55C; Rab5 &#xBC0F; Rab4, &#xC791;&#xC740; GTPases &#xAE30; &#xBC00;&#xB9E4; &#xC774;&#xBCA4;&#xD2B8; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xB97C; &#xC870;&#xC808; &#xD558;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (GAP) &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xD558;&#xB294; &#xCCB4; &#xC678; GTPase &#xC788;&#xB2E4; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0AC;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAC2D; &#xACB0;&#xD568; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;, p85R274A, &#xC9C0;&#xC18D;&#xC801;&#xC778;&#xB41C; &#xC218;&#xC900;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xC2DD; &#xD608;&#xC18C;&#xD310; &#xC720;&#xB798; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; (PDGFRs)&#xB97C; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xD558; &#xACE0; &#xB2E4;&#xC6B4;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB9BC; &#xC2E0;&#xD638; &#xD5A5;&#xC0C1;. &#xC774; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC; Rab5 Rab4 &#xC911;&#xC7AC; PDGFR &#xC140; &#xAC2D; &#xACB0;&#xD568; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; p85R274A &#xC640;&#xC77C;&#xB4DC; &#xD615;&#xC2DD; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xD45C;&#xD604;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB9E4;&#xB9E4;&#xAC00; &#xD2B9;&#xC9D5;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC640;&#xC77C;&#xB4DC; &#xD615;&#xC2DD; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 overexpressing &#xC140; &#xB290;&#xB9B0; PDGFR &#xBC00;&#xB9E4; Rab5 &#xBC0F; Rab4 &#xCC28;&#xB2E8; &#xAE30; &#xC778;&#xC2E0; &#xB9E4;&#xB9E4; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xBE44;&#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xAC2D; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC73C;&#xB85C; &#xC77C;&#xAD00; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; p85R274A &#xC2DD; &#xBC29;&#xC9C0; PDGFR ubiquitination &#xC5C6;&#xC774; PDGFRs, Rab5 &#xC885;&#xC18D; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xC758; &#xAD6D;&#xC81C;&#xD654; &#xC18D;&#xB3C4;&#xB97C; &#xC99D;&#xAC00; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBA74;&#xC5ED; &#xD615;&#xAD11; &#xAC80;&#xC0AC; &#xD559;&#xBB38;&#xC740; &#xB354; &#xC140; p85R274A &#xD45C;&#xD604; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; &#xC704;&#xCE58;&#xC5D0;&#xC11C; Rab5 &#xCD95;&#xC801; &#xD588;&#xB2E4; &#xC124;&#xBA85; &#xD588;&#xB2E4;. &#xD480; &#xB2E4;&#xC6B4; &#xBC0F; FRAP (photobleaching &#xD6C4; &#xD615;&#xAD11; &#xBCF5;&#xAD6C;) &#xC2E4;&#xD5D8; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC774; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xAD00;&#xB828; Rab5-GTP, p85R274A &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xB300; &#xD55C; &#xC9C0;&#xC18D;&#xC801;&#xC778; &#xAC10;&#xC18C; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 &#xAC2D; &#xD65C;&#xB3D9; &#xB54C;&#xBB38;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC140; Rab4 &#xC591;&#xC131; &#xC7AC;&#xD65C;&#xC6A9; endosomes &#xD588;&#xB2E4; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB41C; Pdgfrs&#xC758; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xC591;&#xC758; &#xBCF4;&#xD1B5; &#xC8FC;&#xB85C; &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xAD6C;&#xD68D; &#xBE44;&#xD65C;&#xC131;&#xD654;/dephosphorylated &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC774; p85 PDGFR &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xAC2D; &#xD65C;&#xB3D9; endosomal &#xAD6C;&#xD68D;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB41C; PDGFR&#xC758; &#xC6C0;&#xC9C1;&#xC784;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; Rab5 &#xBC0F; Rab4 &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xC870;&#xC808; &#xD558;&#xC2DC;&#xAE30; &#xBC14;&#xB78D;&#xB2C8;&#xB2E4;. P85R274A &#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C;&#xC774; &#xADDC;&#xC815;&#xC758; &#xC7A5;&#xC560; &#xC601;&#xD5A5; PDGFR &#xC778; &#xC0B0;&#xD654;/dephosphorylation, &#xC800;&#xD558; &#xC18D;&#xB3C4; &#xB860; &#xBC0F; &#xB2E4;&#xC6B4;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB9BC; &#xC2E0;&#xD638; &#xC2DC;&#xAC04; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xB97C; &#xBCC0;&#xACBD; &#xD558; &#xC5EC; &#xD2B9;&#xC815; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; endosomal &#xAD6C;&#xD68D;&#xC5D0; &#xC9C0;&#xCD9C;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; p85alpha &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC774; &#xB7A9; &#xC911;&#xC7AC; PDGFR &#xC778;&#xC2E0; &#xB9E4;&#xB9E4;, &#xD06C;&#xAC8C; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xC2E0;&#xD638; &#xBC0F; &#xC800;&#xD558; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744;&#xC758; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xB808; &#xADE4; &#xB808;&#xC774; &#xD130;&#xB294; &#xC785;&#xC99D;.

P85R274A &#xD45C;&#xD604; &#xC140;&#xC5D0; rab5&#xC640; Rab4 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xADDC;&#xC81C; &#xC644;&#xD654; PDGFR &#xC778;&#xC2E0; &#xB9E4;&#xB9E4;&#xB97C; &#xBCC0;&#xACBD;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Receptor activado tirosina quinasas reclutan muchas prote&iacute;nas de se&ntilde;alizaci&oacute;n para activar v&iacute;as de proliferaci&oacute;n y supervivencia celular aguas abajo, incluyendo fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) que consiste en una prote&iacute;na reguladora p85 y una prote&iacute;na catal&iacute;tica p110. Recientemente hemos demostrado que la prote&iacute;na p85alpha tambi&eacute;n tiene in vitro GTPasa activando la actividad de la prote&iacute;na (GAP) hacia Rab5 y Rab4, GTPasas peque&ntilde;as que regulan eventos trata de ves&iacute;cula para receptores activados. Expresi&oacute;n de un mutante de GAP-defectuoso, p85R274A, dio lugar a niveles sostenidos de activa receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRs) y mayor se&ntilde;alizaci&oacute;n aguas abajo. En este informe hemos caracterizado PDGFR Rab5 y Rab4-mediada que trata de las c&eacute;lulas que expresan p85 de tipo salvaje y mutante p85R274A de GAP-defectuoso. Tipo salvaje p85 sobreexpresando c&eacute;lulas ten&iacute;an m&aacute;s lento PDGFR tr&aacute;fico consistente con actividad realzada de la brecha desactivando Rab5 y Rab4 para bloquear sus funciones trata de ves&iacute;cula. P85R274A mutante expresi&oacute;n increment&oacute; la tasa de internalizaci&oacute;n de PDGFRs, un proceso de Rab5-dependiente, sin impedir la ubiquitinaci&oacute;n PDGFR. Estudios de inmunofluorescencia demostraron adem&aacute;s que las c&eacute;lulas p85R274A-expresando demostraron la acumulaci&oacute;n de Rab5 en localizaciones intracelulares. Desplegable y FRAP (recuperaci&oacute;n de fluorescencia tras fotoblanqueo) experimentos indican que es probable que asociada a membrana Rab5-GTP, sostenido debido a la actividad de p85 disminuida brecha para el mutante p85R274A. Estas c&eacute;lulas tambi&eacute;n ten&iacute;an cantidades sustanciales de PDGFRs activados en endosomas reciclaje Rab4-positivo, un compartimiento que generalmente contiene principalmente desactivado/defosforilaciones receptores. Nuestros resultados sugieren que la actividad GAP PDGFR-asociado de p85 regula funciones Rab5 tanto Rab4 en c&eacute;lulas para influir en el movimiento de PDGFR activado a trav&eacute;s de los compartimientos endosomal. Interrupci&oacute;n del presente Reglamento por la expresi&oacute;n de p85R274A impactos PDGFR fosforilaci&oacute;n/desfosforilaci&oacute;n, cin&eacute;tica de degradaci&oacute;n y se&ntilde;alizaci&oacute;n aguas abajo mediante la alteraci&oacute;n de los receptores de tiempo pasan en compartimentos espec&iacute;ficos endosomal intracelular. Estos resultados demuestran que la prote&iacute;na de p85alpha es un importante regulador de PDGFR Rab mediada por trata de personas, que afecta significativamente la se&ntilde;alizaci&oacute;n del receptor y la degradaci&oacute;n.

Desregulaci&oacute;n de Rab5 y Rab4 prote&iacute;nas en c&eacute;lulas de p85R274A-expresi&oacute;n altera PDGFR tr&aacute;fico.

&#x9002;&#x4E8E;&#x704C;&#x6CE8;&#x4F53;&#x5916;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x6784;&#x9020;&#x662F;&#x7531;&#x968F;&#x673A;&#x8FDB;&#x5165;&#x5FAE;&#x6D41;&#x63A7;&#x5BA4;&#x5305;&#x88C5;&#x6D82;&#x5C42;&#x7684;&#x95F4;&#x5145;&#x8D28;&#x57FA;&#x8D28;&#x7EC6;&#x80DE; (MSC)-&#x5D4C;&#x5165;&#x5F0F;&#x3001; &#x8840;&#x7BA1;&#x5185;&#x76AE;&#x7EC6;&#x80DE; (EC)-&#x80F6;&#x539F;&#x74F6; &#xFF08;&#x6A21;&#x5757;&#xFF09; &#x7EC4;&#x6210;&#x7684;&#x3002;&#x521B;&#x5EFA;&#x968F;&#x673A;&#x5305;&#x88C5;&#x7684;&#x4E9A;&#x6BEB;&#x7C73;&#x6CE2;&#x5927;&#x5C0F;&#x7684;&#x6A21;&#x5757;&#x521B;&#x5EFA;&#x5185;&#x886C;&#x7535;&#x5B50;&#x5546;&#x52A1;&#x6E20;&#x9053;&#x7684;&#x7A7A;&#x9699;&#x3002;&#x6D41;&#x9020;&#x6210;&#x5927;&#x4E8E;&#x9884;&#x671F;&#x7684;&#x6536;&#x7F29;&#x91CF;&#x548C;&#x91CD;&#x6784;&#x4E2D;&#x7684;&#x6A21;&#x5757;&#x5316;&#x6784;&#x9020;&#x3002;&#x6D41;&#x5F71;&#x54CD;&#x6D77;&#x5B89;&#x4F1A;&#x5236;&#x5B9A;&#x5E73;&#x6ED1;&#x808C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6807;&#x5FD7;&#x7269; (&#x5E73;&#x6ED1;&#x808C;&#x808C;&#x52A8;&#x86CB;&#x767D;&#x6297;&#x4F53;&#x9633;&#x6027;&#x3001; &#x7ED3;&#x86CB;&#x767D;&#x9633;&#x6027;&#x548C;&#x8840;&#x53CB;&#x75C5;&#x56E0;&#x5B50;&#x8D1F;) &#x548C;&#x8FC1;&#x79FB;&#x8868;&#x9762;&#x7684;&#x6A21;&#x5757;&#x3002;&#x5F53;&#x6A21;&#x5757;&#x88AB;&#x5305;&#x8986; EC &#x65F6;&#xFF0C;MSC &#x5206;&#x5316;&#x548C;&#x8FC1;&#x79FB;&#x7684;&#x7A0B;&#x5EA6;&#x589E;&#x52A0;&#xFF0C;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x6D77;&#x5B89;&#x4F1A;&#x8D8A;&#x6765;&#x8D8A;&#x5E73;&#x6ED1;&#x808C;&#x7EC6;&#x80DE;-&#x6216;&#x5468;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6837;&#x5728;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x7684;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x548C;&#x8868;&#x578B;&#x3002;&#x6D77;&#x5B89;&#x4F1A;&#x4EA6;&#x6FC0;&#x589E;&#xFF0C;&#x7531;&#x6B64;&#x4EA7;&#x751F;&#x7684;&#x533A;&#x522B;&#x7855;&#x58EB;&#x4EBA;&#x6570;&#x5927;&#x5E45;&#x589E;&#x52A0;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5F71;&#x54CD;&#x90FD;&#x4E3A;&#x9759;&#x6001;&#x63A7;&#x4EF6;&#x6CA1;&#x6709;&#x9047;&#x5230;&#x6D41;&#x660E;&#x663E;&#x8F83;&#x5C11;&#x3002;&#x6D77;&#x5B89;&#x4F1A;&#x8FC1;&#x79FB;&#xFF0C;&#x5B83;&#x4EEC;&#x521B;&#x5EFA;&#x65B0;&#x7684;&#x77E9;&#x9635;&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x5305;&#x62EC;&#x86CB;&#x767D;&#x591A;&#x7CD6;&#x7684;&#x6C89;&#x79EF;&#x3002;&#x96C6;&#x4F53;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x6D77;&#x5B89;&#x4F1A;&#x5D4C;&#x5165;&#x6A21;&#x5757;&#x53EF;&#x80FD;&#x6709;&#x7528;&#x7684;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x5316;&#x6784;&#x9020;&#x4E2D;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x6027;&#x8840;&#x7BA1;&#x5F62;&#x6210;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6D41;&#x91CF;&#x6761;&#x4EF6;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x5316;&#x6784;&#x9020;&#x53EF;&#x80FD;&#x4F1A;&#x611F;&#x5174;&#x8DA3;&#x7684;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x836F;&#x7269;&#x68C0;&#x6D4B;&#x548C;&#x751F;&#x7269;&#x68C0;&#x6D4B;&#x4E09;&#x7EF4;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x62C9;&#x4E39;&#x7684;&#x5E73;&#x53F0;&#x3002;

&#x5728;&#x4F53;&#x5916;&#x8840;&#x7BA1;&#x8D70;&#x5411;&#xFF1A; &#x5206;&#x5316;&#x7684;&#x95F4;&#x5145;&#x8D28;&#x5E72;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5728;&#x8840;&#x7BA1;&#x5185;&#x76AE;&#x7EC6;&#x80DE;&#x690D;&#x5165;&#x6A21;&#x5757;&#x4E2D;&#x7684;&#x6784;&#x9020;&#x5FAE;&#x6D41;&#x63A7;&#x6D41;&#x52A8;&#x8154;&#x5185;&#x3002;

An in vitro tissue construct amenable to perfusion was formed by randomly packing mesenchymal stromal cell (MSC)-embedded, endothelial cell (EC)-coated collagen cylinders (modules) into a microfluidic chamber. The interstices created by the random packing of the submillimeter-sized modules created EC-lined channels. Flow caused a greater than expected amount of contraction and remodeling in the modular constructs. Flow influenced the MSC to develop smooth muscle cell markers (smooth muscle actin-positive, desmin-positive, and von Willebrand factor-negative) and migrate toward the surface of the modules. When modules were coated with EC, the extent of MSC differentiation and migration increased, suggesting that the MSC were becoming smooth muscle cell- or pericyte-like in their location and phenotype. The MSC also proliferated, resulting in a substantial increase in the number of differentiated MSC. These effects were markedly less for static controls not experiencing flow. As the MSC migrated, they created new matrix that included the deposition of proteoglycans. Collectively, these results suggest that MSC-embedded modules may be useful for the formation of functional vasculature in tissue engineered constructs. Moreover, these flow-conditioned tissue engineered constructs may be of interest as three-dimensional cell-laden platforms for drug testing and biological assays.

Toward an In Vitro Vasculature: Differentiation of Mesenchymal Stromal Cells Within an Endothelial Cell-Seeded Modular Construct in a Microfluidic Flow Chamber.

Un dans le tissu in vitro construire pr&#xEA;tent &#xE0; la perfusion a &#xE9;t&#xE9; form&#xE9; par hasard d&#x26;#39;emballage de cellules stromales m&#xE9;senchymateuses (CSM)-incorpor&#xE9;, de cellules endoth&#xE9;liales (CE) rev&#xEA;tues de cylindres de collag&#xE8;ne (modules) dans une chambre de microfluidique. Les interstices cr&#xE9;&#xE9;s par l&#x26;#39;emballage al&#xE9;atoire des modules de taille submillim&#xE9;trique cr&#xE9;&#xE9;s CE fourr&#xE9;es en canaux. D&#xE9;bit caus&#xE9; un montant plus important que pr&#xE9;vu de la contraction et le remodelage dans les constructions modulaires. D&#xE9;bit influenc&#xE9; le MSC pour d&#xE9;velopper des marqueurs des cellules musculaires lisses (actine muscle lisse positive, la desmine positif, et le facteur von Willebrand-n&#xE9;gatif) et migrent vers la surface des modules. Lorsque les modules ont &#xE9;t&#xE9; recouvertes avec la CE, le degr&#xE9; de diff&#xE9;renciation et de migration MSC a augment&#xE9;, ce qui sugg&#xE8;re que le MSC devenaient des cellules ou des muscles lisses des p&#xE9;ricytes-comme &#xE0; leur emplacement et le ph&#xE9;notype. Le MSC a &#xE9;galement prolif&#xE9;r&#xE9;, entra&#xEE;nant une augmentation substantielle du nombre de MSC diff&#xE9;renci&#xE9;e. Ces effets ont &#xE9;t&#xE9; nettement moins pour les contr&#xF4;les statiques ne connaissent d&#xE9;bit. Comme le MSC migr&#xE9;, ils ont cr&#xE9;&#xE9; une nouvelle matrice qui comprenait le d&#xE9;p&#xF4;t des prot&#xE9;oglycanes. Collectivement, ces r&#xE9;sultats sugg&#xE8;rent que le CSM-embarqu&#xE9;s modules peuvent &#xEA;tre utiles pour la formation du syst&#xE8;me vasculaire fonctionnel dans les constructions de l&#x26;#39;ing&#xE9;nierie tissulaire. En outre, ces constructions de tissu d&#xE9;bit conditionn&#xE9; g&#xE9;n&#xE9;tiquement modifi&#xE9;es peuvent &#xEA;tre d&#x26;#39;int&#xE9;r&#xEA;t en trois dimensions des cellules charg&#xE9;es de plates-formes pour le d&#xE9;pistage des drogues et des dosages biologiques.

Vers un syst&#xE8;me vasculaire in vitro: la diff&#xE9;renciation des cellules stromales m&#xE9;senchymateuses Au sein d&#x26;#39;une des cellules endoth&#xE9;liales ensemenc&#xE9;es modulaire Construct dans une chambre d&#x26;#39;&#xE9;coulement microfluidique

Ein in-vitro-Gewebe-Konstrukt zur Perfusion Sensationsberichterstattung entstand durch zuf&auml;llig Verpackung mesenchymal stromal Zelle (MSC) - embedded, endothelial Zelle (EG) - beschichtete Kollagen Zylinder (Module) in einer mikrofluidische-Kammer. Die Zwischenr&auml;ume, erstellt von der zuf&auml;lligen Verpackung der Module Submillimeter-Gr&ouml;&szlig;e erstellt EG ges&auml;umten Kan&auml;le. Str&ouml;mung verursacht ein gr&ouml;&szlig;er als Betrag der Kontraktion erwartet und Umbau in die modulare Konstrukte. Str&ouml;mung beeinflusst die MSC zu entwickeln Glattmuskel Zelle Marker (Glattmuskel Aktin-Positive, Desmin-positiv und von-Willebrand-Faktor-negativ) und gegen die Oberfl&auml;che der Module zu migrieren. Wenn Module mit EG gestrichen wurden, erh&ouml;ht der Umfang des MSC Differenzierung und Migration, die darauf hindeutet, dass die MSC Glattmuskel Zelle oder Pericyt-wie in ihrer Lage und Ph&auml;notyp immer wurden. Die MSC vermehren auch, was zu einer erheblichen Zunahme des differenzierten MSC. Diese Effekte wurden deutlich weniger f&uuml;r statischen Steuerelemente, die derzeit keine Str&ouml;mung. Da die MSC migriert, schufen sie neue Matrix, die die Ablagerung von Proteoglykane enthalten. Diesen Ergebnissen zufolge gemeinsam MSC eingebettete Module m&ouml;glicherweise n&uuml;tzlich f&uuml;r die Bildung von funktionalen Gef&auml;&szlig;system in aus Gewebez&uuml;chtungen Konstrukte. Dar&uuml;ber hinaus k&ouml;nnen diese Str&ouml;mung konditionierten aus Gewebez&uuml;chtungen Konstrukte als dreidimensionale Zelle beladene Plattformen f&uuml;r Medikament testen und biologische Assays von Interesse sein.

In Richtung einer In-Vitro-Gef&auml;&szlig;system: Differenzierung der Mesenchymal Stromal Zellen in einem Endothelial Zelle-bes&auml;te modulare Konstrukt als Microfluidic Flow-Kammer.

Un costrutto in vitro tessuti suscettibile di perfusione era formato da cellule stromali mesenchimali (MSC) - embedded, endothelial cell (CE) - rivestita collagene cilindri (moduli) di imballaggio casualmente in una camera microfluidica. Gli interstizi creati da imballaggio casuale dei moduli dimensioni submillimeter creato canali CE-allineato. Ha causato un maggiore previsto importo di contrazione e rimodellamento nei costrutti di modulari il flusso. Flusso influenzato il MSC a sviluppare muscolo liscio cellule marker (actina muscolo liscio positivi, desmina-positivo e von Willebrand fattore negativo) e la migrazione verso la superficie dei moduli. Quando i moduli sono stati rivestiti con CE, aumentato nella misura di MSC differenziazione e migrazione, suggerendo che il MSC sono state diventando smooth muscle cell - o Pericita-come nella loro posizione e fenotipo. Il MSC anche moltiplicate, risultante in un sostanziale aumento del numero di MSC differenziati. Questi effetti erano nettamente meno per controlli statici non vivendo il flusso. Come il MSC migrati, hanno creato la nuova matrice che comprendeva la deposizione di proteoglicani. Collettivamente, questi risultati suggeriscono che MSC incorporati moduli possono essere utili per la formazione della vascolarizzazione funzionale nei costrutti tessutale. Inoltre, questi costrutti condizionata flusso tessutale possono essere di interesse come piattaforme carichi di cella tridimensionale per analisi biologiche e test droga.

Verso una vascolarizzazione In Vitro: differenziazione delle cellule mesenchimali stromale all&#39;interno di un costrutto modulare seminato delle cellule endotelio in una camera microfluidica flusso.

in vitro&#x3067;&#x306E;&#x7D44;&#x7E54;&#x5185;&#x306E;&#x8840;&#x6D41;&#x306E;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53D7;&#x3051;&#x3084;&#x3059;&#x3044;&#x306E;&#x69CB;&#x7BC9;&#x306F;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C0;&#x30E0;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30C1;&#x30E3;&#x30F3;&#x30D0;&#x30FC;&#x5185;&#x306B;&#x9593;&#x8449;&#x7CFB;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;&#xFF08;MSC&#xFF09;&#x306B;&#x57CB;&#x3081;&#x8FBC;&#x307E;&#x308C;&#x3001;&#x5185;&#x76AE;&#x7D30;&#x80DE;&#xFF08;EC&#xFF09;&#x3067;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30B3;&#x30E9;&#x30FC;&#x30B2;&#x30F3;&#x30B7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30C0;&#x30FC;&#xFF08;&#x30E2;&#x30B8;&#x30E5;&#x30FC;&#x30EB;&#xFF09;&#x3092;&#x5145;&#x586B;&#x3057;&#x3066;&#x5F62;&#x6210;&#x3057;&#x305F;&#x3002; EC-&#x4E26;&#x6728;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x3092;&#x4F5C;&#x6210;&#x3057;&#x305F;&#x30B5;&#x30D6;&#x30DF;&#x30EA;&#x6CE2;&#x5927;&#x578B;&#x30E2;&#x30B8;&#x30E5;&#x30FC;&#x30EB;&#x306E;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C0;&#x30E0;&#x5145;&#x586B;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x4F5C;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x9699;&#x9593;&#x3002;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x30E2;&#x30B8;&#x30E5;&#x30E9;&#x30FC;&#x69CB;&#x9020;&#x7269;&#x306E;&#x53CE;&#x7E2E;&#x3084;&#x30EA;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x4E88;&#x60F3;&#x3092;&#x9065;&#x304B;&#x306B;&#x4E0A;&#x56DE;&#x308B;&#x91CF;&#x3092;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x5E73;&#x6ED1;&#x7B4B;&#x7D30;&#x80DE;&#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#xFF08;&#x30C7;&#x30B9;&#x30DF;&#x30F3;&#x967D;&#x6027;&#x3001;&#x5E73;&#x6ED1;&#x7B4B;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x967D;&#x6027;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30D5;&#x30A9;&#x30F3;&#x30D3;&#x30EB;&#x30D6;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C8;&#x56E0;&#x5B50;&#x9670;&#x6027;&#xFF09;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x3001;&#x30E2;&#x30B8;&#x30E5;&#x30FC;&#x30EB;&#x306E;&#x8868;&#x9762;&#x306B;&#x5411;&#x304B;&#x3063;&#x3066;&#x79FB;&#x884C;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;MSC&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x305F;&#x3002;&#x30E2;&#x30B8;&#x30E5;&#x30FC;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;EC&#x3067;&#x88AB;&#x8986;&#x3057;&#x305F;&#x5834;&#x5408;&#x306B;&#x306F;&#x3001;MSC&#x306E;&#x5206;&#x5316;&#x3068;&#x79FB;&#x884C;&#x306E;&#x7A0B;&#x5EA6;&#x306F;&#x3001;MSC&#x304C;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x3068;&#x8868;&#x73FE;&#x578B;&#x306E;&#x5E73;&#x6ED1;&#x7B4B;&#x7D30;&#x80DE;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x5468;&#x76AE;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x306A;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3001;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x305F;&#x3002; MSC&#x306F;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x5DEE;&#x5225;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x3001;MSC&#x306E;&#x6570;&#x304C;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x5897;&#x52A0;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;&#x5897;&#x6B96;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x304C;&#x767A;&#x751F;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x9759;&#x7684;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C8;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x8457;&#x3057;&#x304F;&#x5C11;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002; MSC&#x306F;&#x3001;&#x79FB;&#x884C;&#x3057;&#x305F;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3001;&#x5F7C;&#x3089;&#x306F;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30AA;&#x30B0;&#x30EA;&#x30AB;&#x30F3;&#x306E;&#x6C88;&#x7740;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x884C;&#x5217;&#x3092;&#x4F5C;&#x6210;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x7DCF;&#x79F0;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;MSC-&#x57CB;&#x3081;&#x8FBC;&#x307E;&#x308C;&#x305F;&#x30E2;&#x30B8;&#x30E5;&#x30FC;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x7D44;&#x7E54;&#x5DE5;&#x5B66;&#x306E;&#x69CB;&#x6210;&#x8981;&#x7D20;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x6A5F;&#x80FD;&#x8840;&#x7BA1;&#x7CFB;&#x306E;&#x5F62;&#x6210;&#x306B;&#x6709;&#x7528;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x5506;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30A8;&#x30A2;&#x30B3;&#x30F3;&#x7D44;&#x7E54;&#x5DE5;&#x5B66;&#x69CB;&#x7BC9;&#x7269;&#x306F;&#x3001;&#x85AC;&#x7269;&#x691C;&#x67FB;&#x3068;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x7684;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4E09;&#x6B21;&#x5143;&#x306E;&#x30BB;&#x30EB;&#x3092;&#x542B;&#x3093;&#x3060;&#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x8208;&#x5473;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x304B;&#x3082;&#x3057;&#x308C;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;

&#x4F53;&#x5916;&#x8840;&#x7BA1;&#x7CFB;&#x306B;&#x5411;&#x304B;&#x3063;&#x3066;&#xFF1A;&#x5185;&#x76AE;&#x7D30;&#x80DE;&#x30B7;&#x30FC;&#x30C9;&#x306E;&#x30E2;&#x30B8;&#x30E5;&#x30FC;&#x30EB;&#x5185;&#x3067;&#x9593;&#x8449;&#x7CFB;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x5206;&#x5316;&#x306F;&#x3001;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x6D41;&#x4F53;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x30E3;&#x30F3;&#x30D0;&#x30FC;&#x306B;&#x69CB;&#x7BC9;

&#xAD00;&#xB958; &#xC758;&#xBB34;&#xAC00; &#xCCB4; &#xC678; &#xC870;&#xC9C1; &#xAD6C;&#xC870;&#xB294; &#xBB34;&#xC791;&#xC704;&#xB85C; &#xACB0;&#xD569; &#xCC54;&#xBC84;&#xB85C; &#xCF54;&#xD305; &#xC911;&#xAC04; &#xC5FD; &#xAE30;&#xC9C8; &#xC138;&#xD3EC; (MSC)-&#xD3EC;&#xD568; &#xB41C;, &#xB0B4; &#xD53C; &#xC138;&#xD3EC; (EC)-&#xCF5C;&#xB77C;&#xAC90; &#xC2E4;&#xB9B0;&#xB354; (&#xBAA8;&#xB4C8;)&#xB97C; &#xD3EC;&#xC7A5; &#xD558; &#xC5EC; &#xD615;&#xC131; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. Submillimeter &#xD06C;&#xAE30;&#xC758; &#xBAA8;&#xB4C8;&#xC758; &#xC784;&#xC758; &#xD3EC;&#xC7A5; &#xD558; &#xC5EC; &#xB9CC;&#xB4E0; interstices EC &#xC904;&#xC9C0;&#xC5B4; &#xCC44;&#xB110;&#xC744; &#xB9CC;&#xB4E4;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD750;&#xB984; &#xC608;&#xC0C1; &#xCD95;&#xC758; &#xAE08;&#xC561; &#xBC0F; &#xBAA8;&#xB4C8;&#xD615; &#xAD6C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xB9AC; &#xBAA8;&#xB378;&#xB9C1; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xB354; &#xD070; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD750;&#xB984; &#xBD80;&#xB4DC;&#xB7EC;&#xC6B4; &#xADFC;&#xC721; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C8;&#xCEE4; (&#xBD80;&#xB4DC;&#xB7EC;&#xC6B4; &#xADFC;&#xC721; &#xB9D0;&#xB77C; &#xC591;&#xC131;, desmin &#xC591;&#xC131; &#xBC0F; von Willebrand &#xC778;&#xC790; &#xBD80;&#xC815;)&#xC744; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD558; &#xC5EC; &#xBAA8;&#xB4C8;&#xC758; &#xD45C;&#xBA74; &#xCABD;&#xC73C;&#xB85C; &#xB9C8;&#xC774;&#xADF8;&#xB808;&#xC774;&#xC158;&#xD560; MSC&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBC1B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBAA8;&#xB4C8;&#xC740; EC&#xC640; &#xCF54;&#xD305; &#xD588;&#xB2E4;, MSC &#xBD80;&#xB4DC;&#xB7EC;&#xC6B4; &#xADFC;&#xC721; &#xC138;&#xD3EC;-&#xB610;&#xB294; pericyte &#xAC19;&#xC740; &#xC790;&#xC2E0;&#xC758; &#xC704;&#xCE58;&#xC640; &#xD45C;&#xD604; &#xD615;&#xC5D0; &#xC9C0; &#xACE0; &#xC788;&#xC5C8;&#xB2E4; &#xC81C;&#xC548; MSC &#xCC28;&#xBCC4;&#xD654; &#xBC0F; &#xB9C8;&#xC774;&#xADF8;&#xB808;&#xC774;&#xC158; &#xBC94;&#xC704; &#xC99D;&#xAC00;. MSC&#xB3C4; &#xD655;&#xC0B0;, &#xCC28;&#xBCC4;&#xD654; &#xB41C; MSC&#xC758; &#xC22B;&#xC790;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xC99D;&#xAC00;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xD6A8;&#xACFC; &#xD604;&#xC800; &#xD558; &#xAC8C; &#xC801;&#xC740; &#xC815;&#xC801; &#xCEE8;&#xD2B8;&#xB864; &#xD750;&#xB984;&#xC744; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xC9C0; &#xD588;&#xB2E4;. MSC &#xB9C8;&#xC774;&#xADF8;&#xB808;&#xC774;&#xC158;&#xD560; &#xB54C; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC740; proteoglycans&#xC758; &#xC99D; &#xCC29;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xC0C8; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4;&#xB97C; &#xB9CC;&#xB4E4;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC0E8; &#xB2E4;, &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; MSC &#xC784;&#xBCA0;&#xB514;&#xB4DC; &#xBAA8;&#xB4C8; &#xC124;&#xACC4; &#xC870;&#xC9C1; &#xAD6C;&#xC870; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801; &#xD608;&#xAD00; &#xD615;&#xC131;&#xC744; &#xC704;&#xD574; &#xC720;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC124;&#xACC4; &#xD750;&#xB984; &#xC870;&#xC808; &#xC870;&#xC9C1; &#xAD6C;&#xC870; &#xC57D;&#xBB3C; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xBC0F; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; 3 &#xCC28;&#xC6D0; &#xC140; &#xB77C;&#xB374; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC;&#xC758; &#xAD00;&#xC2EC; &#xC788;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC5D0; &#xCCB4; &#xC678; &#xD608;&#xAD00; &#xCABD;&#xC73C;&#xB85C;: &#xBBF8;&#xC138; &#xD750;&#xB984; &#xCC54;&#xBC84;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB0B4; &#xD53C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC2DC;&#xB4DC; &#xBAA8;&#xB4C8;&#xD615; &#xAD6C;&#xBB38; &#xB0B4; &#xC911;&#xAC04; &#xC5FD; &#xAE30;&#xC9C8; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xBD84;&#xD654;.

Un tejido in vitro construir susceptibles de perfusi&#xF3;n se form&#xF3; por azar embalaje de c&#xE9;lulas mesenquimales del estroma (MSC)-incrustado, c&#xE9;lulas endoteliales (CE)-recubiertos cilindros de col&#xE1;geno (m&#xF3;dulos) en una c&#xE1;mara de microfluidos. Los intersticios creados por la empaquetadura aleatoria de los m&#xF3;dulos de tama&#xF1;o submilim&#xE9;trico creados CE forradas canales. Flujo causado una cantidad mayor a la esperada de la contracci&#xF3;n y remodelaci&#xF3;n en las construcciones modulares. Flujo influenciado el MSC para desarrollar lisas marcadores de c&#xE9;lulas musculares (actina de m&#xFA;sculo liso-positivo, desmina-positiva, y el factor von Willebrand negativa-) y migran hacia la superficie de los m&#xF3;dulos. Cuando los m&#xF3;dulos se revistieron con CE, el grado de diferenciaci&#xF3;n MSC y aumento de la migraci&#xF3;n, lo que sugiere que el MSC se convertirse en c&#xE9;lulas del m&#xFA;sculo liso o pericitos como en su localizaci&#xF3;n y fenotipo. El MSC tambi&#xE9;n proliferaron, resultando en un aumento sustancial en el n&#xFA;mero de MSC diferenciada. Estos efectos fueron mucho menos para los controles est&#xE1;ticos que no experimentan flujo. A medida que el MSC migrado, se cre&#xF3; una nueva matriz que incluye la deposici&#xF3;n de los proteoglicanos. En conjunto, estos resultados sugieren que el MSC incrustados m&#xF3;dulos pueden ser &#xFA;tiles para la formaci&#xF3;n de la vasculatura funcional en las construcciones de ingenier&#xED;a tisular. Adem&#xE1;s, estas construcciones de tejidos acondicionado flujo de ingenier&#xED;a puede ser de inter&#xE9;s como tridimensionales de c&#xE9;lulas cargadas de plataformas para las pruebas de drogas y ensayos biol&#xF3;gicos.

Hacia una vasculatura in vitro: La diferenciaci&#xF3;n de las c&#xE9;lulas mesenquimales del estroma Dentro de una c&#xE9;lula endotelial cabeza de serie modular de construir en una c&#xE1;mara de flujo de microfluidos

&#x6570;&#x5B57;&#x5FAE;&#x6D41;&#x4F53; (DMF) &#x4E2D;&#x54EA;&#x4E2A; picolitre &#x5FAE;&#x5347;&#x6EF4;&#x64CD;&#x7EB5;&#x9759;&#x7535;&#x7684;&#x7535;&#x6781;&#xFF0C;&#x5728;&#x6570;&#x7EC4;&#x7684;&#x6D41;&#x4F53;&#x5904;&#x7406;&#x6280;&#x672F;&#x6700;&#x8FD1;&#x6D41;&#x884C;&#x5728;&#x5316;&#x5B66;&#x548C;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x4E2D;&#x7684;&#x5E94;&#x7528;&#x3002;DMF &#x88C5;&#x7F6E;&#x53EF;&#x91CD;&#x6784;&#xFF0C;&#x6CA1;&#x6709;&#x79FB;&#x52A8;&#x90E8;&#x4EF6;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4E14;&#x4E0E;&#x4F20;&#x7EDF;&#x7684;&#x9AD8;&#x901A;&#x91CF;&#x7B5B;&#x9009;&#x57FA;&#x7840;&#x7ED3;&#x6784; &#xFF08;&#x4F8B;&#x5982;&#xFF0C;&#x591A;&#x4E95;&#x677F;&#x8BFB;&#x8005;&#xFF09; &#x517C;&#x5BB9;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x548C;&#x5176;&#x4ED6;&#x539F;&#x56E0;&#xFF0C;&#x6570;&#x5B57;&#x5FAE;&#x6D41;&#x4F53;&#x5DF2;&#x88AB;&#x5439;&#x6367;&#x4E3A;&#x88AB;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x7B5B;&#x9009;&#x4E2D;&#x7684;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x53EF;&#x80FD;&#x6709;&#x7528;&#x7684;&#x65B0;&#x5DE5;&#x5177;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x7528;&#x6765;&#x5B9E;&#x73B0;&#x5E76;&#x884C;&#x89C4;&#x6A21;&#x57FA;&#x4E8E;&#x7EC6;&#x80DE;&#x68C0;&#x5B9A;&#x7684;&#x7B2C;&#x4E00;&#x4E2A;&#x6570;&#x5B57;&#x5FAE;&#x6D41;&#x63A7;&#x5E73;&#x53F0;&#x3002;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;-3 &#x6D3B;&#x6027;&#x8367;&#x5149;&#x51CB;&#x4EA1;&#x68C0;&#x6D4B;&#x88AB;&#x8BC4;&#x4E3A;&#x6A21;&#x578B;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7531;&#x4E8E;&#x51CB;&#x4EA1;&#x7684;&#x666E;&#x53CA;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x6297;&#x764C;&#x836F;&#x7269;&#x53D1;&#x73B0;&#x7814;&#x7A76;&#x7684;&#x76EE;&#x6807;&#x3002;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;-3 &#x6D3B;&#x6027;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x51FD;&#x6570;&#x7684; staurosporine &#x6D53;&#x5EA6;&#x7684;&#x5242;&#x91CF;-&#x53CD;&#x5E94;&#x914D;&#x7F6E;&#x6587;&#x4EF6;&#x751F;&#x6210;&#x4F7F;&#x7528;&#x6570;&#x5B57;&#x5FAE;&#x6D41;&#x63A7;&#x65B9;&#x6CD5;&#x548C;&#x5E38;&#x89C4;&#x6280;&#x672F; &#xFF08;&#x5373;&#x85C9;&#x5438;&#x91CF;&#x7BA1;&#x3001; &#x613F;&#x671B;&#x548C; 96 &#x4E95;&#x677F;&#x3002;&#x4E0D;&#x51FA;&#x6240;&#x6599;&#xFF0C;&#x6570;&#x5B57;&#x5FAE;&#x6D41;&#x63A7;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6709; 33-fold &#x51CF;&#x5C11;&#x8BD5;&#x5242;&#x7684;&#x6D88;&#x8017;&#xFF0C;&#x76F8;&#x5BF9;&#x4E8E;&#x4F20;&#x7EDF;&#x7684;&#x6280;&#x672F;&#x3002;&#x867D;&#x7136;&#x8FD9;&#x4E24;&#x79CD;&#x7C7B;&#x578B;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x4F7F;&#x7528;&#x76F8;&#x540C;&#x7684;&#x63A2;&#x6D4B;&#x5668; &#xFF08;&#x53F0;&#x5F0F;&#x591A;&#x4E95;&#x677F;&#x8BFB;&#x5361;&#x5668;&#xFF09;&#xFF0C;&#x6570;&#x5B57;&#x5FAE;&#x6D41;&#x63A7;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6240;&#x751F;&#x6210;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x4E86;&#x68C0;&#x6D4B;&#x4E0B;&#x9650;&#x548C;&#x66F4;&#x5927;&#x7684;&#x52A8;&#x6001;&#x8303;&#x56F4;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x7EC6;&#x80DE;&#x51CB;&#x4EA1; de-laminate &#x5F53;&#x66B4;&#x9732;&#x5728;&#x6DB2;&#x6EF4;&#x64CD;&#x7EB5;&#x7684; DMF &#x85C9;&#x5438;&#x91CF;&#x7BA1;/&#x5438;&#x591A;&#x4E95;&#x677F;&#x76F8;&#x5BF9;&#x5C11;&#x5F97;&#x591A;&#x53EF;&#x80FD;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6240;&#x63CF;&#x8FF0;&#x7684;&#x6280;&#x672F;&#x4EE3;&#x8868;&#x6570;&#x5B57;&#x5FAE;&#x6D41;&#x4F53;&#x5E73;&#x884C;&#x57FA;&#x4E8E;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7684;&#x7B5B;&#x9009;&#x53CA;&#x5176;&#x4ED6;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x7684;&#x6709;&#x7528;&#x5DE5;&#x5177;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x53D1;&#x5C55;&#x4E2D;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x91CD;&#x8981;&#x91CC;&#x7A0B;&#x7891;&#x3002;

&#x6570;&#x5B57;&#x5FAE;&#x6D41;&#x63A7;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x57FA;&#x4E8E;&#x7EC6;&#x80DE;&#x51CB;&#x4EA1;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;

Digital microfluidics (DMF), a fluid-handling technique in which picolitre-microlitre droplets are manipulated electrostatically on an array of electrodes, has recently become popular for applications in chemistry and biology. DMF devices are reconfigurable, have no moving parts, and are compatible with conventional high-throughput screening infrastructure (e.g., multiwell plate readers). For these and other reasons, digital microfluidics has been touted as being a potentially useful new tool for applications in multiplexed screening. Here, we introduce the first digital microfluidic platform used to implement parallel-scale cell-based assays. A fluorogenic apoptosis assay for caspase-3 activity was chosen as a model system because of the popularity of apoptosis as a target for anti-cancer drug discovery research. Dose-response profiles of caspase-3 activity as a function of staurosporine concentration were generated using both the digital microfluidic method and conventional techniques (i.e., pipetting, aspiration, and 96-well plates.) As expected, the digital microfluidic method had a 33-fold reduction in reagent consumption relative to the conventional technique. Although both types of methods used the same detector (a benchtop multiwell plate reader), the data generated by the digital microfluidic method had lower detection limits and greater dynamic range because apoptotic cells were much less likely to de-laminate when exposed to droplet manipulation by DMF relative to pipetting/aspiration in multiwell plates. We propose that the techniques described here represent an important milestone in the development of digital microfluidics as a useful tool for parallel cell-based screening and other applications.

A digital microfluidic method for multiplexed cell-based apoptosis assays.

Microfluidique digitale (DMF), une technique de gestion des fluides dans lequel picolitres-microlitre gouttelettes sont manipul&#xE9;s &#xE9;lectrostatiquement sur un r&#xE9;seau d&#x26;#39;&#xE9;lectrodes, est r&#xE9;cemment devenue populaire pour les applications en chimie et biologie. Dispositifs de DMF sont reconfigurables, n&#x26;#39;ont pas de pi&#xE8;ces mobiles, et sont compatibles avec l&#x26;#39;infrastructure de d&#xE9;pistage classique &#xE0; haut d&#xE9;bit (par exemple, lecteurs de plaques multipuits). Pour ces raisons et d&#x26;#39;autres, microfluidique digitale a &#xE9;t&#xE9; pr&#xE9;sent&#xE9; comme &#xE9;tant un outil potentiellement utile pour des applications nouvelle en mati&#xE8;re de d&#xE9;pistage multiplex&#xE9;. Ici, nous introduisons la premi&#xE8;re plate-forme microfluidique digitale utilis&#xE9;e pour mettre en &#x153;uvre en parall&#xE8;le &#xE9;chelle tests cellulaires. Un test de l&#x26;#39;apoptose fluorog&#xE8;ne pour activit&#xE9; caspase-3 a &#xE9;t&#xE9; choisi comme un syst&#xE8;me mod&#xE8;le en raison de la popularit&#xE9; de l&#x26;#39;apoptose comme une cible pour les anti-recherche sur le cancer de d&#xE9;couverte de m&#xE9;dicaments. Dose-r&#xE9;ponse des profils de l&#x26;#39;activit&#xE9; caspase-3 en tant que fonction de la concentration staurosporine ont &#xE9;t&#xE9; g&#xE9;n&#xE9;r&#xE9;s en utilisant &#xE0; la fois la m&#xE9;thode la microfluidique digitale et les techniques traditionnelles (c.-&#xE0;-pipetage, aspiration, et plaques &#xE0; 96 puits.) Comme pr&#xE9;vu, la m&#xE9;thode la microfluidique digitale, avait une participation de 33 -plier la r&#xE9;duction de la consommation de r&#xE9;actif par rapport &#xE0; la technique conventionnelle. Bien que les deux types de m&#xE9;thodes utilis&#xE9;es le m&#xEA;me d&#xE9;tecteur (une paillasse lecteur de plaques multipuits), les donn&#xE9;es g&#xE9;n&#xE9;r&#xE9;es par la m&#xE9;thode num&#xE9;rique microfluidique avait des limites de d&#xE9;tection plus basses et une plus grande gamme dynamique parce que les cellules apoptotiques &#xE9;taient beaucoup moins susceptibles de de-stratifi&#xE9; lorsqu&#x26;#39;il est expos&#xE9; &#xE0; la manipulation des gouttelettes par par rapport &#xE0; la DMF pipetage / aspiration dans des plaques multipuits. Nous proposons que les techniques d&#xE9;crites ici repr&#xE9;sentent un jalon important dans le d&#xE9;veloppement de la microfluidique digitale comme un outil utile pour parall&#xE8;le le criblage cellulaire et d&#x26;#39;autres applications.

Une m&#xE9;thode num&#xE9;rique microfluidique pour multiplex&#xE9;s dosages apoptose des cellules &#xE0; base de

Vor kurzem popul&auml;r f&uuml;r Anwendungen in der Chemie und Biologie digitale Biochips (DMF), eine Technik des Umgang mit Fl&uuml;ssigkeiten in die Picolitre-Mikroliter Tr&ouml;pfchen auf ein Array von Elektroden, elektrostatisch manipuliert werden geworden. DMF-Ger&auml;te sind rekonfigurierbare, haben keine beweglichen Teile und sind kompatibel mit herk&ouml;mmlichen High-Throughput-Screening-Infrastruktur (z.B. MULTIWELLPLATTE-Leser). Aus diesen und anderen Gr&uuml;nden wurde digital Mikrofluidik angepriesen als ein brauchbarer neues Tool f&uuml;r Anwendungen im Multiplex-Screening. Hier stellen wir die erste digitale Microfluidic-Plattform, die zum Implementieren der Parallel operierenden zellbasierte Assays. Ein Fluorogenic Apoptosis Assay f&uuml;r Caspase-3-Aktivit&auml;t wurde wegen der Popularit&auml;t der Apoptose als Ziel f&uuml;r Krebsmedikament Entdeckung Forschung als Modellsystem gew&auml;hlt. Dosis-Wirkungs-Arten der Caspase-3 T&auml;tigkeit als Funktion der Staurosporine Konzentration wurden erzeugt, mit dem digitale Microfluidic-Methode und die konventionellen Techniken (d.h. pipettieren, streben und 96-Well Platten.) Wie erwartet, hatte die digitale Microfluidic-Methode eine Verringerung der 33-fold im Reagenzienverbrauch im Vergleich zu der konventionellen Technik. Obwohl beide Arten von Methoden den gleichen Detektor (ein Benchtop multiwell Platte Leser) verwendet, hatte von der digitalen Microfluidic-Methode generierten Daten unteren Nachweisgrenzen und gr&ouml;&szlig;eren Dynamikbereich, weil Apoptotic Zellen viel weniger wahrscheinlich de-laminate wenn Tr&ouml;pfchen Manipulation durch DMF relativ pipettieren/streben in multiwell-Platten ausgesetzt waren. Wir schlagen vor, dass die hier beschriebenen Techniken einen wichtigen Meilenstein in der Entwicklung der digitalen Biochips als ein n&uuml;tzliches Werkzeug f&uuml;r parallele zellbasierte Screening und andere Anwendungen darstellen.

Eine digitale Microfluidic-Methode f&uuml;r Multiplex zellbasierte Apoptose-Assays.

Microfluidics digitale (DMF), una tecnica di fluidi in cui picolitre-microlitri goccioline sono manipolate elettrostaticamente su una matrice di elettrodi, recentemente &egrave; diventato popolare per le applicazioni in chimica e biologia. DMF dispositivi sono riconfigurabili, non hanno parti in movimento e sono compatibili con convenzionale high-throughput screening infrastrutture (ad esempio, i lettori del multiwell piastra). Per questi ed altri motivi, microfluidica digitale &egrave; stato presentato come un nuovo strumento potenzialmente utile per le applicazioni in screening multiplex. Qui, presentiamo la prima piattaforma microfluidica digitale utilizzata per implementare parallelo-scala cell-based assays. Un saggio di apoptosis fluorogenic per attivit&agrave; di caspase-3 &egrave; stato scelto come sistema di modello a causa della popolarit&agrave; dell&#39;apoptosi come bersaglio per la ricerca di scoperta del farmaco anti-cancro. Profili di dose-risposta di attivit&agrave; di caspase-3 in funzione della concentrazione di staurosporine sono stati generati utilizzando sia il metodo di microfluidica digitale e le tecniche convenzionali (cio&egrave;, il pipettaggio, aspirazione e piastre da 96 pozzetti.) Come previsto, il metodo di microfluidica digitale aveva una 33-fold riduzione nel consumo di reagente rispetto alla tecnica convenzionale. Sebbene entrambi i tipi di metodi utilizzati il rivelatore stesso (un lettore di piastra del multiwell da banco), i dati generati dal metodo microfluidica digitale avevano limiti di rilevabilit&agrave; inferiori e maggiore gamma dinamica perch&eacute; le cellule apoptotic erano molto meno probabile che de-laminate quando esposto alla manipolazione gocciolina di DMF rispetto alla aspirazione/dispensazione in piastre trasportatrici. Proponiamo che le tecniche qui descritte rappresentano un&#39;importante pietra miliare nello sviluppo di microfluidics digitale come uno strumento utile per lo screening basati su celle parallelo e altre applicazioni.

Un metodo di microfluidica digitale per multiplex apoptosi cell-based assays.

&#x30C7;&#x30B8;&#x30BF;&#x30EB;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30D5;&#x30EB;&#x30A4;&#x30C7;&#x30A3;&#x30AF;&#x30B9;&#xFF08;DMF&#xFF09;&#x3001;picolitre-&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30EA;&#x30C3;&#x30C8;&#x30EB;&#x306E;&#x6DB2;&#x6EF4;&#x304C;&#x96FB;&#x6975;&#x306E;&#x30A2;&#x30EC;&#x30A4;&#x4E0A;&#x306B;&#x9759;&#x96FB;&#x7684;&#x306B;&#x64CD;&#x4F5C;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6D41;&#x4F53;&#x30CF;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x6280;&#x8853;&#x306F;&#x3001;&#x6700;&#x8FD1;&#x3067;&#x306F;&#x5316;&#x5B66;&#x3068;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4EBA;&#x6C17;&#x3068;&#x306A;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002; DMF&#x30C7;&#x30D0;&#x30A4;&#x30B9;&#x306F;&#x3001;&#x518D;&#x69CB;&#x6210;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x53EF;&#x52D5;&#x90E8;&#x54C1;&#x3092;&#x6301;&#x305F;&#x305A;&#x3001;&#x5F93;&#x6765;&#x306E;&#x30CF;&#x30A4;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x30A4;&#x30F3;&#x30D5;&#x30E9;&#x30B9;&#x30C8;&#x30E9;&#x30AF;&#x30C1;&#x30E3;&#xFF08;&#x4F8B;&#x3048;&#x3070;&#x3001;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30A6;&#x30A7;&#x30EB;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x30C0;&#x30FC;&#xFF09;&#x3068;&#x4E92;&#x63DB;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x4ED6;&#x306E;&#x7406;&#x7531;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x30C7;&#x30B8;&#x30BF;&#x30EB;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30D5;&#x30EB;&#x30A4;&#x30C7;&#x30A3;&#x30AF;&#x30B9;&#x306F;&#x3001;&#x591A;&#x91CD;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306B;&#x6709;&#x7528;&#x306A;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3068;&#x8B33;&#x308F;&#x308C;&#x3066;&#x304D;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x4E26;&#x5217;&#x898F;&#x6A21;&#x30BB;&#x30EB;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3092;&#x5B9F;&#x88C5;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6700;&#x521D;&#x306E;&#x30C7;&#x30B8;&#x30BF;&#x30EB;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x6D41;&#x4F53;&#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x3092;&#x3054;&#x7D39;&#x4ECB;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30AB;&#x30B9;&#x30D1;&#x30FC;&#x30BC;-3&#x6D3B;&#x6027;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x30A2;&#x30DD;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x3001;&#x6297;&#x304C;&#x3093;&#x5275;&#x85AC;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x30A2;&#x30DD;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x306E;&#x4EBA;&#x6C17;&#x306E;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x7CFB;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x9078;&#x3070;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30B9;&#x30BF;&#x30A6;&#x30ED;&#x30B9;&#x30DD;&#x30EA;&#x30F3;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x306E;&#x95A2;&#x6570;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x306E;&#x30AB;&#x30B9;&#x30D1;&#x30FC;&#x30BC;3&#x6D3B;&#x6027;&#x306E;&#x7528;&#x91CF; - &#x53CD;&#x5FDC;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x4E88;&#x60F3;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3001;&#x30C7;&#x30B8;&#x30BF;&#x30EB;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x6D41;&#x4F53;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;33&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x30C7;&#x30B8;&#x30BF;&#x30EB;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x624B;&#x6CD5;&#x3068;&#x5F93;&#x6765;&#x624B;&#x6CD5;&#xFF08;&#x3059;&#x306A;&#x308F;&#x3061;&#x3001;&#x30D4;&#x30DA;&#x30C3;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x3001;&#x5438;&#x5F15;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;96&#x30A6;&#x30A7;&#x30EB;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#xFF09;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x751F;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5F93;&#x6765;&#x6280;&#x8853;&#x306E;&#x76F8;&#x5BFE;&#x7684;&#x8A66;&#x85AC;&#x306E;&#x6D88;&#x8CBB;&#x91CF;&#x304C;&#x500D;&#x306B;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3002;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x304C;&#x540C;&#x3058;&#x691C;&#x51FA;&#x5668;&#xFF08;&#x5353;&#x4E0A;&#x578B;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30A6;&#x30A7;&#x30EB;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x30C0;&#x30FC;&#xFF09;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x305F;&#x3082;&#x306E;&#x306E;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x6DB2;&#x6EF4;&#x306E;&#x64CD;&#x4F5C;&#x306B;&#x3055;&#x3089;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5834;&#x5408;&#x3001;&#x30A2;&#x30DD;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x7D30;&#x80DE;&#x306F;&#x3001;&#x306F;&#x308B;&#x304B;&#x306B;&#x5C11;&#x306A;&#x3044;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x9AD8;&#x3044;&#x30C7;&#x30E9;&#x30DF;&#x30CD;&#x30FC;&#x30C8;&#x306B;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x305F;&#x3081;&#x3001;&#x30C7;&#x30B8;&#x30BF;&#x30EB;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x751F;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x304C;&#x691C;&#x51FA;&#x4E0B;&#x200B;&#x200B;&#x9650;&#x3068;&#x5E83;&#x3044;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30C3;&#x30AF;&#xB7;&#x30EC;&#x30F3;&#x30B8;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30A6;&#x30A7;&#x30EB;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x3067;&#x30D4;&#x30DA;&#x30C3;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;/&#x8AA4;&#x56A5;&#x306E;&#x76F8;&#x5BFE;DMF&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x305F;&#x30C6;&#x30AF;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF;&#x306F;&#x3001;&#x4E26;&#x5217;&#x30BB;&#x30EB;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x3068;&#x4ED6;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;&#x6709;&#x7528;&#x306A;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x30C7;&#x30B8;&#x30BF;&#x30EB;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30D5;&#x30EB;&#x30A4;&#x30C7;&#x30A3;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E;&#x767A;&#x5C55;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x30DE;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x30C8;&#x30FC;&#x30F3;&#x3092;&#x8868;&#x3059;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x63D0;&#x6848;&#x3059;&#x308B;&#x3002;

&#x591A;&#x91CD;&#x30BB;&#x30EB;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x200B;&#x200B;&#x30A2;&#x30DD;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30C7;&#x30B8;&#x30BF;&#x30EB;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x6D41;&#x4F53;&#x65B9;&#x6CD5;

&#xB514;&#xC9C0;&#xD138; microfluidics (DMF)&#xB294; picolitre microlitre&#xC5D0; &#xBC29;&#xC6B8; &#xC870;&#xC791; &#xD558;&#xB294; electrostatically, &#xC804;&#xADF9;&#xC758; &#xBC30;&#xC5F4;&#xC5D0; &#xC561;&#xCCB4; &#xCC98;&#xB9AC; &#xAE30;&#xC220; &#xCD5C;&#xADFC; &#xD654;&#xD559; &#xBC0F; &#xC0DD;&#xBB3C;&#xD559;&#xC758; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC778;&#xAE30;&#xAC00; &#xC788;&#xB2E4;. DMF &#xC7A5;&#xCE58; &#xC7AC;&#xAD6C;&#xC131; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C;&#xB294; &#xC6C0;&#xC9C1;&#xC774;&#xB294; &#xBD80;&#xD488; &#xC5C6;&#xC74C; &#xC788;&#xACE0; &#xAE30;&#xC874;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; &#xAC80;&#xC5F4; &#xC778;&#xD504;&#xB77C; (&#xC608;: multiwell &#xACA9;&#xD310;&#xB36E;&#xAC1C; &#xB3C5;&#xC790; &#xB4E4;)&#xC640; &#xD638;&#xD658; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB4E4;&#xACFC; &#xB2E4;&#xB978; &#xC774;&#xC720;&#xB97C; &#xC704;&#xD55C; &#xB514;&#xC9C0;&#xD138; microfluidics &#xB2E4;&#xC911;&#xD654; &#xC2EC;&#xC0AC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC720;&#xC6A9;&#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xB3C4;&#xAD6C; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xC120;&#xC804; &#xD558;&#xACE0;&#xC788;&#xB2E4;. &#xBCD1;&#xB82C; &#xB2E8;&#xC704; &#xC138;&#xD3EC; &#xAE30;&#xBC18; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC744; &#xAD6C;&#xD604; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xCCAB; &#xBC88;&#xC9F8; &#xB514;&#xC9C0;&#xD138; &#xBBF8;&#xC138; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC; &#xC18C;&#xAC1C;. Fluorogenic apoptosis &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; caspase 3 &#xD65C;&#xB3D9; &#xBAA8;&#xB378; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC73C;&#xB85C; &#xD56D; &#xC554; &#xC57D;&#xBB3C; &#xBC1C;&#xACAC; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC758; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; apoptosis&#xC758; &#xC778;&#xAE30; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xC120;&#xC815; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. Staurosporine &#xB18D;&#xB3C4;&#xC758; &#xD568;&#xC218;&#xB85C; caspase 3 &#xD65C;&#xB3D9;&#xC758; &#xBCF5;&#xC6A9;&#xB7C9; &#xC751;&#xB2F5; &#xD504;&#xB85C;&#xD544; &#xB514;&#xC9C0;&#xD138; &#xACB0;&#xD569; &#xBC29;&#xBC95;&#xACFC; &#xAE30;&#xC874;&#xC758; &#xAE30;&#xBC95; (&#xC989;, pipetting, &#xD3EC;&#xBD80;, 96-&#xC798; &#xBC88;&#xD638;&#xD310;.) &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC0DD;&#xC131; &#xB41C; &#xC608;&#xC0C1; &#xD588;&#xB358; &#xB300;&#xB85C;, &#xB514;&#xC9C0;&#xD138; &#xACB0;&#xD569; &#xBC29;&#xBC95; &#xAE30;&#xBCF8; &#xAE30;&#xC220; &#xAE30;&#xC900;&#xC73C;&#xB85C; &#xC18C;&#xBE44; &#xC2DC; &#xC57D; 33-fold &#xAC10;&#xC18C;&#xB97C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBE44;&#xB85D; &#xB3D9;&#xC77C;&#xD55C; &#xAC80;&#xCD9C;&#xAE30; (&#xBCA4;&#xCE58;&#xD0D1; multiwell &#xACA9;&#xD310;&#xB36E;&#xAC1C; &#xD310;&#xB3C5;&#xAE30;)&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95; &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC720;&#xD615;&#xC758; &#xB514;&#xC9C0;&#xD138; &#xACB0;&#xD569; &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC0DD;&#xC131; &#xB41C; &#xB370;&#xC774;&#xD130; apoptotic &#xC138;&#xD3EC; pipetting/&#xD3EC;&#xBD80; multiwell &#xACA9;&#xD310;&#xB36E;&#xAC1C;&#xC5D0; &#xC0C1;&#xB300;&#xC801;&#xC778; DMF&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBB3C;&#xBC29;&#xC6B8; &#xC870;&#xC791;&#xC5D0; &#xB178;&#xCD9C; &#xB418; &#xBA74; de-laminate&#xB97C; &#xD6E8;&#xC52C; &#xB35C; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC774; &#xC788;&#xAE30; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xB354; &#xB0AE;&#xC740; &#xAC80;&#xCD9C; &#xD55C;&#xACC4; &#xBC0F; &#xB354; &#xD070; &#xB2E4;&#xC774;&#xB098;&#xBBF9; &#xB808;&#xC778;&#xC9C0; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0; &#xC124;&#xBA85; &#xB41C; &#xAE30;&#xC220;&#xC744; &#xBCD1;&#xB82C; &#xC140; &#xAE30;&#xBC18; &#xC2EC;&#xC0AC; &#xBC0F; &#xAE30;&#xD0C0; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xC720;&#xC6A9;&#xD55C; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xB85C; &#xB514;&#xC9C0;&#xD138; microfluidics&#xC758; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC774;&#xC815;&#xD45C;&#xB97C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC81C;&#xC548; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB2E4;&#xC911;&#xD654; &#xB41C; &#xC140; &#xAE30;&#xBC18; apoptosis &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xB514;&#xC9C0;&#xD138; &#xACB0;&#xD569; &#xBC29;&#xBC95;

Digital de microfluidos (DMF), una t&#xE9;cnica de manejo de fluidos en el que picolitros-microlitros gotas son manipulados electrost&#xE1;ticamente en una matriz de electrodos, se ha vuelto popular para aplicaciones en la qu&#xED;mica y la biolog&#xED;a. Dispositivos de DMF son reconfigurables, no tienen partes m&#xF3;viles, y son compatibles con la infraestructura convencional de detecci&#xF3;n de alto rendimiento (por ejemplo, los lectores de placas multipocillo). Por estas y otras razones, digital microflu&#xED;dica ha sido considerada como una nueva herramienta potencialmente &#xFA;til para aplicaciones en la detecci&#xF3;n multiplexada. Aqu&#xED;, presentamos la primera plataforma digital de microfluidos utilizados para implementar en paralelo escala ensayos basados &#x200B;&#x200B;en c&#xE9;lulas. Un ensayo de la apoptosis fluorog&#xE9;nico de actividad caspasa-3 fue elegido como un sistema modelo debido a la popularidad de la apoptosis como un objetivo de lucha contra el c&#xE1;ncer de la investigaci&#xF3;n de descubrimiento de f&#xE1;rmacos. Dosis-respuesta de los perfiles de actividad caspasa-3 en funci&#xF3;n de la concentraci&#xF3;n de estaurosporina se generaron utilizando tanto el m&#xE9;todo digital de microfluidos y las t&#xE9;cnicas convencionales (es decir, pipeteo, la aspiraci&#xF3;n y placas de 96 pocillos.) Como era de esperar, el m&#xE9;todo de microfluidos digital tiene un 33 veces la reducci&#xF3;n en el consumo de reactivo con respecto a la t&#xE9;cnica convencional. Aunque ambos tipos de m&#xE9;todos utilizados el mismo detector (una mesa de trabajo multipocillos lector de placas), los datos generados por el m&#xE9;todo de microfluidos digital tiene bajos l&#xED;mites de detecci&#xF3;n y mayor rango din&#xE1;mico, porque las c&#xE9;lulas apopt&#xF3;ticas fueron mucho menos probable que de laminado cuando se expone a la manipulaci&#xF3;n de gotas por DMF en relaci&#xF3;n con pipeteo / aspiraci&#xF3;n en placas multipocillo. Proponemos que las t&#xE9;cnicas descritas aqu&#xED; representan un hito importante en el desarrollo de microfluidos digitales como una herramienta &#xFA;til para el paralelo basado en c&#xE9;lulas de detecci&#xF3;n y otras aplicaciones.

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Expression of the ExeAB complex of Aeromonas hydrophila is required for the localization and assembly of the ExeD secretion port multimer. Molecular microbiology\| PubMed ID: 11967081	2002
The p85alpha subunit of phosphatidylinositol 3'-kinase binds to and stimulates the GTPase activity of Rab proteins. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 15377662	2004
Identification of key residues in the A-Raf kinase important for phosphoinositide lipid binding specificity. Biochemistry\| PubMed ID: 15736953	2005
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M. Dean Chamberlain

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