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Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

University of Alabama Huntsville

&#x535A;&#x58EB;&#x5B66;&#x4F4D;/doc toxin-antitoxin &#x64CD;&#x7EB5;&#x5B50;&#x7684;&#x8C03;&#x63A7;&#x6D89;&#x53CA;&#x6BD2;&#x7D20; Doc &#x4F5C;&#x4E3A;&#x516C;&#x53F8;&#x6216; derepressor &#x6839;&#x636E;&#x535A;&#x58EB;&#x548C; Doc&#xFF0C;&#x79F0;&#x4E3A;&#x6761;&#x4EF6;&#x4F9D;&#x4ECE;&#x73B0;&#x8C61;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x6BD4;&#x7387;&#x3002;&#x8FD9;&#x80CC;&#x540E;&#x7684;&#x673A;&#x5236;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x7684;&#x884C;&#x4E3A;&#x4E0D;&#x7406;&#x89E3;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x5C55;&#x793A;&#x5355;&#x4F53; Doc &#x4ECE;&#x4E8B;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7AD9;&#x70B9;&#x4E0A;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x535A;&#x58EB;&#x5B66;&#x4F4D;&#x4E8C;&#x805A;&#x4F53;&#x3002;Doc &#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x672C;&#x8D28;&#x4E0A;&#x65E0;&#x5E8F; C &#x7EC8;&#x7AEF;&#x9886;&#x57DF;&#x7684;&#x535A;&#x58EB;&#x5B66;&#x4F4D;&#x7ED3;&#x6784;&#x53CA;&#x5176; N &#x672B;&#x7AEF; DNA &#x7ED3;&#x5408;&#x57DF;&#xFF0C;&#x8BF4;&#x660E;&#x53D8;&#x6784;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x7D0A;&#x4E71;&#x548C;&#x6781;&#x4E0D;&#x7A33;&#x5B9A;&#x7684;&#x57DF;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x8026;&#x5408;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x53D8;&#x6784;&#x6548;&#x5E94;&#x8FD8;&#x60C5;&#x4FA3; Doc &#x4E2D;&#x7684;&#x548C;&#x8F6C;&#x5F55;&#x6761;&#x4EF6;&#x89C4;&#x7BA1;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B9;&#x5F0F;&#xFF0C;&#x66F4;&#x9AD8;&#x6C34;&#x5E73;&#x7684; Doc &#x62E7;&#x7D27;&#x7A0B;&#x5EA6;&#x4E0A;&#x79EF;&#x7D2F;&#x7684;&#x6BD2;&#x7D20;&#x5728;&#x89E6;&#x53D1;&#x751F;&#x4EA7;&#x7684;&#x535A;&#x58EB;&#x5B66;&#x4F4D;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x62B5;&#x6D88;&#x5176;&#x884C;&#x52A8;&#x9547;&#x538B;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x4E3A;&#x4E86;&#x89E3;&#x6761;&#x4EF6;&#x5408;&#x4F5C;&#x8C03;&#x63A7;&#x7684;&#x5178;&#x578B;&#x7684; toxin-antitoxin &#x6A21;&#x5757;&#x7684;&#x8F6C;&#x5F55;&#x673A;&#x5236;&#x5960;&#x5B9A;&#x4E86;&#x57FA;&#x7840;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x6A21;&#x5F0F;&#x53EF;&#x80FD;&#x9002;&#x7528;&#x4E8E;&#x5176;&#x4ED6;&#x751F;&#x7269;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7684;&#x89C4;&#x7BA1;&#x3002;

Allostery &#x548C;&#x5185;&#x5728;&#x969C;&#x788D;&#x6761;&#x4EF6;&#x4F9D;&#x4ECE;&#x7684;&#x8C03;&#x89E3;&#x8F6C;&#x5F55;&#x8C03;&#x63A7;&#x3002;

Regulation of the phd/doc toxin-antitoxin operon involves the toxin Doc as co- or derepressor depending on the ratio between Phd and Doc, a phenomenon known as conditional cooperativity. The mechanism underlying this observed behavior is not understood. Here we show that monomeric Doc engages two Phd dimers on two unrelated binding sites. The binding of Doc to the intrinsically disordered C-terminal domain of Phd structures its N-terminal DNA-binding domain, illustrating allosteric coupling between highly disordered and highly unstable domains. This allosteric effect also couples Doc neutralization to the conditional regulation of transcription. In this way, higher levels of Doc tighten repression up to a point where the accumulation of toxin triggers the production of Phd to counteract its action. Our experiments provide the basis for understanding the mechanism of conditional cooperative regulation of transcription typical of toxin-antitoxin modules. This model may be applicable for the regulation of other biological systems.

Allostery and intrinsic disorder mediate transcription regulation by conditional cooperativity.

R&eacute;gulation de l&#39;op&eacute;ron de toxine phd/doc implique la toxine Doc comme co - ou derepressor selon le ratio entre Phd et Doc, un ph&eacute;nom&egrave;ne appel&eacute; coop&eacute;rativit&eacute; conditionnelle. Le m&eacute;canisme sous-jacent &agrave; ce observ&eacute; le comportement n&#39;est pas comprise. Nous d&eacute;montrons que Doc monom&egrave;re engage deux dim&egrave;res de doctorat sur les deux sites de fixation non apparent&eacute;s. La liaison du Doc au domaine C-terminal intrins&egrave;quement d&eacute;sordonn&eacute; de doctorat structures son domaine N-terminal liaison &agrave; l&#39;ADN, qui illustre le couplage allost&eacute;rique entre domaines hautement d&eacute;sordonn&eacute;es et tr&egrave;s instables. Cet effet allost&eacute;rique couples aussi neutralisation de la Doc pour la r&eacute;gulation conditionnelle de la transcription. De cette fa&ccedil;on, des niveaux plus &eacute;lev&eacute;s de Doc serrer la r&eacute;pression jusqu&#39;&agrave; un point o&ugrave; l&#39;accumulation de toxines d&eacute;clenche la production de Phd de contrecarrer son action. Nos exp&eacute;riences fournissent la base pour comprendre le m&eacute;canisme de r&eacute;gulation de coop&eacute;ration conditionnelle de transcription typique des modules de toxine. Ce mod&egrave;le peut s&#39;appliquer pour le r&egrave;glement des autres syst&egrave;mes biologiques.

Allost&eacute;rie et d&eacute;sordre intrins&egrave;que m&eacute;dient la r&eacute;gulation de la transcription de coop&eacute;rativit&eacute; conditionnelle.

Verordnung &uuml;ber die Phd/Doc-Toxin-antitoxin-Operon umfasst das Toxin Doc als co- oder Derepressor je nach dem Verh&auml;ltnis zwischen Phd und Doc, ein Ph&auml;nomen bekannt als bedingte Kooperativit&auml;t. Der Mechanismus dahinter beobachtet, Verhalten nicht verstanden wird. Hier zeigen wir, dass Monomer Doc zwei Phd-Dimere auf zwei unabh&auml;ngigen Bindungsstellen engagiert. Die Bindung der Doc auf die intrinsisch ungeordneten C-terminalen Dom&auml;ne des Phd Strukturen seiner N-terminale DNA-bindenden Dom&auml;ne zur Veranschaulichung allosterischer Kopplung zwischen Dom&auml;nen stark ungeordneten und sehr instabil. Diese allosterischer Effekt Paare auch Doc Neutralisierung der bedingten Verordnung der Transkription. Auf diese Weise anziehen h&ouml;here Doc Unterdr&uuml;ckung bis zu einem Punkt, wo die Anh&auml;ufung von Toxin die Promotion ihres Handelns entgegenzuwirken ausl&ouml;st. Unsere Experimente bilden die Grundlage f&uuml;r das Verst&auml;ndnis des Mechanismus der bedingte kooperativer Regulierung der Transkription, die typisch f&uuml;r Toxin-antitoxin Module. Dieses Modell kann f&uuml;r die Regulierung von anderen biologischen Systemen anwendbar sein.

Allostery und intrinsische Unordnung Transkription Verordnung durch bedingte Kooperativit&auml;t zu vermitteln.

Regolamento dell&#39;operone toxin-antitoxin phd/doc coinvolge la tossina Doc come co - o derepressor a seconda del rapporto tra Phd e Doc, un fenomeno noto come cooperativit&agrave; condizionale. Il meccanismo alla base di questo osservato il comportamento non &egrave; compreso. Qui vi mostriamo che Doc monomerico coinvolge due dimeri Phd su due siti di legame non correlate. L&#39;associazione di Doc al dominio C-terminale intrinsecamente disordinato di Phd strutture suo dominio N-terminale del DNA-binding, illustrando allosterico accoppiamento tra domini altamente disordinati e altamente instabili. Questo effetto allosterico anche coppie neutralizzazione Doc per il condizionale regolazione della trascrizione. In questo modo, livelli pi&ugrave; elevati di Doc stringere repressione fino a un punto dove l&#39;accumulo di tossine innesca la produzione di Phd per contrastare la sua azione. Nostri esperimenti forniscono la base per la comprensione del meccanismo di regolazione cooperativa condizionale della trascrizione tipica dei moduli toxin-antitoxin. Questo modello pu&ograve; essere applicabile per la regolazione degli altri sistemi biologici.

Allosteria e disordine intrinseco mediare regolamento trascrizione di cooperativit&agrave; condizionale.

&#x898F;&#x5236; phd/doc &#x306E;&#x89E3;&#x6BD2;&#x30AA;&#x30DA;&#x30ED;&#x30F3;&#x306E; co - &#x307E;&#x305F;&#x306F; derepressor &#x535A;&#x58EB;&#x3068; Doc &#x306F;&#x3001;&#x6761;&#x4EF6;&#x4ED8;&#x304D;&#x306E;&#x5354;&#x540C;&#x6027;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x77E5;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x73FE;&#x8C61;&#x306E;&#x6BD4;&#x7387;&#x306B;&#x5FDC;&#x3058;&#x3066;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x6BD2;&#x7D20; Doc &#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x306F;&#x3001;&#x52D5;&#x4F5C;&#x304C;&#x7406;&#x89E3;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x5358;&#x91CF;&#x4F53; Doc 2 &#x3064;&#x306E;&#x535A;&#x58EB;&#x8AB2;&#x7A0B;&#x30C0;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x306E; 2 &#x3064;&#x306E;&#x7121;&#x95A2;&#x4FC2;&#x306A;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x3092;&#x5F93;&#x4E8B;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;Doc &#x306E; Phd &#x306E;&#x5929;&#x7136;&#x5909;&#x6027;&#x306E; C &#x672B;&#x7AEF;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3078;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x306F;&#x305D;&#x306E; N &#x672B;&#x7AEF; DNA &#x7D50;&#x5408;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3; &#x30A2;&#x30ED;&#x30B9;&#x30C6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF; &#x30AB;&#x30C3;&#x30D7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x9AD8;&#x7121;&#x79E9;&#x5E8F;&#x5316;&#x3068;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x4E0D;&#x5B89;&#x5B9A;&#x306A;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x69CB;&#x9020;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30ED;&#x30B9;&#x30C6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x52B9;&#x679C;&#x306F;&#x307E;&#x305F;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x6761;&#x4EF6;&#x4ED8;&#x304D;&#x898F;&#x5247;&#x3078;&#x306E; Doc &#x4E2D;&#x548C;&#x3092;&#x30AB;&#x30C3;&#x30D7;&#x30EB;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3067;&#x306F;&#x3001;Doc &#x306E;&#x30CF;&#x30A4;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3069;&#x3053;&#x305D;&#x306E;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x6253;&#x3061;&#x6D88;&#x3059;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x535A;&#x58EB;&#x306E;&#x751F;&#x7523;&#x6BD2;&#x7D20;&#x306E;&#x84C4;&#x7A4D;&#x3092;&#x30C8;&#x30EA;&#x30AC;&#x30FC; &#x30DD;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C8;&#x307E;&#x3067;&#x6291;&#x5727;&#x3092;&#x7DE0;&#x3081;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x306F;&#x3001;&#x8EE2;&#x5199;&#x89E3;&#x6BD2;&#x30E2;&#x30B8;&#x30E5;&#x30FC;&#x30EB;&#x306E;&#x5178;&#x578B;&#x7684;&#x306A;&#x6761;&#x4EF6;&#x4ED8;&#x304D;&#x5354;&#x8ABF;&#x5236;&#x5FA1;&#x306E;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x3092;&#x7406;&#x89E3;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x3001;&#x57FA;&#x790E;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x306F;&#x4ED6;&#x306E;&#x751F;&#x7269;&#x7CFB;&#x306E;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x9069;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30A2;&#x30ED;&#x30B9;&#x30C6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x3068;&#x672C;&#x8CEA;&#x7684;&#x306A;&#x969C;&#x5BB3;&#x8EE2;&#x5199;&#x5236;&#x5FA1;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x6761;&#x4EF6;&#x4ED8;&#x304D;&#x5354;&#x540C;&#x6027;&#x3092;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xBC15;&#xC0AC;/doc toxin-antitoxin &#xC624; &#xD398;&#xB860;&#xC758; &#xADDC;&#xC81C; &#xACF5;&#xB3D9; &#xB610;&#xB294; &#xBC15;&#xC0AC; &#xD559;&#xC704;&#xC640; Doc, &#xC870;&#xAC74;&#xBD80; cooperativity&#xB85C; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4; &#xD604;&#xC0C1; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xBE44;&#xC728;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; derepressor Doc &#xB3C5; &#xC18C;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD55C;&#xB2E4;. &#xC774; &#xAE30;&#xBCF8; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998; &#xAD00;&#xCC30; &#xD589;&#xB3D9; &#xC774;&#xD574; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; monomeric Doc &#xB450; &#xC5C6;&#xB294; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xBC15;&#xC0AC; &#xD559;&#xC704; &#xC774;&#xD569;&#xCCB4; &#xC885;&#xC0AC; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBC15;&#xC0AC; &#xACFC;&#xC815;&#xC758; &#xBCF8;&#xC9C8;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBB34;&#xC9C8;&#xC11C; C &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC73C;&#xB85C; Doc&#xC758; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xBB34;&#xC9C8;&#xC11C; &#xD558; &#xACE0; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xBD88;&#xC548; &#xC815;&#xD55C; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xAC04;&#xC758; allosteric &#xACB0;&#xD569;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC8FC;&#xB294; N &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; DNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;. &#xC774; allosteric &#xD6A8;&#xACFC; &#xB610;&#xD55C; &#xC804;&#xC0AC;&#xC758; &#xC870;&#xAC74;&#xBD80; &#xADDC;&#xCE59;&#xC5D0; Doc &#xC911;&#xD654; &#xCEE4;&#xD50C;. &#xC774; &#xBC29;&#xBC95;&#xC73C;&#xB85C; &#xC758;&#xC0AC;&#xC758; &#xC0C1;&#xBD80; &#xC5B4;&#xB514; &#xB3C5; &#xC18C;&#xC758; &#xCD95;&#xC801; &#xBC15;&#xC0AC;&#xB294; &#xC911;&#xD654;&#xC758; &#xC0DD;&#xC0B0; &#xC720;&#xBC1C; &#xD558;&#xB294; &#xC2DC;&#xC810;&#xAE4C;&#xC9C0; &#xC5B5;&#xC555;&#xC744; &#xC870;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC2E4;&#xD5D8; toxin-antitoxin &#xBAA8;&#xB4C8;&#xC758; &#xC804;&#xD615;&#xC801;&#xC778; &#xC804;&#xC0AC;&#xC758; &#xC870;&#xAC74;&#xBD80; &#xD611;&#xB825; &#xADDC;&#xC81C;&#xC758; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; &#xC774;&#xD574; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xAE30;&#xCD08;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBAA8;&#xB378;&#xC740; &#xB2E4;&#xB978; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xD559;&#xC801; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC758; &#xADDC;&#xC81C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC801;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Allostery &#xBC0F; &#xB0B4;&#xC7A5; &#xC7A5;&#xC560; &#xC870;&#xAC74;&#xBD80; cooperativity &#xC5EC; &#xC804;&#xC0AC; &#xB808; &#xADE4; &#xB808;&#xC774; &#xC158;&#xC744; &#xC911;&#xC7AC;.

Reglamento del operon phd/doc toxin-antitoxin implica la toxina Doc como co - o derepressor dependiendo de la relaci&oacute;n entre doctorado y Doc, un fen&oacute;meno conocido como cooperatividad condicional. El mecanismo subyacente observado comportamiento no se entiende. Aqu&iacute; mostramos que Doc monom&eacute;rica involucra dos d&iacute;meros de Phd en dos sitios de uni&oacute;n sin relaci&oacute;n. La Uni&oacute;n de Doc el dominio c-terminal intr&iacute;nsecamente desordenadas de doctorado estructuras su dominio N-terminal Uni&oacute;n al ADN, ilustrando alost&eacute;rico acoplamiento entre dominios muy desordenados y altamente inestables. Este efecto alost&eacute;rico tambi&eacute;n parejas neutralizaci&oacute;n Doc a la condicional regulaci&oacute;n de la transcripci&oacute;n. De esta manera, niveles m&aacute;s altos de Doc apriete represi&oacute;n hasta un punto donde la acumulaci&oacute;n de la toxina activa la producci&oacute;n de doctorado para contrarrestar su acci&oacute;n. Nuestros experimentos proporcionan la base para comprender el mecanismo de regulaci&oacute;n cooperativa condicional de transcripci&oacute;n t&iacute;pico de m&oacute;dulos de toxin-antitoxin. Este modelo puede ser aplicable para la regulaci&oacute;n de otros sistemas biol&oacute;gicos.

Sreeram Balasubramanian

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