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Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

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We report the synthesis and optical characterization of two new photoactivators and demonstrate their use for multiphoton excited three-dimensional free-form fabrication with proteins. These reagents were developed with the goal of cross-linking Type 1 collagen. This cross-linking process produces structures on the micron and submicron size scales. A rose bengal diisopropyl amine derivative combines the classic photoactivator and co-initiator system into one molecule, reducing the reaction kinetics and increasing cross-linking efficiency. This derivative was successful at producing stable structures from collagen, whereas rose bengal alone was not effective. A benzophenone dimer connected by a flexible diamine tether was also synthesized. This activator has two photochemically reactive groups and is highly efficient in cross-linking bovine serum albumin and Type 1 collagen to form stable, robust structures. This approach is more flexible in terms of cross-linking a variety of proteins than by traditional benzophenone photochemistry. The photophysical properties vary greatly from that of benzophenone, with the appearance of a new, lower energy absorption band (lambda max approximately 370 nm in water) and broad, visible emission band (approximately 500 nm maximum). This absorption band is highly solvatochromic, suggesting it arises, at least in part, from a charge transfer interaction. Collagens are typically difficult to cross-link photochemically, and the results here suggest that these two new activators will be suitable for cross-linking other forms of collagen and additional proteins for biomedical applications such as the de novo assembly of biomimetic tissue scaffolds.

New photoactivators for multiphoton excited three-dimensional submicron cross-linking of proteins: bovine serum albumin and type 1 collagen.

Nous d&#xE9;crivons la synth&#xE8;se et la caract&#xE9;risation optique de deux nouveaux photoactivateurs et de d&#xE9;montrer leur utilisation pour multiphotonique excit&#xE9; en trois dimensions de forme libre avec des prot&#xE9;ines de fabrication. Ces r&#xE9;actifs ont &#xE9;t&#xE9; d&#xE9;velopp&#xE9;s dans le but de r&#xE9;ticulation du collag&#xE8;ne de type 1. Ce processus de r&#xE9;ticulation produit des structures sur l&#x26;#39;ordre du micron et les &#xE9;chelles de taille submicronique. Un rose bengale diisopropylamine d&#xE9;riv&#xE9; combine le classique photoactivateur et de co-amorceur syst&#xE8;me dans une mol&#xE9;cule, la r&#xE9;duction de la cin&#xE9;tique de r&#xE9;action et en augmentant l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de r&#xE9;ticulation. Ce d&#xE9;riv&#xE9; a r&#xE9;ussi &#xE0; produire des structures stables &#xE0; partir de collag&#xE8;ne, tandis que le rose bengale seul n&#x26;#39;a pas &#xE9;t&#xE9; efficace. Un dim&#xE8;re benzoph&#xE9;none reli&#xE9;s par une attache souple diamine a &#xE9;galement &#xE9;t&#xE9; synth&#xE9;tis&#xE9;. Cet activateur a deux groupes photochimiquement r&#xE9;actif et est hautement efficace de r&#xE9;ticulation de la s&#xE9;rum albumine bovine et de type 1 du collag&#xE8;ne pour former des structures stables et solides. Cette approche est plus flexible en termes de r&#xE9;ticulation d&#x26;#39;une vari&#xE9;t&#xE9; de prot&#xE9;ines que par photochimie benzoph&#xE9;none traditionnelle. Les propri&#xE9;t&#xE9;s photophysiques varier consid&#xE9;rablement de celle de la benzoph&#xE9;none, avec l&#x26;#39;apparition d&#x26;#39;une nouvelle bande d&#x26;#39;&#xE9;nergie plus faible absorption (lambda max d&#x26;#39;environ 370 nm dans l&#x26;#39;eau) et large, bande d&#x26;#39;&#xE9;mission visible (environ 500 nm au maximum). Cette bande d&#x26;#39;absorption est tr&#xE8;s solvatochrome, sugg&#xE9;rant qu&#x26;#39;il se pose, au moins en partie, d&#x26;#39;une interaction de transfert de charge. Les collag&#xE8;nes sont g&#xE9;n&#xE9;ralement difficiles &#xE0; r&#xE9;ticuler photochimiquement, et les r&#xE9;sultats ici donnent &#xE0; penser que ces deux nouveaux activateurs sera adapt&#xE9; pour la r&#xE9;ticulation d&#x26;#39;autres formes de prot&#xE9;ines de collag&#xE8;ne et d&#x26;#39;autres pour des applications biom&#xE9;dicales telles que l&#x26;#39;assemblage de novo des structures d&#x26;#39;&#xE9;chafaudage tissulaires biomim&#xE9;tiques.

Photoactivateurs nouvelles pour multiphotonique excit&#xE9; tridimensionnelle Submicron r&#xE9;ticulation de prot&#xE9;ines: albumine s&#xE9;rique bovine et collag&#xE8;ne de type 1

New Photoaktivatoren f&#xFC;r Multiphotonen aufgeregt dreidimensionale Submikron Vernetzung von Proteinen: Rinderserumalbumin und Typ-1-Kollagen.

Ci riportano la sintesi e la caratterizzazione ottica di due nuove photoactivators e dimostrare il che loro uso per multiphoton eccitato fabbricazione libero-forma tridimensionale con le proteine. Questi reagenti sono stati sviluppati con l&#39;obiettivo di cross-linking di collagene di tipo 1. Questo processo di reticolazione produce strutture sulla bilancia dimensioni micron e submicron. Un derivato di ammina diisopropil Bengala rosa combina il classico photoactivator e sistema co-initiator in una molecola, riducendo la cinetica di reazione e aumentando l&#39;efficienza di cross-linking. Questo derivato riusciva a produrre strutture stabili da collagene, mentre rosa Bengala da solo non era efficace. Anche &egrave; stato sintetizzato un dimero di benzofenone collegato da un cavo flessibile diammina. Questo attivatore &egrave; altamente efficace nel cross-linking di albumina di siero bovino e collagene di tipo 1 a formare strutture stabili, robuste e ha due gruppi reattivi fotochimicamente. Questo approccio &egrave; pi&ugrave; flessibile in termini di cross-linking una variet&agrave; di proteine che di fotochimica benzofenone tradizionale. La propriet&agrave; photophysical variano notevolmente da quella del benzofenone, con la comparsa di un nuovo, bassa banda di assorbimento di energia (lambda max circa 370 nm in acqua) e larghe, banda di emissione visibile (circa 500 nm max.). Questa banda di assorbimento &egrave; altamente solvatochromic, suggerendo che si pone, almeno in parte, da un&#39;interazione di trasferimento di carica. Collageni sono in genere difficili da cross-link fotochimicamente, e qui i risultati suggeriscono che questi due nuovi attivatori sar&agrave; adatti per altre forme di collagene e proteine supplementari per applicazioni biomedicali come assembly de novo di biomimetic tessuto impalcature di cross-linking.

Nuovo photoactivators per multiphoton eccitato submicron tridimensionale cross-linking delle proteine: albumina di siero bovino e collagene di tipo 1.

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1&#x30B3;&#x30E9;&#x30FC;&#x30B2;&#x30F3;&#x3092;&#x67B6;&#x6A4B;&#x3067;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306F;&#x3001;&#x67B6;&#x6A4B;&#x306E;&#x4F1D;&#x7D71;&#x7684;&#x306A;&#x30D9;&#x30F3;&#x30BE;&#x30D5;&#x30A7;&#x30CE;&#x30F3;&#x306E;&#x5149;&#x5316;&#x5B66;&#x3088;&#x308A;&#x3082;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x69D8;&#x3005;&#x306A;&#x9762;&#x3067;&#x3001;&#x3088;&#x308A;&#x67D4;&#x8EDF;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5149;&#x7269;&#x7406;&#x7684;&#x6027;&#x8CEA;&#x306F;&#x3001;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x4F4E;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;&#x5438;&#x53CE;&#x5E2F;&#xFF08;&#x6C34;&#x4E2D;&#x30E9;&#x30E0;&#x30C0;max&#x306F;&#x7D04;370 nm&#xFF09;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5E83;&#x3044;&#x3001;&#x53EF;&#x8996;&#x767A;&#x5149;&#x5E2F;&#xFF08;&#x7D04;500 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novo&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x751F;&#x7269;&#x533B;&#x5B66;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30B3;&#x30E9;&#x30FC;&#x30B2;&#x30F3;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x305D;&#x306E;&#x4ED6;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x4ED6;&#x306E;&#x5F62;&#x614B;&#x306E;&#x67B6;&#x6A4B;&#x306B;&#x9069;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x591A;&#x5149;&#x5B50;&#x52B1;&#x8D77;&#x4E09;&#x6B21;&#x5143;&#x30DF;&#x30AF;&#x30ED;&#x30F3;&#x306E;&#x67B6;&#x6A4B;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;Photoactivators&#xFF1A;&#x30A6;&#x30B7;&#x8840;&#x6E05;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x304A;&#x3088;&#x3073;1&#x578B;&#x30B3;&#x30E9;&#x30FC;&#x30B2;&#x30F3;

&#xC6B0;&#xB9AC; &#xD569;&#xC131; &#xBC0F; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; photoactivators&#xC758; &#xAD11;&#xD559; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xBCF4;&#xACE0; &#xD558; &#xACE0; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC8C; &#xD765;&#xBD84; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; 3 &#xCC28;&#xC6D0; &#xC790;&#xC720;&#xD615; &#xC81C;&#xC870; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC2DC; &#xC57D;&#xC740; 1 &#xD615; &#xCF5C;&#xB77C;&#xAC90;&#xC744; &#xAD50;&#xCC28; &#xD558;&#xB294; &#xBAA9;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xAC00;&#xAD50; &#xACFC;&#xC815; &#xBBF8;&#xD06C;&#xB860; &#xBC0F; &#xC11C;&#xBE0C; &#xB9C8;&#xC774;&#xD06C;&#xB860; &#xD06C;&#xAE30; &#xC2A4;&#xCF00;&#xC77C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xC0DD;&#xC131;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC7A5;&#xBBF8; &#xBCB5;&#xACE8; diisopropyl &#xC544;&#xBBFC; &#xC720;&#xB3C4;&#xCCB4; &#xD558;&#xB098;&#xC758; &#xBD84;&#xC790;, &#xBC18;&#xC751; &#xC18D;&#xB3C4; &#xB860;&#xC744; &#xAC10;&#xC18C; &#xD558; &#xACE0; &#xAC00;&#xAD50;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD6A8;&#xC728;&#xC131;&#xC744; &#xD074;&#xB798;&#xC2DD; photoactivator &#xBC0F; co-initiator &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC744; &#xACB0;&#xD569; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xD30C;&#xC0DD; &#xC7A5;&#xBBF8; &#xBCB5;&#xACE8; &#xD63C;&#xC790;&#xB294; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC778; &#xBC18;&#xBA74; &#xCF5C;&#xB77C;&#xAC90;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC548;&#xC815; &#xB41C; &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC5D0; &#xC131;&#xACF5; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC720;&#xC5F0;&#xD55C; diamine &#xBC27;&#xC904;&#xC73C;&#xB85C; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB41C; benzophenone dimer &#xD569;&#xC131;&#xB3C4; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC774; &#xD65C;&#xC131; &#xC81C; &#xB450; photochemically &#xBC18;&#xC751;&#xC131; &#xADF8;&#xB8F9; &#xBC0F; &#xC18C; &#xD608; &#xCCAD; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC; &#xBC0F; &#xD615;&#xD0DC; &#xC548;&#xC815;&#xC801;&#xC774; &#xACE0; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; Type 1 &#xCF5C;&#xB77C;&#xAC90; &#xAD50;&#xCC28;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778;. &#xC774; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xC804;&#xD1B5;&#xC801;&#xC778; benzophenone &#xAC10;&#xAD11; &#xD558; &#xC5EC; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xAD50;&#xAC00; &#xCE21;&#xBA74;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB354; &#xC720;&#xC5F0; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Photophysical &#xC18D;&#xC131; &#xD06C;&#xAC8C; &#xB2E4; &#xADF8; &#xC0C8;&#xC758; &#xBAA8;&#xC2B5;, &#xB0AE;&#xC740; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0; &#xD761;&#xC218; &#xBC34;&#xB4DC; (&#xBB3C;&#xC5D0; &#xB78C;&#xB2E4; &#xCD5C;&#xB300; &#xC57D; 370 nm)&#xACFC; &#xAD11;&#xBC94;&#xC704; &#xD55C;, benzophenone&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCFC; &#xC218; &#xBC29;&#xCD9C; &#xBC34;&#xB4DC; (&#xC57D; 500 nm &#xCD5C;&#xB300;). &#xD761;&#xC218; &#xB300;&#xC5ED;&#xC774; &#xB192;&#xC740; solvatochromic, &#xADF8;&#xAC83;&#xC740; &#xBC1C;&#xC0DD;, &#xC801;&#xC5B4;&#xB3C4; &#xBD80;&#xBD84;, &#xCDA9;&#xC804; &#xC804;&#xC1A1; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC81C;&#xC548; &#xC774;&#xB2E4;. &#xCF5C;&#xB77C;&#xAC90;&#xC740; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; photochemically, &#xAD50;&#xCC28; &#xC5B4;&#xB835;&#xB2E4; &#xACE0; &#xACB0;&#xACFC; &#xC5EC;&#xAE30;&#xB294; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xD65C;&#xC131; &#xC81C; &#xAD50;&#xAC00; &#xCF5C;&#xB77C;&#xAC90;&#xACFC; biomimetic &#xC870;&#xC9C1; &#xC7A5;&#xBE44;&#xC758; &#xB4DC; &#xB178; &#xBCF4; &#xC870;&#xB9BD; &#xB4F1; &#xC0DD;&#xBA85; &#xC758;&#xD559; &#xC5B4;&#xD50C;&#xB9AC;&#xCF00;&#xC774;&#xC158;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCD94;&#xAC00;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xB2E4;&#xB978; &#xD615;&#xD0DC;&#xC5D0; &#xC801;&#xD569; &#xD55C; &#xAC83; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xAC8C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; photoactivators &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; 3 &#xCC28;&#xC6D0; &#xBBF8;&#xD06C;&#xB860; &#xAD50;&#xAC00; &#xD765;&#xBD84;: &#xC18C; &#xD608; &#xCCAD; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC; &#xBC0F; 1 &#xD615; &#xCF5C;&#xB77C;&#xAC90;.

Se presenta la s&#xED;ntesis y caracterizaci&#xF3;n &#xF3;ptica de dos fotoactivadores nuevas y demostrar su uso para la excitaci&#xF3;n multifot&#xF3;nica en tres dimensiones de forma libre la fabricaci&#xF3;n de prote&#xED;nas. Estos reactivos se desarrollaron con el objetivo de la reticulaci&#xF3;n del col&#xE1;geno tipo 1. Este proceso de reticulaci&#xF3;n produce estructuras en la micra y escalas submicrom&#xE9;tricas tama&#xF1;o. Una rosa de bengala diisopropil derivado de amina combina el cl&#xE1;sico fotoactivador y sistema de co-iniciador en una mol&#xE9;cula, la reducci&#xF3;n de la cin&#xE9;tica de reacci&#xF3;n y aumentar la eficiencia de reticulaci&#xF3;n. Este derivado fue un &#xE9;xito en la producci&#xF3;n de estructuras estables de col&#xE1;geno, mientras que el rosa de bengala solo no fue efectivo. Un d&#xED;mero benzofenona conectado por una correa flexible de diamina se sintetiz&#xF3; tambi&#xE9;n. Este activador tiene dos grupos reactivos fotoqu&#xED;micamente y es altamente eficaz en la reticulaci&#xF3;n alb&#xFA;mina de suero bovino y col&#xE1;geno tipo 1 para formar estructuras estables y robustos. Este enfoque es m&#xE1;s flexible en t&#xE9;rminos de reticulaci&#xF3;n una variedad de prote&#xED;nas que por fotoqu&#xED;mica benzofenona tradicional. Las propiedades fotof&#xED;sicas variar considerablemente de la de benzofenona, con la aparici&#xF3;n de una nueva banda, una menor absorci&#xF3;n de energ&#xED;a (lambda max aproximadamente 370 nm en agua) y de banda ancha, las emisiones visibles (aproximadamente 500 nm m&#xE1;ximo). Esta banda de absorci&#xF3;n es altamente solvatocr&#xF3;mico, lo que sugiere que surge, por lo menos en parte, de una interacci&#xF3;n de transferencia de carga. Los col&#xE1;genos son t&#xED;picamente dif&#xED;ciles de reticular fotoqu&#xED;micamente, y los resultados aqu&#xED; sugieren que estos dos nuevos activadores ser&#xE1; adecuado para la reticulaci&#xF3;n de otras formas de col&#xE1;geno y prote&#xED;nas adicionales para aplicaciones biom&#xE9;dicas tales como el conjunto de novo de andamiaje de tejido biomim&#xE9;ticos.

Fotoactivadores de nuevas versiones de fotones Emocionado tridimensional submicr&#xF3;nicas La reticulaci&#xF3;n de prote&#xED;nas: alb&#xFA;mina de suero bovino y col&#xE1;geno tipo 1

Pyrolytic carbon (PYC) containing approximately 7 wt % silicon is used in most clinical mechanical heart valves where it has demonstrated a high level of blood compatibility. The Si, present as SiC, is included since it is believed to enhance durability. However, it has been suggested that SiC reduces PYC blood compatibility. In the present study, PYC valve leaflets were prepared with low, conventional, and high levels of Si. The in vitro responses of human platelets to these materials were then quantified. Platelet responses were consistent with previous reports: Adherent platelets were extremely well spread, closely followed submicron contours, and formed very few aggregates or microthrombi-like structures. No significant differences with respect to the Si concentrations were observed for platelets adherent per unit area and the numbers of thrombi-like structures. Some differences were observed with platelet morphologies and the material surface covered with platelets, although these did not vary consistently with respect to Si concentration. These results indicate that lowering (or raising) the Si alloy concentration in PYC over a reasonable range (0.54-13.5 wt % as examined here) is unlikely to improve or otherwise alter the in vivo blood compatibility of this important clinical material.

Platelet responses to silicon-alloyed pyrolytic carbons.

Transmission electron microscopy can be used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. In a transmission electron microscope (TEM), the image is created by passing an electron beam through a specimen with contrast generated by electron scattering from dense elements in the specimen. Viruses do not normally contain dense elements, so a negative stain that places dense heavy metal salts around the sample is added to create a dark border. To prepare a virus sample for a negative stain transmission electron microscopy, a virus suspension is applied to a TEM grid specimen support, which is a 3mm diameter fragile specimen screen coated with a few nanometers of plastic film. Then, deionized (dI) water rinses and a negative stain solution are applied to the grid. All infectious viruses must be handled in a biosafety cabinet (BSC) and many require a biocontainment laboratory environment. Staining viruses in biosafety levels (BSL) 3 and 4 is especially challenging because the support grids are small, fragile, and easily moved by air currents. In this study we evaluated a new device for negative staining viruses called mPrep/g capsule. It is a capsule that holds up to two TEM grids during all processing steps and for storage after staining is complete. This study reports that the mPrep/g capsule method is valid and effective to negative stain virus specimens, especially in high containment laboratory environments.

Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining.

Article	Year
New photoactivators for multiphoton excited three-dimensional submicron cross-linking of proteins: bovine serum albumin and type 1 collagen. Photochemistry and photobiology\| PubMed ID: 12194208	2002
Platelet responses to silicon-alloyed pyrolytic carbons. Journal of biomedical materials research. Part A\| PubMed ID: 17380499	2007
Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. Journal of virological methods\| PubMed ID: 27751950	2016

Steven L. Goodman

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