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High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors 

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

University of Florida

&#x6211;&#x4EEC;&#x5206;&#x6790;&#x4E86;&#x8036;&#x6C0F;&#x80BA;&#x5B62;&#x5B50;&#x4ECE;&#x8461;&#x8404;&#x7259;&#x53D7;&#x635F;&#x60A3;&#x8005; PCP &#x5728;&#x5185;&#x90E8;&#x8F6C;&#x5F55;&#x7684;&#x95F4;&#x9694; &#xFF08;ITS&#xFF09; &#x5730;&#x533A;&#x7684;&#x6838; rRNA &#x64CD;&#x7EB5;&#x5B50;&#x548C;&#x4E8C; (&#x5BF9;&#x6297; 5-HT) &#x5408;&#x6210;&#x9176;&#x57FA;&#x56E0;&#x95F4;&#x5206;&#x79BB;&#x682A;&#x7684;&#x9057;&#x4F20;&#x53D8;&#x5F02;&#x3002;43 &#x96C6;&#x6240;&#x5BF9;&#x5E94;&#x7684; PCP 42 &#x60A3;&#x8005;&#x80BA;&#x90E8;&#x5206;&#x6CCC;&#x7269;&#x8FDB;&#x884C;&#x4E86;&#x7814;&#x7A76;&#x3002;&#x4EBA;&#x53E3;&#x3001; &#x514D;&#x75AB;&#x5B66;&#x3001; &#x548C;&#x4E34;&#x5E8A;&#x6570;&#x636E;&#x88AB;&#x4ECE;&#x6240;&#x6709;&#x7684;&#x75C5;&#x4EBA;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x7ED3;&#x5408; ITS1 &#x548C; ITS2 &#x8FD9;&#x4E24;&#x4E2A;&#x533A;&#x57DF;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#x4F53;&#x80B2;&#x8036;&#x6C0F;&#x7684; 17 &#x79CD;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x7C7B;&#x578B;&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x4E24;&#x4F4D;&#x662F;&#x65B0;&#x7C7B;&#x578B; &#xFF08;Pb&#x3001; Pe&#xFF09;&#x3002;&#x56DB;&#x79CD;&#x6700;&#x666E;&#x904D;&#x7684;&#x7C7B;&#x578B;&#x662F; Eg (23.3%)&#x3001; Eb &#x548C; Ne &#xFF08;11.6%&#xFF09; &#x548C; Bi (9.3%)&#x3002;&#x5728;&#x68C0;&#x6D4B;&#x5230;&#x5355;&#x4E2A;&#x7C7B;&#x578B;&#x7684;&#x6837;&#x54C1;&#x7684; 95.3%&#x548C; 4.7%&#x4E86;&#x6DF7;&#x5408;&#x611F;&#x67D3;&#x4E09;&#x79CD;&#x4E0D;&#x540C;&#x5176;&#x7C7B;&#x578B;&#x3002;&#x5BF9;&#x6297; 5-HT &#x7A81;&#x53D8;&#x5728;&#x573A;&#x4E2D; 17 (46%)&#xFF0C;&#x548C; tn &#x91CE;&#x6BD2;&#x5728;&#x573A;&#x4E2D;&#x7684; 37 &#x682A; 20 (54%)&#x3002;ITS &#x548C;&#x5BF9;&#x6297; 5-HT &#x7C7B;&#x578B;&#x4E4B;&#x95F4;&#x5BF9;&#x6297; 5-HT &#x7C7B;&#x578B;&#x548C;&#x6CBB;&#x7597;&#x6216;&#x5BF9;&#x53CD; PCP &#x6CBB;&#x7597;&#x7684;&#x53CD;&#x5E94;&#x4EE5;&#x53CA;&#x4E4B;&#x95F4;&#x627E;&#x5230;&#x6CA1;&#x6709;&#x5173;&#x8054;&#x3002;&#x7C7B;&#x578B; Ne &#x63D0;&#x51FA;&#x4E0E;&#x6D88;&#x6781;&#x56DE;&#x5E94;&#x53CD; PCP &#x6CBB;&#x7597;&#x534F;&#x4F1A; (P &lt; 0.001) &#x548C;&#x6B7B;&#x4EA1;&#x524D;&#x4E94;&#x6C2F;&#x82EF;&#x915A;&#x8BCA;&#x65AD;&#x540E;&#x7684; 120 &#x5929; &#xFF08;P = 0.025&#xFF09;&#x3002;&#x7C7B;&#x578B; Eb &#x662F;&#x5927;&#x5927;&#x7684;&#x513F;&#x7AE5;&#x6BD4;&#x6210;&#x4EBA;&#x66F4;&#x5E38;&#x89C1; (P = 0.001)&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x8868;&#x660E;&#x6CBB;&#x7597;&#x5931;&#x8D25;&#x3001; &#x574F;&#x4E34;&#x5E8A;&#x6210;&#x679C;&#x4E0E;&#x7AE5;&#x5E74;&#x7684;&#x5177;&#x4F53; ITS &#x57FA;&#x56E0;&#x578B;&#x7684;&#x5173;&#x8054;&#x3002;

&#x8036;&#x6C0F;&#x80BA;&#x5B62;&#x5B50;&#x5728;&#x8461;&#x8404;&#x7259;&#x514D;&#x75AB;&#x635F;&#x5BB3;&#x75C5;&#x4EBA;&#xFF1A; &#x5177;&#x4F53; ITS &#x57FA;&#x56E0;&#x578B;&#x6CBB;&#x7597;&#x5931;&#x8D25;&#x3001; &#x574F;&#x4E34;&#x5E8A;&#x6210;&#x679C;&#x4E0E;&#x7AE5;&#x5E74;&#x7684;&#x534F;&#x4F1A;&#x3002;

We analyzed the genetic variation among isolates of Pneumocystis jiroveci from Portuguese immunocompromised patients with PCP at the internal transcribed spacer (ITS) regions of the nuclear rRNA operon and at the dihydropteroate synthase (DHPS) gene. Pulmonary secretions from 42 patients with PCP corresponding to 43 episodes were studied. Demographic, immunological, and clinical data were obtained from all patients. By combining the two regions ITS1 and ITS2, we found 17 different ITS types of P. jiroveci, two of them were new types (Pb and Pe). The four most prevalent ITS types were Eg (23.3%), Eb and Ne (11.6% each), and Bi (9.3%). A single type was detected in 95.3% of the samples and 4.7% had mixed infections with three different ITS types. DHPS mutants were present in 17 (46%), and the wildtype was present in 20 (54%) of 37 isolates. No association was found between ITS and DHPS types and between DHPS types and therapy or response to anti-PCP treatment. Type Ne presented an association with negative response to anti-PCP treatment (P<0.001) and with death before 120 days after PCP diagnosis (P=0.025). Type Eb was significantly more common in children than in adults (P=0.001). Our data suggest an association of specific ITS genotypes with treatment failure, bad clinical outcome and childhood.

Pneumocystis jiroveci in Portuguese immunocompromised patients: association of specific ITS genotypes with treatment failure, bad clinical outcome and childhood.

Nous avons analys&eacute; la variation g&eacute;n&eacute;tique entre les isolats de pneumonie &agrave; Pneumocystis jiroveci chez des patients immunod&eacute;prim&eacute;s portugais avec PCP dans les r&eacute;gions de l&#39;espaceur interne transcrit (ITS) de l&#39;op&eacute;ron ARNr nucl&eacute;aire et dans le g&egrave;ne de la DIHYDROPT&Eacute;ROATE synthase (DHPS). Les auteurs ont &eacute;tudi&eacute; les s&eacute;cr&eacute;tions pulmonaires de 42 patients atteints de PCP correspondant &agrave; 43 &eacute;pisodes. Donn&eacute;es d&eacute;mographiques, cliniques et immunologiques proviennent de tous les patients. En combinant les deux r&eacute;gions ITS1 et ITS2, nous avons trouv&eacute; 17 diff&eacute;rents types d&#39;ITS de P. jiroveci, deux d&#39;entre eux &eacute;taient nouveaux types (Pb et Pe). Les quatre types d&#39;ITS plus fr&eacute;quents ont &eacute;t&eacute; Eg (23,3 %), Eb et nord-est (11,6 %) et Bi (9,3 %). Un seul type a &eacute;t&eacute; d&eacute;tect&eacute; dans 95,3 % des &eacute;chantillons et 4,7 % avaient m&eacute;lang&eacute; les infections avec trois diff&eacute;rentes ses types. DHPS mutants &eacute;taient pr&eacute;sents dans 17 (46 %), et le type sauvage est pr&eacute;sente dans 20 (54 %) des 37 isolats. Aucun lien n&#39;a &eacute;t&eacute; trouv&eacute; entre types d&#39;ITS et DHPS et entre types DHPS et de th&eacute;rapie ou de la r&eacute;ponse au traitement anti-PCP. Type nord-est a pr&eacute;sent&eacute; une association avec r&eacute;ponse n&eacute;gative &agrave; un traitement anti-PCP (P &lt; 0,001) et avec la mort de 120 jours apr&egrave;s le diagnostic de la PCP (P = 0,025). Type Eb &eacute;tait significativement plus fr&eacute;quente chez les enfants que chez les adultes (P = 0,001). Nos r&eacute;sultats sugg&egrave;rent une association des g&eacute;notypes sp&eacute;cifiques de STI avec l&#39;&eacute;chec du traitement, de mauvais r&eacute;sultats cliniques et de l&#39;enfance.

Pneumonie &agrave; Pneumocystis jiroveci chez les malades immunod&eacute;prim&eacute;s portugais : association des g&eacute;notypes sp&eacute;cifiques de STI avec l&#39;&eacute;chec du traitement, de mauvais r&eacute;sultats cliniques et de l&#39;enfance.

Pneumocystis-carinii in Portugiesisch immungeschw&#xE4;chten Patienten: Verband der spezifischen ITS-Genotypen mit Therapieversagen, schlechte klinische Ergebnis und Kindheit.

Abbiamo analizzato la variazione genetica tra isolati di Pneumocystis jiroveci portoghese nei pazienti immunocompromessi con PCP presso le regioni interne trascritto distanziale (ITS) dell&#39;operone rRNA nucleari e del gene di synthase (DHP) dihydropteroate. Sono state studiate le secrezioni polmonari da 42 pazienti con PCP corrispondente a 43 episodi. Dati demografici, immunologici e clinici sono stati ottenuti da tutti i pazienti. Combinando le due regioni ITS1 e ITS2, abbiamo trovato 17 tipologie ITS p. jiroveci, due di loro erano nuovi tipi (Pb e Pe). I quattro tipi ITS pi&ugrave; diffusi erano Eg (23,3%), Eb e Ne (11,6% ciascuno) e Bi (9,3%). Un unico tipo &egrave; stato rilevato 95,3% dei campioni e il 4,7% aveva infezioni con tre diversi suoi tipi misti. Mutanti DHP erano presenti 17 (46%), e il wildtype era presente in 20 (54%) di 37 isolati. Nessuna associazione &egrave; stata trovata tra i tipi di ITS e DHP e DHP tipi e terapia o risposta al trattamento con anti-PCP. Tipo Ne ha presentato un&#39;associazione con la risposta negativa al trattamento anti-PCP (P &lt; 0,001) e con la morte prima di 120 giorni dopo la diagnosi di PCP (P = 0.025). Tipo Eb era significativamente pi&ugrave; comune nei bambini che negli adulti (P = 0,001). I nostri dati suggeriscono un&#39;associazione specifica ITS genotipi con trattamento guasto, cattivo esito clinico e infanzia.

Polmonite da Pneumocystis jiroveci in pazienti immunocompromessi portoghesi: associazione di specifici genotipi ITS con trattamento guasto, cattivo esito clinico e infanzia.

&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30E2;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C1;&#x30B9; &#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30E2;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C1;&#x30B9; PCP &#x30B8;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x30D7;&#x30C6;&#x30ED;&#x30A4;&#x30F3;&#x9178;&#x5408;&#x6210;&#x9175;&#x7D20; &#xFF08;DHPS&#xFF09; &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3068;&#x6838;&#x306E; rRNA &#x30AA;&#x30DA;&#x30ED;&#x30F3;&#x306E;&#x5185;&#x90E8;&#x8EE2;&#x5199;&#x30B9;&#x30DA;&#x30FC;&#x30B5;&#x30FC; (ITS) &#x5730;&#x57DF;&#x3067;&#x30DD;&#x30EB;&#x30C8;&#x30AC;&#x30EB;&#x514D;&#x75AB;&#x4E0D;&#x5168;&#x60A3;&#x8005;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x5206;&#x96E2;&#x682A;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x7684;&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x5206;&#x6790;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;43 &#x306E;&#x30A8;&#x30D4;&#x30BD;&#x30FC;&#x30C9;&#x306B;&#x5BFE;&#x5FDC;&#x3059;&#x308B; PCP 42 &#x60A3;&#x8005;&#x304B;&#x3089;&#x80BA;&#x306E;&#x5206;&#x6CCC;&#x7269;&#x3092;&#x8ABF;&#x3079;&#x305F;&#x3002;&#x4EBA;&#x53E3;&#x7D71;&#x8A08;&#x5B66;&#x3001;&#x514D;&#x75AB;&#x5B66;&#x3001;&#x81E8;&#x5E8A;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x60A3;&#x8005;&#x304B;&#x3089;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;2 &#x3064;&#x306E;&#x9818;&#x57DF; ITS1 &#x3068; ITS2 &#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3067;&#x3001;&#x6211;&#x3005; 17 &#x7A2E;&#x985E; ITS P. &#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30E2;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C1;&#x30B9;&#x306E;&#x767A;&#x898B;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306E; 2 &#x3064;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x7A2E;&#x985E; &#xFF08;Pb&#x3001;Pe&#xFF09; &#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x3002;4 &#x3064;&#x306E;&#x6700;&#x3082;&#x666E;&#x53CA;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B; ITS &#x30BF;&#x30A4;&#x30D7; Eg (23.3%) &#x3044;&#x305F; Eb &#x3068; Ne &#xFF08;11.6 &#xFF05; &#x5404;&#xFF09;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073; Bi (9.3%)&#x3002;1 &#x3064;&#x306E;&#x578B;&#x304C;&#x691C;&#x51FA;&#x3055;&#x308C;&#x305F; 95.3% &#x306E;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x3068; 4.7% &#x305D;&#x306E;&#x578B;&#x611F;&#x67D3;&#x75C7; 3 &#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x3092;&#x6DF7;&#x5408;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3002;DHPS &#x5909;&#x7570;&#x4F53; 17 &#xFF08;46 &#xFF05;&#xFF09; &#x5B58;&#x5728;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3057;&#x3001;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; 37 &#x83CC;&#x682A; 20 &#xFF08;54 &#xFF05;&#xFF09; &#x5B58;&#x5728;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3002;&#x5354;&#x4F1A;&#x3068; DHPS &#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x7642;&#x6CD5;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x53CD; PCP &#x6CBB;&#x7642;&#x3078;&#x306E;&#x5FDC;&#x7B54;&#x306E; ITS &#x3068; DHPS &#x578B;&#x9593;&#x898B;&#x3064;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x578B; Ne &#x63D0;&#x793A;&#x30A2;&#x30F3;&#x30C1; PCP &#x6CBB;&#x7642;&#x3078;&#x306E;&#x5426;&#x5B9A;&#x5FDC;&#x7B54;&#x306E;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051; (P &lt; 0.001&#xFF09; &#x3068;&#x6B7B;&#x306E; PCP &#x8A3A;&#x65AD;&#x5F8C; 120 &#x65E5;&#x9593;&#x306E;&#x524D;&#x306B; &#xFF08;P = 0.025)&#x3002;&#x578B; Eb &#x3044;&#x305F;&#x5927;&#x5E45;&#x3088;&#x308A;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306A;&#x5927;&#x4EBA;&#x3088;&#x308A;&#x5B50;&#x4F9B; (P = 0.001&#xFF09;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x6CBB;&#x7642;&#x5931;&#x6557;&#x3001;&#x60AA;&#x3044;&#x81E8;&#x5E8A;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;&#x5C0F;&#x5150;&#x3068;&#x306E; ITS &#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x578B;&#x306E;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3092;&#x304A;&#x52E7;&#x3081;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30DD;&#x30EB;&#x30C8;&#x30AC;&#x30EB;&#x306E;&#x514D;&#x75AB;&#x4E0D;&#x5168;&#x60A3;&#x8005;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30E2;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C1;&#x30B9; &#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30E2;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C1;&#x30B9;: &#x6CBB;&#x7642;&#x5931;&#x6557;&#x3001;&#x60AA;&#x3044;&#x81E8;&#x5E8A;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;&#x5C0F;&#x5150;&#x3068; ITS &#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x578B;&#x306E;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3002;

&#xC6B0;&#xB9AC; Pneumocystis jiroveci &#xC8FC;&#xCE58;&#xC758; dihydropteroate synthase (DHPS) &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC640; &#xD575; rRNA &#xC624; &#xD398;&#xB860;&#xC758; &#xB0B4;&#xBD80; &#xBCA0;&#xB080;&#xB41C; &#xC2A4;&#xD398;&#xC774;&#xC11C; (ITS) &#xC9C0;&#xC5ED;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xD3EC;&#xB974;&#xD22C;&#xAC08; immunocompromised &#xD658;&#xC790;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xACA9;&#xB9AC; &#xC911; &#xC720;&#xC804; &#xBCC0;&#xC774; &#xBD84;&#xC11D;. 43 &#xC5D0;&#xD53C;&#xC18C;&#xB4DC;&#xC5D0; &#xD574;&#xB2F9; &#xC8FC;&#xCE58;&#xC758; 42 &#xD658;&#xC790;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD3D0; &#xBD84; &#xBE44; &#xACF5;&#xBD80; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC778;&#xAD6C; &#xD1B5;&#xACC4; &#xD559;&#xC801;, &#xBA74;&#xC5ED;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xC784;&#xC0C1; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB294; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xD658;&#xC790;&#xC5D0; &#xAC8C; &#xC11C; &#xC5BB;&#xC740; &#xD588;&#xB2E4;. Its1&#xC640; ITS2 &#xB450; &#xC601;&#xC5ED;&#xC744; &#xACB0;&#xD569; &#xD558; &#xC5EC; &#xC6B0;&#xB9AC; 17 ITS&#xC758; &#xC885;&#xB958; P. jiroveci &#xBC1C;&#xACAC;, &#xADF8;&#xB4E4; &#xC911;&#xC758; 2 &#xC2E0;&#xD615; (Pb &#xBC0F; Pe). &#xAC00;&#xC7A5; &#xB110;&#xB9AC; &#xD37C;&#xC9C4; ITS &#xD615;&#xC2DD; 4 &#xAC1C; &#xC788;&#xC5C8;&#xB2E4; Eg (23.3%), Eb &#xBC0F; Ne (11.6% &#xAC01;), Bi (9.3%). &#xB2E8;&#xC77C; &#xD615;&#xC2DD;&#xC774; &#xBC1C;&#xACAC; &#xB41C; &#xC0D8;&#xD50C; &#xC911; 95.3%&#xC640; 4.7% &#xD63C;&#xD569; &#xD588;&#xB2E4; &#xC138; &#xAC00;&#xC9C0;&#xC640; &#xAC10;&#xC5FC;&#xC758; &#xC885;&#xB958;. DHPS &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; 17 (46%)&#xC5D0; &#xCC38;&#xC11D; &#xD588;&#xB2E4; &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0;&#xB294; wildtype 37 &#xACA9;&#xB9AC;&#xC758; 20 (54%)&#xC5D0; &#xC874;&#xC7AC; &#xD588;&#xB2E4;. DHPS &#xC720;&#xD615; &#xBC0F; &#xCE58;&#xB8CC; &#xB610;&#xB294; &#xC548;&#xD2F0;-&#xC8FC;&#xCE58;&#xC758; &#xCE58;&#xB8CC; &#xBC0F; ITS &#xBC0F; DHPS &#xD615;&#xC2DD; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD00; &#xBC1C;&#xACAC; &#xB410;&#xB2E4;. &#xD615;&#xC2DD; Ne &#xC81C;&#xC2DC; &#xC548;&#xD2F0; &#xC8FC;&#xCE58;&#xC758; &#xCE58;&#xB8CC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xC751;&#xB2F5; &#xC5F0;&#xAD00; (P &lt; 0.001)&#xC640; &#xC8FC;&#xCE58;&#xC758; &#xC9C4;&#xB2E8; &#xD6C4; 120 &#xC77C; &#xC804;&#xC5D0; &#xC8FD;&#xC74C; (P = 0.025). &#xD615;&#xC2DD; Eb&#xB294; &#xD06C;&#xAC8C; &#xC131;&#xC778; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xC544;&#xC774; &#xB4E4;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC778; (P = 0.001). &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB294; &#xCE58;&#xB8CC; &#xC2E4;&#xD328;, &#xB098;&#xC05C; &#xC784;&#xC0C1; &#xACB0;&#xACFC;&#xC640; &#xC5B4;&#xB9B0; &#xC2DC;&#xC808; &#xD2B9;&#xC815; ITS genotypes &#xD611;&#xD68C; &#xC81C;&#xC548;.

Pneumocystis jiroveci &#xD3EC;&#xB974;&#xD22C;&#xAC08;&#xC5B4; immunocompromised &#xD658;&#xC790;&#xC5D0;&#xC11C;: &#xCE58;&#xB8CC; &#xC2E4;&#xD328;, &#xB098;&#xC05C; &#xC784;&#xC0C1; &#xACB0;&#xACFC;&#xC640; &#xC5B4;&#xB9B0; &#xC2DC;&#xC808; &#xD2B9;&#xC815; ITS genotypes&#xC758; &#xD611;&#xD68C;.

Hemos analizado la variaci&oacute;n gen&eacute;tica entre aislamientos de Pneumocystis jiroveci de pacientes inmunocomprometidos portugu&eacute;s con PCP en las regiones de espaciador transcrito interno (ITS) del operon rRNA nuclear y en el gen de Dihidropteroato sintasa (DHPS). Se estudiaron las secreciones pulmonares de 42 pacientes con PCP correspondientes a 43 episodios. Se obtuvieron datos demogr&aacute;ficos, inmunol&oacute;gicos y cl&iacute;nicos de los pacientes. Mediante la combinaci&oacute;n de las dos regiones ITS1 e ITS2, encontramos 17 diferentes tipos ITS de p. jiroveci, dos de ellos eran nuevos tipos (Pb y Pe). Los cuatro tipos ITS m&aacute;s frecuentes fueron Eg (23,3%), Eb y Ne (11,6% cada uno) y Bi (9,3%). Se detect&oacute; un solo tipo de 95,3% de las muestras y 4,7% hab&iacute;an mezclado las infecciones con tres diferentes sus tipos. Mutantes DHPS estaban presentes en 17 (46%), y el wildtype estuvo presente en 20 (54%) de 37 aislados. No se encontr&oacute; asociaci&oacute;n entre tipos ITS y DHPS y entre tipos DHPS y terapia o respuesta al tratamiento anti-PCP. Tipo Ne present&oacute; una asociaci&oacute;n con respuesta negativa al tratamiento anti-PCP (P &lt; 0.001) y con la muerte antes de 120 d&iacute;as despu&eacute;s de la diagnosis de la PCP (P = 0. 025). Tipo Eb fue significativamente m&aacute;s frecuente en ni&ntilde;os que en adultos (P = 0,001). Nuestros datos sugieren una asociaci&oacute;n de genotipos espec&iacute;ficos de ITS con fracaso del tratamiento, la mala evoluci&oacute;n cl&iacute;nica y la infancia.

Neumon&iacute;a por Pneumocystis jiroveci en pacientes inmunocomprometidos Portugu&eacute;s: Asociaci&oacute;n de genotipos espec&iacute;ficos de ITS con fracaso del tratamiento, la mala evoluci&oacute;n cl&iacute;nica y la infancia.

&#x51B2;&#x7A81;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x5B58;&#x5728;&#x5BF9;&#x9020;&#x8840;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8840;&#x6E05;&#x578B; 2 &#xFF08;AAV2&#xFF09; &#x7684;&#x8F7D;&#x4F53;&#xFF0C;&#x5E76;&#x989D;&#x5916;&#x7684;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8840;&#x6E05;&#x578B;&#x8F7D;&#x4F53;&#x6709;&#x5C1A;&#x672A;&#x5F97;&#x5230;&#x9020;&#x8840;&#x5E72;/&#x7956;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x53CA;&#x5176;&#x6548;&#x679C;&#x7684;&#x8BC4;&#x4EF7;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BC4;&#x4F30;&#x5E38;&#x89C4;&#x3001; &#x5355;&#x7EDE;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8840;&#x6E05;&#x578B;&#x8F7D;&#x4F53;&#x901A;&#x8FC7;&#x539F;&#x59CB;&#x5C0F;&#x9F20;&#x9020;&#x8840;&#x5E72;/&#x7956;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4F53;&#x5916;&#x4EE5;&#x53CA;&#x4F53;&#x5185; 5 1 &#x7684;&#x6548;&#x679C;&#x3002;&#x5728;&#x4F7F;&#x7528; Sca1 + c &#x7684;&#x7956;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6D4B;&#x5B9A;-&#x5DE5;&#x5177;&#x5305; + &#x6797;-&#x9020;&#x8840;&#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;9%&#x7684;&#x8702;&#x7FA4;&#x611F;&#x67D3;&#x4E86; AAV1 &#x7684;&#x6587;&#x5316;&#x4E2D;&#x8868;&#x8FBE;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x3002;AAV1 &#x6DF7;&#x5408;&#x611F;&#x67D3;&#x4E0E;&#x81EA;&#x6211;&#x8865;&#x5145;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8F7D;&#x4F53;&#x643A;&#x5E26;&#x57FA;&#x56E0; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x86CB;&#x767D;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x78F7;&#x9178;&#x9176; (scAAV-TC-PTP) &#x589E;&#x52A0;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x6548;&#x7387;&#x63D0;&#x9AD8;&#x5230; 24%&#xFF0C;&#x8868;&#x660E;&#x75C5;&#x6BD2; secondstrand DNA &#x5408;&#x6210;&#x901F;&#x7387;&#x9650;&#x5236;&#x7684;&#x4E00;&#x6B65;&#x3002;&#x8FD9;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x8BC1;&#x5B9E;&#x4E86; scAAV &#x7684;&#x5A92;&#x4ECB;&#xFF0C;&#x7ED5;&#x8FC7;&#x8FD9;&#x4E00;&#x8981;&#x6C42;&#x7684;&#x4F7F;&#x7528;&#x3002;&#x5728;&#x9AA8;&#x9AD3;&#x79FB;&#x690D;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#x6D89;&#x53CA;&#x81F4;&#x6B7B;&#x635F;&#x4F24;&#x81EA;&#x4F53;&#x5C0F;&#x9F20;&#xFF0C;Sca1 + c-&#x5DE5;&#x5177;&#x5305; + &#x6797;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5408;&#x5E76;&#x4E0E; AAV1 + / scAAV-TC-PTP &#x5411;&#x91CF;&#x5206;&#x522B;&#x5BFC;&#x81F4;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE; (PB) &#x5916;&#x5468;&#x8840;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684; 7.5%&#x548C; 2-6 &#x4E2A;&#x6708; posttransplantation&#x3002;&#x5728;&#x4E8C;&#x6B21;&#x79FB;&#x690D;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x94C5;&#x7EC6;&#x80DE; 7%&#x548C; 3%(BM) &#x9AA8;&#x9AD3;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8868;&#x793A;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0; 6 &#x4E2A;&#x6708; posttransplantation&#x3002;&#x5927;&#x7EA6; 21%&#x7684; BM &#x6D3E;&#x751F;&#x7684;&#x6B96;&#x6C11;&#x5730;&#x6F5C;&#x4F0F;&#x7EC4;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x7684; DNA &#x5E8F;&#x5217;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x7EFC;&#x5408;&#x5F62;&#x5F0F;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x7684;&#x6587;&#x6863; AAV1 &#x662F;&#x8FC4;&#x4ECA;&#x6700;&#x6709;&#x6548;&#x8F7D;&#x4F53;&#x7684;&#x6C19;&#x6C14;&#x57FA;&#x5143;&#x5C0F;&#x9F20;&#x9020;&#x8840;&#x5E72;/&#x7956;&#x7EC6;&#x80DE;&#x3002;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x6D89;&#x53CA; scAAV &#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x548C;&#x9020;&#x8840;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x5E94;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x589E;&#x5F3A; AAV1 &#x8F7D;&#x4F53;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x8F7D;&#x4F53;&#x5728;&#x9020;&#x8840;&#x5E72;&#x7EC6;&#x80DE;&#x57FA;&#x56E0;&#x6CBB;&#x7597;&#x7684;&#x6700;&#x4F73;&#x5229;&#x7528;&#x5E94;&#x5177;&#x6709;&#x5F71;&#x54CD;&#x7684;&#x4F20;&#x5BFC;&#x7684;&#x6548;&#x7387;&#x3002;

&#x8BC4;&#x4EF7;&#x7684;&#x539F;&#x59CB;&#x5C0F;&#x9F20;&#x9020;&#x8840;&#x5E72;&#x3001; &#x7956;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x4F53;&#x5916;&#x548C;&#x4F53;&#x5185;&#x7684;&#x91CD;&#x7EC4;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8F7D;&#x4F53; serotypes 1 &#x5230; 5&#x3002;

Conflicting data exist on hematopoietic cell transduction by AAV serotype 2 (AAV2) vectors, and additional AAV serotype vectors have not been evaluated for their efficacy in hematopoietic stem/progenitor cell transduction. We evaluated the efficacy of conventional, single-stranded AAV serotype vectors 1 through 5 in primitive murine hematopoietic stem/progenitor cells in vitro as well as in vivo. In progenitor cell assays using Sca1+ c-kit+ Lin- hematopoietic cells, 9% of the colonies in cultures infected with AAV1 expressed the transgene. Coinfection of AAV1 with self-complementary AAV vectors carrying the gene for T cell protein tyrosine phosphatase (scAAV-TC-PTP) increased the transduction efficiency to 24%, indicating that viral secondstrand DNA synthesis is a rate-limiting step. This was further corroborated by the use of scAAV vectors, which bypass this requirement. In bone marrow transplantation studies involving lethally irradiated syngeneic mice, Sca1+ c-kit+ Lin- cells coinfected with AAV1 +/- scAAV-TC-PTP vectors led to transgene expression in 2 and 7.5% of peripheral blood (PB) cells, respectively, 6 months posttransplantation. In secondary transplantation experiments, 7% of PB cells and 3% of bone marrow (BM) cells expressed the transgene 6 months posttransplantation. Approximately 21% of BM-derived colonies harbored the proviral DNA sequences in integrated forms. These results document that AAV1 is thus far the most efficient vector in transducing primitive murine hematopoietic stem/progenitor cells. Further studies involving scAAV genomes and hematopoietic cell-specific promoters should further augment the transduction efficiency of AAV1 vectors, which should have implications in the optimal use of these vectors in hematopoietic stem cell gene therapy.

Evaluation of primitive murine hematopoietic stem and progenitor cell transduction in vitro and in vivo by recombinant adeno-associated virus vector serotypes 1 through 5.

Des donn&#xE9;es contradictoires existent sur la transduction de cellules h&#xE9;matopo&#xEF;&#xE9;tiques par AAV de s&#xE9;rotype 2 (AAV2) vecteurs, ainsi que d&#x26;#39;autres vecteurs AAV de s&#xE9;rotype n&#x26;#39;ont pas &#xE9;t&#xE9; &#xE9;valu&#xE9;s pour leur efficacit&#xE9; dans la transduction des cellules souches h&#xE9;matopo&#xEF;&#xE9;tiques / prog&#xE9;nitrices. Nous avons &#xE9;valu&#xE9; l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de classiques, simple brin vecteurs AAV de s&#xE9;rotype 1 &#xE0; 5 de primitifs murins h&#xE9;matopo&#xEF;&#xE9;tiques souches / prog&#xE9;nitrices des cellules in vitro ainsi que in vivo. Dans des essais utilisant des cellules prog&#xE9;nitrices SCA1 + c-kit + Lin-cellules h&#xE9;matopo&#xEF;&#xE9;tiques, 9% des colonies dans les cultures infect&#xE9;es par le AAV1 exprim&#xE9; le transg&#xE8;ne. Co-infection de AAV1 avec des vecteurs AAV auto-compl&#xE9;mentaires portant le g&#xE8;ne de la cellule T prot&#xE9;ine tyrosine phosphatase (scAAV-TC-PTP) a augment&#xE9; l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de transduction &#xE0; 24%, indiquant que la synth&#xE8;se d&#x26;#39;ADN viral secondstrand est une &#xE9;tape de limitation de vitesse. Ce fait a &#xE9;t&#xE9; corrobor&#xE9; par l&#x26;#39;utilisation de vecteurs, qui contournent scAAV cette exigence. Dans les &#xE9;tudes greffe de moelle osseuse impliquant irradi&#xE9;es de fa&#xE7;on l&#xE9;tale souris syng&#xE9;niques, SCA1 + c-kit + Lin-des cellules co-infect&#xE9;es par AAV1 + / - scAAV-TC-PTP vecteurs a conduit &#xE0; expression du transg&#xE8;ne dans le 2 et 7,5% de sang p&#xE9;riph&#xE9;rique (PB) des cellules, respectivement, 6 mois apr&#xE8;s la transplantation. Dans des exp&#xE9;riences de transplantation secondaire, 7% des cellules PB et 3% de la moelle osseuse (BM) apr&#xE8;s la transplantation des cellules exprim&#xE9; le transg&#xE8;ne 6 mois. Environ 21% des BM-d&#xE9;riv&#xE9;s colonies nourrissait les s&#xE9;quences d&#x26;#39;ADN proviral dans les formes int&#xE9;gr&#xE9;es. Ces r&#xE9;sultats document qui AAV1 est donc loin le vecteur le plus efficace dans la transduction primitifs murins h&#xE9;matopo&#xEF;&#xE9;tiques cellules souches / prog&#xE9;nitrices. D&#x26;#39;autres &#xE9;tudes impliquant des g&#xE9;nomes scAAV et h&#xE9;matopo&#xEF;&#xE9;tiques sp&#xE9;cifiques des cellules promoteurs devraient augmenter encore l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de transduction des vecteurs AAV1, qui devrait avoir des r&#xE9;percussions sur l&#x26;#39;utilisation optimale de ces vecteurs en th&#xE9;rapie g&#xE9;nique tige cellules h&#xE9;matopo&#xEF;&#xE9;tiques.

&#xC9;valuation de la Primitive souches h&#xE9;matopo&#xEF;&#xE9;tiques murins et transduction de cellules prog&#xE9;nitrices in vitro et in vivo par recombinaison s&#xE9;rotypes ad&#xE9;no-associ&#xE9;s vecteur du virus de 1 &#xE0; 5

Widerspr&uuml;chliche Daten existieren auf h&auml;matopoetischen Zellen Transduktion AAV Serotyp 2 (AAV2) Vektoren und zus&auml;tzliche AAV Serotyp Vektoren nicht f&uuml;r ihre Wirksamkeit in h&auml;matopoetischen Stammzellen/Stammvater Zelle Transduktion bewertet wurden. Wir evaluieren die Wirksamkeit von konventionellen, einzeln-angeschwemmte AAV Serotyp Vektoren 1 bis 5 in primitiven murine h&auml;matopoetische Stammzellen/Vorl&auml;uferzellen in-vitro-als auch in-vivo. In Vorl&auml;uferzellen-Zelle-Assays mit Sca1 + c-Kit + Lin - blutbildender Zellen, 9 % der Kolonien in Kulturen mit AAV1 infiziert ausgedr&uuml;ckt das Transgen. Coinfection von AAV1 mit selbst-erg&auml;nzende AAV-Vektoren, tragen das Gen f&uuml;r T-Zell-Protein-Tyrosin-Phosphatase (ScAAV-TC-PTP) die Transduktion Effizienz auf 24 % erh&ouml;ht, darauf hinweist, dass virale Secondstrand DNA-Synthese eine geschwindigkeitsbestimmende Schritt. Dies wurde durch die Verwendung von ScAAV Vektoren, die diese Anforderung umgehen, weiter best&auml;tigt. In Knochenmark-Transplantation-Studien mit lethally bestrahlt syngenen M&auml;use, Sca1 + c-Kit + Lin-Zellen coinfected mit AAV1 +/-ScAAV-TC-PTP-Vektoren f&uuml;hrte zu Transgenexpression in 7,5 % der peripheren Blutzellen (PB) und 2 bzw. 6 Monaten Posttransplantation. In sekund&auml;ren Transplantation Experimente 3 % von Knochenmarkzellen (BM) und 7 % der PB-Zellen ausgedr&uuml;ckt die Transgene 6 Monate Posttransplantation. Etwa 21 % der BM-abgeleitete Kolonien hegten die proviral DNA-Sequenzen in integrierter Form. Diese Ergebnisse Dokument, dass AAV1 ist bisher die effizienteste Vektor in transducing primitive murine h&auml;matopoetische Stammzellen/Vorl&auml;uferzellen. Weitere Studien mit ScAAV Genome und h&auml;matopoetischen zellspezifische Projekttr&auml;gern sollten weiter die Transduktion Effizienz AAV1 Vektoren, erg&auml;nzen die Bez&uuml;ge in die optimale Nutzung dieser Vektoren in h&auml;matopoetischen Stammzellen Gentherapie haben sollte.

Bewertung der primitiven murine h&auml;matopoetische Stamm- und Vorl&auml;uferzellen Zelle Transduktion in vitro und in vivo durch rekombinante Adeno-assoziierte Virus Vektor Serotypen von 1 bis 5.

Dati contrastanti esistono sulla trasduzione di cellule ematopoietiche da sierotipo AAV 2 (AAV2) vettori, e altri vettori AAV sierotipo non sono stati valutati per la loro efficacia nella trasduzione delle cellule staminali/progenitrici ematopoietiche. Abbiamo valutato l&#39;efficacia di eventuali vettori di sierotipo AAV convenzionali, single-stranded 1 attraverso 5 nelle cellule staminali/progenitrici ematopoietiche murino primitivo oltre in vitro che in vivo. Dosaggi di cellule progenitrici utilizzando Sca1 + c-kit + Lin - cellule ematopoietiche, il 9% delle colonie nelle colture infettate con AAV1 espresso il transgene. Coinfezioni di AAV1 con i vettori AAV self-complementari che trasportano il gene per cellula T della proteina tirosina fosfatasi (scAAV-TC-PTP) aumentato l&#39;efficienza di trasduzione al 24%, indicando che la sintesi del DNA virale secondstrand sono un passo di limitazione della velocit&agrave;. Questo &egrave; stata ulteriormente confermato mediante l&#39;uso di vettori di scAAV, che ignorare questo requisito. Negli studi di trapianto del midollo osseo che coinvolgono lethally irradiati Carlo topi, Sca1 + c-kit + Lin-cellule coinfezione con AAV1 + /-scAAV-TC-PTP vettori portati alla espressione del transgene in 2 e 7,5% di cellule del sangue periferico (PB), rispettivamente, posttransplantation di 6 mesi. In esperimenti di trapianto secondario, il 7% delle celle PB e il 3% di cellule di midollo osseo (BM) espresso posttransplantation di 6 mesi il transgene. Circa il 21% delle colonie derivate da BM ospitava le sequenze di DNA proviral in forma integrata. Questi documenti risultati che AAV1 finora &egrave; il vettore pi&ugrave; efficiente in transducing cellule staminali/progenitrici ematopoietiche murino primitivo. Ulteriori studi che coinvolgono scAAV genomi e promotori specifici delle cellule ematopoietiche dovrebbero aumentare ulteriormente l&#39;efficienza di trasduzione dei vettori di AAV1, che dovrebbe avere implicazioni nell&#39;uso ottimo di questi vettori nella terapia genica di cellule staminali ematopoietiche.

Valutazione di trasduzione primitivo murino ematopoietici staminali e progenitrici dei cellulari in vitro e in vivo di vettori ricombinanti virus adeno-associati sierotipi 1 a 5.

&#x77DB;&#x76FE;&#x3059;&#x308B;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x304C;AAV&#x8840;&#x6E05;&#x578B;2&#xFF08;AAV2&#xFF09;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x305D;&#x306E;&#x4ED6;&#x306E;AAV&#x8840;&#x6E05;&#x578B;&#x306E;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x9020;&#x8840;&#x7D30;&#x80DE;&#x60C5;&#x5831;&#x4F1D;&#x9054;&#x3001;&#x9020;&#x8840;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;/&#x524D;&#x99C6;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x4F1D;&#x9054;&#x306B;&#x305D;&#x306E;&#x6709;&#x52B9;&#x6027;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x4E0A;&#x306B;&#x5B58;&#x5728;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;in vitro&#x3068;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;in vivo&#x3067;&#x306E;&#x539F;&#x59CB;&#x7684;&#x306A;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x9020;&#x200B;&#x200B;&#x8840;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;/&#x524D;&#x99C6;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;5&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x5F93;&#x6765;&#x306E;&#x4E00;&#x672C;&#x9396;AAV&#x8840;&#x6E05;&#x578B;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;1&#x306E;&#x6709;&#x52B9;&#x6027;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3057;&#x305F;&#x3002; SCA1 +&#x306F;c-kit + LIN-&#x9020;&#x8840;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x524D;&#x99C6;&#x7D30;&#x80DE;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3067;&#x306F;&#x3001;AAV1&#x306B;&#x611F;&#x67D3;&#x3057;&#x305F;&#x57F9;&#x990A;&#x7269;&#x4E2D;&#x306E;&#x30B3;&#x30ED;&#x30CB;&#x30FC;&#x306E;9&#xFF05;&#x306F;&#x3001;&#x5C0E;&#x5165;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x767A;&#x73FE;&#x3057;&#x305F;&#x3002; T&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;&#xFF08;scAAV-TC-PTP&#xFF09;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x904B;&#x3076;&#x81EA;&#x5DF1;&#x76F8;&#x88DC;&#x7684;AAV&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x3068;AAV1&#x306E;&#x540C;&#x6642;&#x611F;&#x67D3;&#x306F;&#x3001;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;secondstrand&#x306E;DNA&#x5408;&#x6210;&#x304C;&#x5F8B;&#x901F;&#x6BB5;&#x968E;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3001;24&#xFF05;&#x306B;&#x5C0E;&#x5165;&#x52B9;&#x7387;&#x3092;&#x5897;&#x52A0;&#x3055;&#x305B;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x306F;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x8981;&#x4EF6;&#x3092;&#x56DE;&#x907F;scAAV&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x88CF;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x81F4;&#x6B7B;&#x91CF;&#x306E;&#x653E;&#x5C04;&#x7DDA;&#x7167;&#x5C04;&#x540C;&#x7CFB;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x3092;&#x4F34;&#x3046;&#x9AA8;&#x9AC4;&#x79FB;&#x690D;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;SCA1 +&#x306F;c-kit + AAV1&#x3068;&#x91CD;&#x8907;&#x611F;&#x67D3;&#x6797;&#x7D30;&#x80DE;+ /  - &#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x305E;&#x308C;&#x3001;6 scAAV-TC-PTP&#x306E;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;2&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x3063;&#x305F;&#x3068;&#x672B;&#x68A2;&#x8840;&#xFF08;PB&#xFF09;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;7.5&#xFF05;&#x79FB;&#x690D;&#x5F8C;&#x6570;&#x30F6;&#x6708;&#x3002;&#x4E8C;&#x6B21;&#x79FB;&#x690D;&#x5B9F;&#x9A13;&#x3067;&#x306F;&#x3001;PB&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;7&#xFF05;&#x3001;&#x9AA8;&#x9AC4;&#xFF08;BM&#xFF09;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;3&#xFF05;&#x304C;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x79FB;&#x690D;&#x5F8C;6&#x30F6;&#x6708;&#x3092;&#x8868;&#x660E;&#x3057;&#x305F;&#x3002; BM&#x7531;&#x6765;&#x30B3;&#x30ED;&#x30CB;&#x30FC;&#x306E;&#x7D04;21&#xFF05;&#x304C;&#x7D71;&#x5408;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5F62;&#x3067;&#x30D7;&#x30ED;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;DNA&#x914D;&#x5217;&#x3092;&#x62B1;&#x3044;&#x3066;&#x3002; AAV1&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x307E;&#x3067;&#x539F;&#x59CB;&#x7684;&#x306A;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x9020;&#x200B;&#x200B;&#x8840;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;/&#x524D;&#x99C6;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x5F62;&#x8CEA;&#x5C0E;&#x5165;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x6700;&#x3082;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x6587;&#x66F8;&#x3002; scAAV&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x9020;&#x8840;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3055;&#x3089;&#x306A;&#x308B;&#x7814;&#x7A76;&#x304C;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x9020;&#x8840;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x6CBB;&#x7642;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306E;&#x6700;&#x9069;&#x306A;&#x4F7F;&#x7528;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x3079;&#x304D;&#x3067;&#x3042;&#x308B;AAV1&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x5C0E;&#x5165;&#x52B9;&#x7387;&#x3092;&#x5897;&#x5F37;&#x3059;&#x308B;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

5&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30A2;&#x30C7;&#x30CE;&#x968F;&#x4F34;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x8840;&#x6E05;&#x578B;1&#x306B;&#x3088;&#x308B;in vitro&#x304A;&#x3088;&#x3073;in vivo&#x3067;&#x306E;&#x539F;&#x59CB;&#x7684;&#x306A;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x9020;&#x200B;&#x200B;&#x8840;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;&#x3084;&#x524D;&#x99C6;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x5F62;&#x8CEA;&#x5C0E;&#x5165;&#x306E;&#x8A55;&#x4FA1;

&#xCDA9;&#xB3CC; &#xD558;&#xB294; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xC870; &#xD608; &#xC138;&#xD3EC; &#xBCC0;&#xD658; AAV serotype 2 (AAV2)&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBCA1;&#xD130;, &#xBC0F; &#xCD94;&#xAC00; AAV serotype &#xBCA1;&#xD130; &#xC870; &#xD608; &#xC904;&#xAE30;/&#xBFCC;&#xB9AC; &#xC140; &#xBCC0;&#xD658;&#xC5D0;&#xC11C; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xD6A8;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD3C9;&#xAC00; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC558;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xAE30;&#xC874;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; AAV serotype &#xBCA1;&#xD130; 1-5 &#xAE30;&#xBCF8; murine &#xC870; &#xD608; &#xC904;&#xAE30;/&#xBFCC;&#xB9AC; &#xC138;&#xD3EC; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; in vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xD6A8;&#xB2A5; &#xD3C9;&#xAC00;. Sca1 + c&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC870;&#xC0C1; &#xC138;&#xD3EC; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0;&#xC11C;-&#xD0A4;&#xD2B8; + &#xB9B0;-&#xC870; &#xD608; &#xC138;&#xD3EC;, aav1&#xC5D0; &#xAC10;&#xC5FC; &#xBB38;&#xD654;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2DD;&#xBBFC;&#xC9C0;&#xC758; 9%&#xB294; transgene &#xD45C;&#xD604;. T &#xC138;&#xD3EC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC778;&#xC0B0; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD6A8;&#xC18C; (scAAV-t C-PTP) 24%, &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; secondstrand DNA &#xD569;&#xC131; &#xC18D;&#xB3C4; &#xC81C;&#xD55C; &#xB2E8;&#xACC4; &#xC784;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728; &#xC99D;&#xAC00; &#xB300; &#xD55C; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB97C; &#xC6B4;&#xBC18; &#xD558;&#xB294; &#xC790;&#xCCB4; &#xBCF4;&#xC644; AAV &#xBCA1;&#xD130;&#xC640; aav1&#xC758; coinfection. &#xC774;&#xC774; &#xC694;&#xAD6C; &#xC0AC;&#xD56D;&#xC744; &#xBB34;&#xC2DC;&#xD560; scAAV &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xB354;&#xC6B1; &#xB4B7;&#xBC1B;&#xCE68; &#xB41C;&#xB2E4;. &#xACE8; &#xC218; &#xC774;&#xC2DD; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; syngeneic &#xB9C8;&#xC6B0;&#xC2A4;, Sca1 + c &#xBC18;&#xAD6C; lethally &#xD3EC;&#xD568;-&#xD0A4;&#xD2B8; + &#xB9B0; &#xC140; coinfected aav1&#xC640; scAAV TC PTP &#xBCA1;&#xD130; transgene &#xC2DD; 2 &#xBC0F; &#xB9D0; &#xCD08; &#xD608;&#xC561; (PB) &#xC140;&#xC758; 7.5%&#xC5D0; &#xAC01;&#xAC01; &#xC8FC;&#xB3C4; + 6 &#xAC1C;&#xC6D4; posttransplantation. 2 &#xCC28; &#xC774;&#xC2DD; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0;&#xC11C; PB &#xC140;&#xC758; 7%&#xC640; 3%&#xC758; &#xACE8; &#xC218; (BM) &#xC140; transgene 6 &#xAC1C;&#xC6D4; posttransplantation &#xD45C;&#xD604;. BM &#xD30C;&#xC0DD; &#xB41C; &#xC2DD;&#xBBFC;&#xC9C0;&#xC758; &#xC57D; 21% &#xD1B5;&#xD569; &#xD615;&#xD0DC;&#xB85C; proviral DNA &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xB97C; &#xC228;&#xACA8;. Aav1&#xC740; transducing &#xAE30;&#xBCF8; murine &#xC870; &#xD608; &#xC904;&#xAE30;/&#xBFCC;&#xB9AC; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xAC00;&#xC7A5; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xBCA1;&#xD130; &#xC9C0;&#xAE08;&#xAE4C;&#xC9C0; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; &#xBB38;&#xC11C;. ScAAV &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC0F; &#xC870; &#xD608; &#xC138;&#xD3EC; &#xAD00;&#xB828; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xB354; &#xB9CE;&#xC740; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xAC00; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC870; &#xD608; &#xC904;&#xAE30; &#xC138;&#xD3EC; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xCE58;&#xB8CC;&#xC774; &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xCD5C;&#xC801;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBBF8;&#xCE60; &#xD55C;&#xB2E4; AAV1 &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728;&#xC744; &#xBCF4;&#xAC15; &#xCD94;&#xAC00; &#xD574;&#xC57C;&#xD55C;&#xB2E4;.

&#xAE30;&#xBCF8; murine &#xC870; &#xD608; &#xC904;&#xAE30; &#xBC0F; &#xBFCC;&#xB9AC; &#xC138;&#xD3EC; &#xC804;&#xB2EC; &#xCCB4; &#xC678; &#xBC0F; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; adeno &#xC81C;&#xD734;&#xD574; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xBCA1;&#xD130;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; vivo&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xD3C9;&#xAC00; serotypes 1-5.

Existen datos contradictorios sobre la transducci&#xF3;n de c&#xE9;lulas hematopoy&#xE9;ticas por AAV serotipo 2 (AAV2) vectores, y otros vectores AAV serotipo no han sido evaluadas por su eficacia en la transducci&#xF3;n de c&#xE9;lulas madre hematopoy&#xE9;ticas / progenitoras. Se evalu&#xF3; la eficacia de los convencionales, de cadena sencilla vectores AAV serotipo 1 a 5 en primitivas hematopoy&#xE9;ticas de rat&#xF3;n c&#xE9;lulas madre / progenitoras in vitro como en vivo. En ensayos con c&#xE9;lulas progenitoras con Sca1 + c-kit +, Lin-c&#xE9;lulas hematopoy&#xE9;ticas, el 9% de las colonias en cultivos infectados con AAV1 expresa el transg&#xE9;n. Coinfecci&#xF3;n de AAV1 con auto-complementarias vectores AAV portadores del gen de la fosfatasa de tirosina de prote&#xED;na de c&#xE9;lulas T (scAAV-TC-PTP) aument&#xF3; la eficacia de transducci&#xF3;n a 24%, lo que indica que la s&#xED;ntesis v&#xED;rica secondstrand ADN es un paso limitante de la velocidad. Esto fue corroborado por el uso de vectores scAAV, que pasan por alto este requisito. En los estudios de trasplante de m&#xE9;dula &#xF3;sea con ratones sing&#xE9;nicos irradiados letalmente, Sca1 + c-kit +, Lin-c&#xE9;lulas coinfectadas con AAV1 + / - scAAV-TC-PTP vectores condujo a la expresi&#xF3;n del transgen en el 2 y el 7,5% de la sangre perif&#xE9;rica (PB) de las c&#xE9;lulas, respectivamente 6, meses postrasplante. En experimentos de trasplante secundarios, el 7% de las c&#xE9;lulas de PB y 3% de la m&#xE9;dula &#xF3;sea (MO), las c&#xE9;lulas expres&#xF3; el transg&#xE9;n 6 meses postrasplante. Aproximadamente el 21% de BM-derivados de las colonias albergaba las secuencias de ADN proviral en formas integradas. Estos resultados AAV1 documento que es hasta ahora el vector m&#xE1;s eficiente en la transducci&#xF3;n de primitivas hematopoy&#xE9;ticas de rat&#xF3;n c&#xE9;lulas madre / progenitoras. Otros estudios relacionados con los genomas scAAV hematopoy&#xE9;ticas y c&#xE9;lulas espec&#xED;ficas de los promotores m&#xE1;s debe aumentar la eficacia de transducci&#xF3;n de AAV1 vectores, lo que deber&#xED;a tener consecuencias en el uso &#xF3;ptimo de estos vectores en terapia g&#xE9;nica de c&#xE9;lulas madre hematopoy&#xE9;ticas.

Evaluaci&#xF3;n de la Primitiva madre hematopoy&#xE9;ticas murinas y transducci&#xF3;n de c&#xE9;lulas progenitoras en Vitro e in vivo de los serotipos vectoriales recombinantes virus adeno-asociado del 1 al 5

&#x81EA;&#x6211;&#x8865;&#x5145;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; (scAAV) &#x8F7D;&#x4F53;&#x7684;&#x65C1;&#x8DEF;&#x75C5;&#x6BD2;&#x6027;&#x4E8C;&#x80A1; DNA &#x5408;&#x6210;&#xFF0C;&#x4F46;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5411;&#x91CF; &#xFF08;&#x5927;&#x7EA6; 2.4 kb&#xFF09; &#x7684;&#x5305;&#x88C5;&#x80FD;&#x529B;&#x7684;&#x8981;&#x6C42;&#x662F;&#x8981;&#x5C0F;&#x5F97;&#x591A;&#x7684;&#x5E38;&#x89C4;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8F7D;&#x4F53; (&#x7EA6; 4.8 kb)&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5EFA;&#x9020;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x91CD;&#x7EC4;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D; (hrGFP) &#x8868;&#x8FBE;&#x76D2;&#x4ECE; 2.3 &#x5230; 4.1 kb&#x3002;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x77E2;&#x91CF;&#x662F;&#x751F;&#x7269;&#x6D3B;&#x6027;&#xFF0C;&#x4F46;&#x8F7D;&#x4F53;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x6548;&#x7387; &lt; 3.3 kb &#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x662F;&#x5927;&#x5927;&#x9AD8;&#x4E8E;&#x90A3;&#x4E9B;&#x542B;&#x6709;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4; 3.5 kb &#x6216;&#x66F4;&#x5927;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;scAAV &#x5411;&#x91CF;&#x6700;&#x591A;&#x5305;&#x542B;&#x5927;&#x7EA6; 3.3 kb &#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x4E5F;&#x8F7D;&#x5355;&#x7EDE;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x548C; 3.5 kb &#x548C;&#x66F4;&#x5927;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x88AB;&#x6253;&#x5305;&#x53EA;&#x4E3A;&#x5355;&#x94FE; DNA&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6570;&#x636E;&#x8868;&#x660E; scAAV &#x5411;&#x91CF;&#x7684;&#x6700;&#x5927;&#x5305;&#x88C5;&#x80FD;&#x529B;&#x7EA6; 3.3 kb&#x3002;&#x751F;&#x4EA7;&#x7684;&#x5355;&#x94FE;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x4E0D;&#x9002;&#x5F53;&#x4FEE;&#x590D;&#x7684;&#x7EC8;&#x7AEF;&#x51B3;&#x8BAE;&#x7F51;&#x7AD9; &#xFF08;trs&#xFF09; &#x5728;&#x5012;&#x7ACB;&#x7EC8;&#x7AEF;&#x91CD;&#x590D;&#x5E8F;&#x5217;&#x4E2D;&#x7684;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x4F46;&#x76F8;&#x5F53;&#x90E8;&#x5206;&#x662F;&#x7531;&#x4E8E;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x5E2E;&#x52A9;&#x5668;&#x8D28;&#x7C92;&#xFF0C;&#x5DF2;&#x77E5;&#x5BFC;&#x81F4;&#x66F4;&#x9AD8;&#x6C34;&#x5E73;&#x7684; Rep &#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x3002;&#x5DF2;&#x77E5;&#x7684; Rep &#x86CB;&#x767D;&#x6C34;&#x5E73;&#x4E0B;&#x964D;&#x5BFC;&#x81F4;&#x5E2E;&#x52A9;&#x5668;&#x8D28;&#x7C92;&#x7684;&#x4F7F;&#x7528;&#x5BFC;&#x81F4; scAAV &#x5411;&#x91CF;&#x5305;&#x542B;&#x5927;&#x7EA6; 90%&#x7684;&#x75C5;&#x6BD2;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x4E2D;&#x53CC;&#x94FE;&#x5F62;&#x5F0F;&#x7684;&#x4EA7;&#x751F;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7814;&#x7A76;&#x8BC1;&#x660E;&#x5230; scAAV &#x5411;&#x91CF;&#x6BD4;&#x539F;&#x6765;&#xFF0C;&#x6709;&#x4EBA;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x5B9E;&#x73B0;&#x8863;&#x58F3;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x8F83;&#x5927;&#x7684;&#x53EF;&#x884C;&#x6027;&#xFF0C;&#x4F46;&#x5F3A;&#x8C03;&#xFF0C;&#x9700;&#x8981;&#x8C28;&#x614E;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x9002;&#x5F53;&#x7684;&#x5E2E;&#x52A9;&#x5668;&#x8D28;&#x7C92;&#x751F;&#x6210; scAAV &#x80A1;&#x7968;&#x80FD;&#x591F;&#x9AD8;&#x6548;&#x7387;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x662F;&#x76F8;&#x5BF9;&#x81EA;&#x7531;&#x7684;&#x5355;&#x94FE; DNA &#x5305;&#x542B;&#x5411;&#x91CF;&#x3002;

&#x81EA;&#x6211;&#x4E92;&#x8865;&#x91CD;&#x7EC4;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8F7D;&#x4F53;&#xFF1A; &#x77E2;&#x91CF;&#x7EAF;&#x5EA6;&#x5305;&#x88C5;&#x80FD;&#x529B;&#x548C; rep &#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

Self-complementary adeno-associated viral (scAAV) vectors bypass the requirement for viral second-strand DNA synthesis, but the packaging capacity of these vectors ( approximately 2.4 kb) is significantly smaller than that of conventional AAV vectors ( approximately 4.8 kb). We constructed human recombinant green fluorescent protein (hrGFP) expression cassettes ranging from 2.3 to 4.1 kb. Each vector was biologically active, but the transduction efficiency of vectors containing <3.3-kb genomes was significantly higher than those containing 3.5-kb genomes or larger. However, scAAV vectors containing up to approximately 3.3-kb genomes also contained single-stranded genomes, and 3.5-kb and larger genomes were packaged only as single-stranded DNA. These data suggest that the maximum packaging capacity of scAAV vectors is approximately 3.3 kb. The production of single-stranded genomes was not due to repair of the terminal resolution site (trs) in the inverted terminal repeats in the AAV genome, but rather was partly due to the use of AAV helper plasmid, known to lead to higher levels of expression of Rep proteins. The use of a helper plasmid known to lead to reduced levels of Rep proteins led to the generation of scAAV vectors that contained approximately 90% of the viral genomes in double-stranded forms. These studies demonstrate the feasibility of achieving encapsidation of larger genomes into scAAV vectors than was suggested originally, but underscore the need to exercise caution in using the appropriate helper plasmid to generate scAAV stocks capable of high-efficiency transduction that are relatively free of single-stranded DNA-containing vectors.

Self-complementary recombinant adeno-associated viral vectors: packaging capacity and the role of rep proteins in vector purity.

Auto-compl&#xE9;mentaire viraux ad&#xE9;no-associ&#xE9; (scAAV) vecteurs contourner l&#x26;#39;exigence de synth&#xE8;se d&#x26;#39;ADN viral second brin, mais la capacit&#xE9; de conditionnement de ces vecteurs (environ 2,4 kb) est sensiblement plus petite que celle de vecteurs AAV classiques (environ 4,8 kb). Nous avons construit recombinantes humaines verts fluorescents cassettes d&#x26;#39;expression de prot&#xE9;ines (hrGFP) allant de 2,3 &#xE0; 4,1 kb. Chaque vecteur est biologiquement active, mais l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de transduction des vecteurs contenant moins de 3,3 kb g&#xE9;nomes &#xE9;tait significativement plus &#xE9;lev&#xE9; que ceux contenant de 3,5 kb g&#xE9;nomes ou plus. Cependant, les vecteurs scAAV contenant jusqu&#x26;#39;&#xE0; environ 3,3 kb g&#xE9;nomes contenaient &#xE9;galement simple brin g&#xE9;nomes, et de 3,5 kb et de plus grands g&#xE9;nomes ont &#xE9;t&#xE9; emball&#xE9;s seulement comme l&#x26;#39;ADN simple brin. Ces donn&#xE9;es sugg&#xE8;rent que la capacit&#xE9; de conditionnement maximal de vecteurs scAAV est d&#x26;#39;environ 3,3 kb. La production de mono-brin g&#xE9;nomes n&#x26;#39;&#xE9;tait pas due &#xE0; la r&#xE9;paration de la r&#xE9;solution sur le site de terminal (TRS) dans les r&#xE9;p&#xE9;titions terminales invers&#xE9;es dans le g&#xE9;nome de l&#x26;#39;AAV, mais plut&#xF4;t &#xE9;tait en partie due &#xE0; l&#x26;#39;utilisation de l&#x26;#39;AAV plasmide auxiliaire, connue pour mener &#xE0; des niveaux plus &#xE9;lev&#xE9;s de expression de prot&#xE9;ines Rep. Utilisation d&#x26;#39;un plasmide auxiliaire connue pour mener &#xE0; des niveaux r&#xE9;duits de prot&#xE9;ines Rep conduit &#xE0; la g&#xE9;n&#xE9;ration de vecteurs scAAV que contenues environ 90% des g&#xE9;nomes viraux dans double brin formes. Ces &#xE9;tudes d&#xE9;montrent la faisabilit&#xE9; de la r&#xE9;alisation d&#x26;#39;encapsidation de g&#xE9;nomes plus grands dans des vecteurs scAAV que ce qui &#xE9;tait propos&#xE9; &#xE0; l&#x26;#39;origine, mais soulignent la n&#xE9;cessit&#xE9; de faire preuve de prudence dans l&#x26;#39;utilisation de l&#x26;#39;assistant plasmide appropri&#xE9; pour g&#xE9;n&#xE9;rer des stocks scAAV capables de haute efficacit&#xE9; de transduction qui sont relativement libres de simple brin ADN contenant vecteurs.

Auto-compl&#xE9;mentaires ad&#xE9;no-associ&#xE9; recombinant Vecteurs viraux: la capacit&#xE9; de conditionnement et le r&#xF4;le des prot&#xE9;ines Rep dans la puret&#xE9; Vecteur

Selbst-erg&auml;nzende Adeno-assoziierte Viren (ScAAV) Vektoren umgehen, die die Voraussetzung f&uuml;r virale Sekunde-Strang-DNA-Synthese, aber die Verpackung-Kapazit&auml;t dieser Vektoren (ca. 2,4 kb) erheblich kleiner als ist, die von konventionellen AAV Vektoren (ca. 4,8 kb). Konstruierten wir menschlichen rekombinanten gr&uuml;n fluoreszierendes Protein (HrGFP) Ausdruck Kassetten von 2,3 bis hin zu 4.1 kb. Jeder Vektor war biologisch aktiv, aber die Effizienz der Transduktion von Vektoren mit &lt; 3.3-kb-Genome lag deutlich h&ouml;her als die mit 3.5-kb-Genome oder gr&ouml;&szlig;er. Jedoch einzeln-angeschwemmte ScAAV Vektoren mit bis zu ca. 3,3-kb-Genome enthalten auch einzeln-angeschwemmte Genome und 3.5-kb und gr&ouml;&szlig;ere Genome wurden gepackt, nur als DNA. Diese Daten zeigen, dass die maximale Verpackung-Kapazit&auml;t ScAAV Vektoren ca. 3,3 kb ist. Herstellung von einzeln-angeschwemmte Genome war nicht in der invertierten terminal Wiederholungen im AAV Genom des Standortes terminal Aufl&ouml;sung (Trs) zu reparieren, aber eher war teilweise auf die Verwendung von AAV Helfer Plasmid, f&uuml;hren zu h&ouml;heren Ebenen des Ausdrucks Rep Proteine bekannt. Die Verwendung von einem Helfer-Plasmid zu reduzierten Rep Proteine f&uuml;hren bekannterma&szlig;en f&uuml;hrte zu der Generation von ScAAV Vektoren, die etwa 90 % der virale Genome in Doppelstrang-Formulare enthalten. Diese Studien zeigen die Machbarkeit der Erreichung Encapsidation gr&ouml;&szlig;ere Genome in ScAAV Vektoren als urspr&uuml;nglich vorgeschlagen wurde, aber unterstreichen die Notwendigkeit, seien Sie vorsichtig im Umgang mit den entsprechenden Helfer-Plasmid ScAAV Best&auml;nde der hocheffizienten Transduktion zu generieren, die relativ frei von einzeln-angeschwemmte DNA-haltigen Vektoren sind.

Selbst-erg&auml;nzende rekombinante Adeno-assoziierter viraler Vektoren: Verpackung Kapazit&auml;t und die Rolle der Rep Proteine in Vektor Reinheit.

Auto-complementare adeno-associati virale (scAAV) di vettori bypass che il requisito per la sintesi di DNA virale secondo-filo, ma la capacit&agrave; di confezionamento di questi vettori (approssimativamente 2.4 kb) &egrave; significativamente minore che di convenzionale AAV vettori (circa 4,8 kb). Abbiamo costruito cassette di espressione umana ricombinante proteina fluorescente verde (hrGFP) che variano da 2,3 a 4.1 kb. Ogni vettore &egrave; stato biologicamente attivo, ma l&#39;efficienza di trasduzione di vettori contenenti &lt; 3.3 kb genomi &egrave; stato significativamente superiori a quelli contenenti genomi 3.5 kb o pi&ugrave; grande. Tuttavia, scAAV vettori contenenti fino a circa 3.3-kb genomi contenevano anche single-stranded genomi e genomi 3.5 kb e pi&ugrave; grandi sono stati confezionati solo come single-stranded del DNA. Questi dati suggeriscono che la capacit&agrave; massima imballaggi di scAAV vettori &egrave; circa 3,3 kb. La produzione di single-stranded genomi non era dovuta alla riparazione del sito risoluzione terminale (trs) nelle ripetizioni terminali rovesciate nel genoma dell&#39;AAV, ma piuttosto era in parte dovuto all&#39;uso del plasmide helper AAV, noto per condurre a pi&ugrave; alti livelli di espressione delle proteine Rep. L&#39;uso di un plasmide helper noto per portare a livelli ridotti di proteine Rep ha condotto alla generazione di vettori scAAV che conteneva circa il 90% del genoma virale in forme double-stranded. Questi studi dimostrano la fattibilit&agrave; di realizzare encapsidation di genomi pi&ugrave; grandi nei vettori scAAV che fu originariamente suggerito, ma sottolineano la necessit&agrave; di usare cautela nell&#39;uso del plasmide helper appropriato per generare stock scAAV capace di trasduzione ad alta efficienza che sono relativamente liberi di vettori contenenti DNA single-stranded.

Self-complementari recombinant vettori virali adeno-associati: capacit&agrave; di imballaggio e il ruolo delle proteine rep in vector purezza.

&#x81EA;&#x5DF1;&#x76F8;&#x88DC;&#x7684;&#x306A;&#x30A2;&#x30C7;&#x30CE;&#x968F;&#x4F34;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#xFF08;scAAV&#xFF09;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x4E8C;&#x672C;&#x9396;DNA&#x5408;&#x6210;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8981;&#x4EF6;&#x3092;&#x30D0;&#x30A4;&#x30D1;&#x30B9;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x30D1;&#x30C3;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x5BB9;&#x91CF;&#xFF08;&#x7D04;2.4&#x30AD;&#x30ED;&#x30D0;&#x30A4;&#x30C8;&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x5F93;&#x6765;&#x306E;AAV&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#xFF08;&#x7D04;4.8&#x30AD;&#x30ED;&#x30D0;&#x30A4;&#x30C8;&#xFF09;&#x3088;&#x308A;&#x3082;&#x6709;&#x610F;&#x306B;&#x5C0F;&#x3055;&#x304F;&#x306A;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;2.3&#x304B;&#x3089;4.1&#x30AD;&#x30ED;&#x30D0;&#x30A4;&#x30C8;&#x307E;&#x3067;&#x306E;&#x30D2;&#x30C8;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x7DD1;&#x8272;&#x86CD;&#x5149;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08;hrGFP&#xFF09;&#x767A;&#x73FE;&#x30AB;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x69CB;&#x7BC9;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5404;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x7684;&#x306B;&#x6D3B;&#x6027;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x304C;&#x3001;&#x26;lt;3.3-kb&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x3092;&#x542B;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x5C0E;&#x5165;&#x52B9;&#x7387;&#x306F;&#x3001;3.5-kb&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3082;&#x306E;&#x3088;&#x308A;&#x3082;&#x6709;&#x610F;&#x306B;&#x9AD8;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x4E00;&#x672C;&#x9396;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;3.5-kb&#x3068;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x3092;&#x542B;&#x3093;&#x3067;&#x3044;&#x305F;&#x7D04;3.3-kb&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x307E;&#x3067;&#x3092;&#x542B;&#x3080;scAAV&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x4E00;&#x672C;&#x9396;DNA&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x30D1;&#x30C3;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B8;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;scAAV&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306E;&#x6700;&#x5927;&#x5305;&#x88C5;&#x5BB9;&#x91CF;&#x306F;&#x7D04;3.3&#x30AD;&#x30ED;&#x30D0;&#x30A4;&#x30C8;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x4E00;&#x672C;&#x9396;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306E;&#x751F;&#x7523;&#x306F;&#x3001;AAV&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306E;&#x9006;&#x65B9;&#x5411;&#x672B;&#x7AEF;&#x53CD;&#x5FA9;&#x3067;&#x7AEF;&#x672B;&#x306E;&#x89E3;&#x6C7A;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#xFF08;TRS&#xFF09;&#x306E;&#x4FEE;&#x7406;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x3082;&#x306E;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x306E;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x4E00;&#x90E8;&#x306F;&#x3088;&#x308A;&#x9AD8;&#x3044;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x77E5;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;AAV&#x30D8;&#x30EB;&#x30D1;&#x30FC;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x3082;&#x306E;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;rep&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x3002; rep&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x306E;&#x6E1B;&#x5C11;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x77E5;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x30D8;&#x30EB;&#x30D1;&#x30FC;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x306F;&#x3001;&#x4E8C;&#x672C;&#x9396;&#x306E;&#x5F62;&#x614B;&#x306E;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306E;&#x7D04;90&#xFF05;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;scAAV&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306E;&#x751F;&#x6210;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x3001;&#x5F53;&#x521D;&#x793A;&#x5506;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3088;&#x308A;&#x3082;scAAV&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x3078;&#x306E;&#x5927;&#x898F;&#x6A21;&#x306A;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306E;&#x30AB;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x3092;&#x9054;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x5B9F;&#x73FE;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3059;&#x308B;&#x304C;&#x3001;&#x4E00;&#x672C;&#x9396;&#x306E;&#x6BD4;&#x8F03;&#x7684;&#x81EA;&#x7531;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x9AD8;&#x52B9;&#x7387;&#x306A;&#x4F1D;&#x9054;&#x304C;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;scAAV&#x682A;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x9069;&#x5207;&#x306A;&#x30D8;&#x30EB;&#x30D1;&#x30FC;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x6CE8;&#x610F;&#x3092;&#x884C;&#x4F7F;&#x3059;&#x308B;&#x5FC5;&#x8981;&#x6027;&#x3092;&#x5F37;&#x8ABF;DNA&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x3092;&#x3002;

&#x81EA;&#x5DF1;&#x76F8;&#x88DC;&#x7684;&#x306A;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30A2;&#x30C7;&#x30CE;&#x968F;&#x4F34;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#xFF1A;&#x30D1;&#x30C3;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B8;&#x5BB9;&#x91CF;&#x3068;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x7D14;&#x5EA6;&#x306E;&#x62C5;&#x5F53;&#x8005;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;

&#xC790;&#xCCB4; &#xBCF4;&#xC644; adeno &#xC81C;&#xD734;&#xD574; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; (scAAV) &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; 2 &#xAC00;&#xB2E5; DNA &#xD569;&#xC131;, &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xBCA1;&#xD130; (&#xC57D; 2.4 kb)&#xC758; &#xD3EC;&#xC7A5; &#xC6A9;&#xB7C9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC694;&#xAD6C;&#xB294; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xD6E8;&#xC52C; &#xC791;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;&#xB294; &#xAE30;&#xC874;&#xC758; AAV &#xBCA1;&#xD130; (&#xC57D; 4.8 kb) &#xBC14;&#xC774;&#xD328;&#xC2A4; &#xBCA1;&#xD130;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xB179;&#xC0C9; &#xD615;&#xAD11; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (hrGFP) &#xC2DD; &#xCE74;&#xC138;&#xD2B8; 2.3&#xC5D0;&#xC11C; 4.1 kb&#xC5D0; &#xC774;&#xB974;&#xAE30;&#xAE4C;&#xC9C0; &#xAC74;&#xC124;. &#xAC01; &#xBCA1;&#xD130;&#xB294; &#xC0DD;&#xBB3C;&#xD559;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD65C;&#xC131;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &lt; 3.3 kb &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB294; &#xD06C;&#xAC8C; 3.5 kb &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xAC83; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xB354; &#xB192;&#xC740; &#xB610;&#xB294; &#xB354; &#xD070;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xC57D; 3.3 kb &#xAC8C;&#xB188;&#xC740; &#xB610;&#xD55C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xD3EC;&#xD568;&#xAE4C;&#xC9C0; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558; &#xACE0; 3.5 kb &#xBC0F; &#xD070; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB85C;&#xB9CC; &#xD3EC;&#xC7A5; &#xD588;&#xB2E4; scAAV &#xBCA1;&#xD130; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; DNA. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB370;&#xC774;&#xD130; scAAV &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xCD5C;&#xB300; &#xD3EC;&#xC7A5; &#xC6A9;&#xB7C9; &#xC57D; 3.3 kb&#xB294; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC0DD;&#xC0B0; AAV &#xAC8C;&#xB188;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC70;&#xAFB8;&#xB85C; &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xBC18;&#xBCF5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xD655;&#xC778; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; (trs)&#xC758; &#xBCF5;&#xAD6C; &#xC608;&#xC815; &#xC774;&#xC5C8;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC624;&#xD788;&#xB824; &#xB2F4;&#xB2F9;&#xC790; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xD45C;&#xD604;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xC218;&#xC900;&#xC73C;&#xB85C;&#xC774; &#xB04C; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4; AAV &#xB3C4;&#xC6B0;&#xBBF8; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBD80;&#xBD84;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;. &#xB2F4;&#xB2F9;&#xC790; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xAC10;&#xC18C; &#xC218;&#xC900;&#xC73C;&#xB85C;&#xC774; &#xB04C; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4; &#xB3C4;&#xC6B0;&#xBBF8; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xB354;&#xBE14;-&#xC88C;&#xCD08; &#xD615;&#xD0DC;&#xB85C; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; &#xAC8C;&#xB188;&#xC758; &#xC57D; 90%&#xB294; scAAV &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xC138;&#xB300; &#xC8FC;&#xB3C4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; scAAV &#xBCA1;&#xD130; &#xC6D0;&#xB798; &#xC81C;&#xC548; &#xB41C; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xB354; &#xD070; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; encapsidation &#xB2EC;&#xC131;&#xC758; &#xD0C0;&#xB2F9;&#xC131;&#xC744; &#xC785;&#xC99D; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC801;&#xC808; &#xD55C; &#xB3C4;&#xC6B0;&#xBBF8; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC0DD;&#xC131; scAAV &#xC8FC;&#xC2DD; &#xACE0;&#xD6A8;&#xC728; &#xBCC0;&#xD658; &#xB2A5;&#xB825;&#xC774; &#xC0C1;&#xB300;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; DNA &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xC790;&#xC720;&#xC5D0; &#xC8FC;&#xC758; &#xD558;&#xB294; &#xD544;&#xC694;&#xB97C; &#xBC11;&#xC904;.

&#xC790;&#xCCB4; &#xBCF4;&#xC644; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; adeno &#xC81C;&#xD734;&#xD574; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; &#xBCA1;&#xD130;: &#xD3EC;&#xC7A5; &#xC6A9;&#xB7C9; &#xBC0F; &#xB2F4;&#xB2F9;&#xC790; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC5ED;&#xD560; &#xBCA1;&#xD130; &#xC21C;&#xB3C4;.

Auto-complementaria adeno-asociado virales (scAAV) vectores omitir el requisito para la s&#xED;ntesis de ADN viral segunda hebra, pero la capacidad de envasado de estos vectores (aproximadamente 2,4 kb) es significativamente menor que el de vectores AAV convencionales (aproximadamente 4,8 kb). Hemos construido humanos recombinantes prote&#xED;na verde fluorescente (hrGFP) casetes de expresi&#xF3;n que van desde 2,3 a 4,1 kb. Cada vector era biol&#xF3;gicamente activo, pero la eficacia de transducci&#xF3;n de los vectores que contienen &#x26;lt;3,3-kb genomas fue significativamente mayor que los que contienen 3,5-kb genomas o m&#xE1;s grandes. Sin embargo, los vectores scAAV que contienen hasta aproximadamente 3,3 kb-genomas tambi&#xE9;n conten&#xED;a monocatenario genomas y 3,5 kb-y grandes genomas fueron empaquetados s&#xF3;lo como una sola cadena de ADN. Estos datos sugieren que la capacidad de envasado m&#xE1;ximo de vectores scAAV es de aproximadamente 3,3 kb. La producci&#xF3;n de cadena simple genomas no era debido a una reparaci&#xF3;n del sitio de resoluci&#xF3;n terminal (TRS) en las repeticiones terminales invertidas en el genoma AAV, sino m&#xE1;s bien se debe en parte a la utilizaci&#xF3;n de ayudante de AAV pl&#xE1;smido, sabe que conducen a niveles m&#xE1;s altos de expresi&#xF3;n de las prote&#xED;nas Rep. El uso de un pl&#xE1;smido auxiliar conocido para llevar a niveles reducidos de prote&#xED;nas Rep conducido a la generaci&#xF3;n de vectores scAAV que conten&#xED;an aproximadamente 90% de los genomas virales en doble cadena formas. Estos estudios demuestran la factibilidad de lograr la encapsidaci&#xF3;n de genomas m&#xE1;s grandes en vectores scAAV de lo que se sugiri&#xF3; inicialmente, pero subrayan la necesidad de extremar las precauciones en el uso del pl&#xE1;smido auxiliar apropiado para generar acciones scAAV capaces de transducci&#xF3;n de alta eficiencia que son relativamente libres de una sola cadena ADN que contienen vectores.

Auto-complementarios recombinantes adeno-asociados vectores virales: Capacidad de embalaje y papel de la Rep prote&#xED;nas en Pureza Vector

Un 52 kd prot&#xE9;ine cellulaire, la prot&#xE9;ine de liaison FK-506-(FKBP52), phosphoryl&#xE9;s &#xE0; r&#xE9;sidus tyrosine par le facteur de croissance &#xE9;pidermique kinase tyrosine r&#xE9;cepteur de prot&#xE9;ine (EGFR PTK), inhibe virus ad&#xE9;no-associ&#xE9; 2 (AAV2) second brin d&#x26;#39;ADN de synth&#xE8;se et l&#x26;#39;expression du transg&#xE8;ne. FKBP52 est d&#xE9;phosphoryl&#xE9;e au niveau des r&#xE9;sidus tyrosine par des cellules T prot&#xE9;ine tyrosine phosphatase (TC-PTP), et TC-PTP sur-expression conduit &#xE0; une meilleure synth&#xE8;se d&#x26;#39;ADN viral second brin et une meilleure expression du transg&#xE8;ne. Dans ces &#xE9;tudes, nous avons observ&#xE9; que la perturbation de l&#x26;#39;EGFR-PTK de signalisation par un inhibiteur sp&#xE9;cifique, tyrphostine 23 (Tyr23), augment&#xE9;e de l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de transduction du simple brin AAV (ssAAV) vecteur ainsi que l&#x26;#39;auto-compl&#xE9;mentaires AAV (scAAV) vecteur . De m&#xEA;me, la tyrosine-d&#xE9;phosphorylation de FKBP52 par TC-PTP a entra&#xEE;n&#xE9; dans la transduction accrue par les deux vecteurs. Ces donn&#xE9;es sugg&#xE8;rent que l&#x26;#39;EGFR-PTK signalisation affecte &#xE9;galement les aspects de la transduction AAV autres que la synth&#xE8;se d&#x26;#39;ADN viral second brin. On le document que l&#x26;#39;inhibition de l&#x26;#39;EGFR-PTK de signalisation conduit &#xE0; l&#x26;#39;ubiquitination diminu&#xE9; de AAV2 capsides qui, &#xE0; son tour, facilite le transport nucl&#xE9;aire en limitant le prot&#xE9;asome d&#xE9;gradation de AAV. Nous avons &#xE9;galement documenter que Tyr23 m&#xE9;di&#xE9;e par augmentation de la AAV2 efficacit&#xE9; de la transduction n&#x26;#39;est pas renforc&#xE9;e par un inhibiteur sp&#xE9;cifique du prot&#xE9;asome, MG132. Ainsi, l&#x26;#39;EGFR-PTK signalisation module ubiquitine (Ub) / prot&#xE9;asome m&#xE9;diation trafic intracellulaire ainsi que FKBP52-m&#xE9;diation deuxi&#xE8;me volet de la synth&#xE8;se de l&#x26;#39;ADN AAV2 vecteurs. Ceci a des implications dans l&#x26;#39;utilisation optimale des vecteurs AAV dans la th&#xE9;rapie g&#xE9;nique.

Un double r&#xF4;le de la kinase EGFR tyrosine prot&#xE9;ine de signalisation dans l&#x26;#39;ubiquitination de AAV2 capsides virales et la synth&#xE8;se d&#x26;#39;ADN deuxi&#xE8;me brin

A 52 kd prote&#xED;na celular, la prote&#xED;na de uni&#xF3;n a FK506 (FKBP52), fosforilados en residuos de tirosina por el factor de crecimiento epid&#xE9;rmico de la tirosina quinasa del receptor de la prote&#xED;na (EGFR-PTK), inhibe el virus adeno-asociado 2 (AAV2) segundo cap&#xED;tulo de la s&#xED;ntesis del ADN y la expresi&#xF3;n del transgen. FKBP52 se desfosforilado en residuos de tirosina de las c&#xE9;lulas T de prote&#xED;nas tirosina fosfatasa (TC-PTP), y TC-PTP sobre-expresi&#xF3;n conduce a la mejora de la s&#xED;ntesis de ADN viral del segundo cap&#xED;tulo y mejora de la expresi&#xF3;n del transgen. En estos estudios, se observ&#xF3; que la perturbaci&#xF3;n de la se&#xF1;alizaci&#xF3;n de EGFR-PTK por un inhibidor espec&#xED;fico, Tyrphostin 23 (Tyr23), aumentado la eficiencia de la transducci&#xF3;n de una sola cadena AAV (ssAAV) vector, as&#xED; como el vector de auto-complementaria AAV (scAAV) . De manera similar, la tirosina-desfosforilaci&#xF3;n de FKBP52 por TC-PTP result&#xF3; en la transducci&#xF3;n de aumento por ambos vectores. Estos datos sugirieron que el EGFR-PTK se&#xF1;alizaci&#xF3;n tambi&#xE9;n afecta a los aspectos de la transducci&#xF3;n de AAV distintos de s&#xED;ntesis del ADN viral segunda hebra. Nos documento que la inhibici&#xF3;n de EGFR PTK se&#xF1;alizaci&#xF3;n conduce a ubiquitinaci&#xF3;n disminuci&#xF3;n de AAV2 c&#xE1;psidas que, a su vez, facilita el transporte nuclear limitando proteasoma mediada por la degradaci&#xF3;n de los vectores AAV. Se propone adem&#xE1;s que Tyr23 mediada por aumento de la eficiencia de transducci&#xF3;n de AAV2 no es m&#xE1;s a&#xFA;n con un inhibidor espec&#xED;fico del proteasoma, MG132. Por lo tanto, la se&#xF1;alizaci&#xF3;n de EGFR-PTK modula la ubiquitina (Ub) / proteasoma v&#xED;a mediada por el tr&#xE1;fico intracelular, as&#xED; como FKBP52 mediada la segunda l&#xED;nea de s&#xED;ntesis de ADN de AAV2 vectores. Esto tiene implicaciones en el uso &#xF3;ptimo de los vectores AAV en la terapia g&#xE9;nica.

El doble papel de tirosina quinasa del EGFR prote&#xED;na de se&#xF1;alizaci&#xF3;n en ubiquitination de AAV2 c&#xE1;psides virales y segunda l&#xED;nea de s&#xED;ntesis de ADN

52 Kd &#x7EC6;&#x80DE;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;FK506 &#x7ED3;&#x5408;&#x86CB;&#x767D; (FKBP52)&#xFF0C;&#x7531;&#x8868;&#x76AE;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6FC0;&#x9176; &#xFF08;EGFR-&#x90AE;&#x7535;&#x5C40;)&#x3001; &#x78F7;&#x9178;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x57FA;&#x5728;&#x6291;&#x5236;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; 2 &#xFF08;AAV2&#xFF09; &#x7B2C;&#x4E8C;&#x80A1; DNA &#x5408;&#x6210;&#x53CA;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x3002;FKBP52 &#x7531; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x86CB;&#x767D;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x78F7;&#x9178;&#x9176; (TC-PTP&#xFF09;&#xFF0C;dephosphorylated &#x5728;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x57FA;&#x548C; TC PTP &#x8FC7;&#x91CF;&#x8868;&#x8FBE;&#x4F1A;&#x5BFC;&#x81F4;&#x75C5;&#x6BD2;&#x6027;&#x4E8C;&#x80A1; DNA &#x5408;&#x6210;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x6539;&#x8FDB;&#x548C;&#x63D0;&#x9AD8;&#x7684;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x7684; EGFR &#x90AE;&#x7535;&#x5C40;&#x4FE1;&#x53F7;&#x7531;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#xFF0C;Tyrphostin 23 &#xFF08;Tyr23&#xFF09;&#xFF0C;&#x6444;&#x52A8;&#x589E;&#x5F3A;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x6548;&#x7387;&#x7684;&#x5355;&#x94FE;&#x57FA;&#x56E0;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; (ssAAV) &#x5411;&#x91CF;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x81EA;&#x6211;&#x8865;&#x5145;&#x7684;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; (scAAV) &#x77E2;&#x91CF;&#x3002;&#x540C;&#x6837;&#xFF0C;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x8131;&#x78F7;&#x7684; FKBP52 &#x7531; TC PTP &#x5BFC;&#x81F4;&#x589E;&#x52A0;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5411;&#x91CF;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6570;&#x636E;&#x8868;&#x660E; EGFR &#x90AE;&#x7535;&#x5C40;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8FD8;&#x4F1A;&#x5F71;&#x54CD;&#x975E;&#x75C5;&#x6BD2;&#x6027;&#x4E8C;&#x80A1; DNA &#x5408;&#x6210;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x7684;&#x65B9;&#x9762;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x6587;&#x6863; EGFR &#x90AE;&#x7535;&#x5C40;&#x4FE1;&#x53F7;&#x5BFC;&#x81F4;&#x51CF;&#x5C11;&#x7684; AAV2 capsids &#x6CDB;&#xFF0C;&#x53CD;&#x8FC7;&#x6765;&#xFF0C;&#x901A;&#x8FC7;&#x9650;&#x5236;&#x7684;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8F7D;&#x4F53;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x4F53;&#x964D;&#x89E3;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x6838;&#x8FD0;&#x8F93;&#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FD8;&#x8BB0;&#x5F55;&#x7279;&#x5B9A;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x4F53;&#x6291;&#x5236;&#x5242; MG132 &#x4E0D;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x63D0;&#x9AD8;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x6548;&#x7387; AAV2 &#x7684; Tyr23 &#x4ECB;&#x5BFC;&#x589E;&#x52A0;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;EGFR &#x90AE;&#x7535;&#x5C40;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8C03;&#x8282;&#x6CDB;&#x7D20; (Ub) / &#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x4F53;&#x901A;&#x8DEF;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x80DE;&#x5185;&#x8D29;&#x5356;&#x4EE5;&#x53CA;&#x4ECB;&#x5BFC; FKBP52 &#x7B2C;&#x4E8C;&#x80A1; DNA &#x5408;&#x6210;&#x7684; AAV2 &#x8F7D;&#x4F53;&#x3002;&#x8FD9;&#x5728;&#x6700;&#x4F73;&#x5229;&#x7528;&#x7684;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8F7D;&#x4F53;&#x5728;&#x57FA;&#x56E0;&#x6CBB;&#x7597;&#x4E2D;&#x5177;&#x6709;&#x610F;&#x4E49;&#x3002;

EGFR &#x86CB;&#x767D;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6FC0;&#x9176;&#x4FE1;&#x53F7;&#x4F20;&#x5BFC;&#x4E2D;&#x6CDB; AAV2 capsids &#x548C;&#x75C5;&#x6BD2;&#x6027;&#x4E8C;&#x80A1; DNA &#x5408;&#x6210;&#x7684;&#x53CC;&#x91CD;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

A 52 kd cellular protein, FK506-binding protein (FKBP52), phosphorylated at tyrosine residues by epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase (EGFR-PTK), inhibits adeno-associated virus 2 (AAV2) second-strand DNA synthesis and transgene expression. FKBP52 is dephosphorylated at tyrosine residues by T-cell protein tyrosine phosphatase (TC-PTP), and TC-PTP over-expression leads to improved viral second-strand DNA synthesis and improved transgene expression. In these studies, we observed that perturbation of EGFR-PTK signaling by a specific inhibitor, Tyrphostin 23 (Tyr23), augmented the transduction efficiency of the single-stranded AAV (ssAAV) vector as well as the self-complementary AAV (scAAV) vector. Similarly, tyrosine-dephosphorylation of FKBP52 by TC-PTP resulted in increased transduction by both vectors. These data suggested that EGFR-PTK signaling also affects aspects of AAV transduction other than viral second-strand DNA synthesis. We document that inhibition of EGFR-PTK signaling leads to decreased ubiquitination of AAV2 capsids which, in turn, facilitates nuclear transport by limiting proteasome-mediated degradation of AAV vectors. We also document that Tyr23-mediated increase in AAV2 transduction efficiency is not further enhanced by a specific proteasome inhibitor, MG132. Thus, EGFR-PTK signaling modulates ubiquitin (Ub)/proteasome pathway-mediated intracellular trafficking as well as FKBP52-mediated second-strand DNA synthesis of AAV2 vectors. This has implications in the optimal use of AAV vectors in gene therapy.

A dual role of EGFR protein tyrosine kinase signaling in ubiquitination of AAV2 capsids and viral second-strand DNA synthesis.

Ein 52 kd-Mobilfunk-Protein, FK506-verbindliches Protein (FKBP52), phosphoryliert an Tyrosin R&uuml;ckst&auml;nde von epidermalen Wachstumsfaktor-Protein-Tyrosinkinase (EGFR-PTK), hemmt Adeno-assoziierte Virus 2 (AAV2) Sekunde-Strang DNA Synthese und Transgene Ausdruck. FKBP52 ist dephosphorylated bei Tyrosin R&uuml;ckst&auml;nde von T-Zell-Protein-Tyrosin-Phosphatase (TC-PTP) und TC-PTP-&Uuml;berexpression f&uuml;hrt zu verbesserten virale Sekunde-Strang-DNA-Synthese und verbesserte Transgenexpression. In diesen Studien beobachteten wir, dass die St&ouml;rung der EGFR-PTK Signalisierung durch einen spezifischen Hemmer, Tyrphostin 23 (Tyr23), die Transduktion Effizienz des Vektors einzelstr&auml;ngige AAV (SsAAV) sowie der selbst-erg&auml;nzende AAV (ScAAV)-Vektor erg&auml;nzt. Ebenso f&uuml;hrte Tyrosin-Dephosphorylierung von FKBP52 von TC-PTP erh&ouml;hte Transduktion von beiden Vektoren. Diese Daten vorgeschlagen, dass die EGFR-PTK Signalisierung betrifft auch Aspekte der AAV Transduktion als virale Sekunde-Strang-DNA-Synthese. Wir dokumentieren die Hemmung der EGFR-PTK Signalling f&uuml;hrt zu verringerter Ubiquitination von AAV2 Capsids, die wiederum Nukleartransporten erleichtert durch Begrenzung der Proteasom-vermittelten Degradation der AAV-Vektoren. Au&szlig;erdem dokumentieren wir, dass Tyr23-vermittelten Anstieg AAV2 Transduktion Effizienz nicht durch eine spezifische Proteasom-Inhibitor, MG132 verst&auml;rkt wird. So signalisieren EGFR-PTK moduliert Ubiquitin (Ub) / Proteasom Weg-vermittelte intrazellul&auml;re Menschenhandel sowie FKBP52-vermittelte Sekunde-Strang-DNA-Synthese von AAV2 Vektoren. Dies hat Auswirkungen in die optimale Nutzung der AAV-Vektoren in der Gentherapie.

Eine Doppelrolle des EGFR-Protein-Tyrosinkinase signalisieren in Ubiquitination AAV2 Capsids und virale Sekunde-Strang-DNA-Synthese.

Una proteina cellulare di 52 kd, FK506-binding protein (FKBP52), fosforilato a residui di tirosina di epidermal growth factor receptor proteina tirosina chinasi (EGFR-PTK), inibisce il virus adeno-associati 2 (AAV2) secondo-strand DNA sintesi e transgene expression. FKBP52 &egrave; defosforilata a residui di tirosina da T-cellula della proteina tirosina fosfatasi (TC-PTP) e sovraespressione TC-PTP conduce alla migliorata virale secondo-strand DNA sintesi ed espressione del transgene migliorata. In questi studi, abbiamo osservato che la perturbazione di EGFR-PTK segnalazione di un inibitore specifico, 23 Tyrphostin (Tyr23), aumentata l&#39;efficienza di trasduzione del filamento singolo vettore AAV (ssAAV) cos&igrave; come il self-complementare vettore AAV (scAAV). Analogamente, tirosina-defosforilazione di FKBP52 da TC-PTP provocato aumentata trasduzione di due vettori. Questi dati suggerirono che EGFR-PTK segnalazione riguarda anche aspetti di trasduzione AAV diverso da sintesi di DNA virale secondo-filo. Documentiamo che l&#39;inibizione di segnalazione porta EGFR-PTK a ubiquitination diminuito di capsidi AAV2 che, a sua volta, facilita il trasporto nucleare limitando la degradazione mediata dal proteasoma di vettori AAV. Documentiamo anche che Tyr23-mediata aumento nell&#39;efficienza di trasduzione non &egrave; ulteriormente rafforzata da un inibitore del proteasoma specifici, MG132 AAV2. Cos&igrave;, EGFR-PTK segnalazione modula ubiquitina (Ub) / proteasoma mediata pathway intracellulari traffico nonch&eacute; FKBP52-mediata di sintesi del DNA secondo filone di AAV2 vettori. Questo ha implicazioni nell&#39;uso ottimo dei vettori AAV in terapia genica.

Un duplice ruolo della chinasi della tirosina della proteina EGFR signaling in ubiquitination di AAV2 capsidi e sintesi di DNA virale secondo-filo.

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EGFR&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x30C7;&#x30E5;&#x30A2;&#x30EB;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x306F;AAV2&#x306E;&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x306E;&#x30E6;&#x30D3;&#x30AD;&#x30C1;&#x30F3;&#x5316;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x4E8C;&#x672C;&#x9396;DNA&#x5408;&#x6210;&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;

52 Kd &#xC138;&#xD3EC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;, FK506 &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (FKBP52), &#xD45C; &#xD53C; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; (EGFR-PTK) &#xD558; &#xC5EC; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC5D0;&#xC11C; phosphorylated &#xC5B5;&#xC81C; adeno &#xC81C;&#xD734;&#xD574; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; 2 (AAV2) &#xB450; &#xBC88;&#xC9F8; &#xAC00;&#xB2E5; DNA &#xD569;&#xC131;&#xACFC; transgene &#xC2DD;. Fkbp52&#xB294; T-&#xC138;&#xD3EC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC778;&#xC0B0; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD6A8;&#xC18C; (TC-PTP) &#xD558; &#xC5EC; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC5D0;&#xC11C; dephosphorylated &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; TC PTP over-expression &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; 2 &#xAC00;&#xB2E5; DNA &#xD569;&#xC131; &#xD558; &#xC5EC; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; transgene &#xC2DD;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; EGFR PTK &#xD2B9;&#xC815; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C;, Tyrphostin 23 (Tyr23)&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC2E0;&#xD638; &#xC12D; &#xB3D9; &#xC790;&#xCCB4; &#xBCF4;&#xC644; AAV (scAAV) &#xBCA1;&#xD130; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; AAV (ssAAV) &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728; &#xC99D;&#xAC15;&#xC744; &#xAD00;&#xCC30; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB9C8;&#xCC2C;&#xAC00;&#xC9C0;&#xB85C;, TC PTP&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; fkbp52&#xC758; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0;-dephosphorylation &#xB450; &#xBCA1;&#xD130;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC99D;&#xAC00; &#xBCC0;&#xD658;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB294; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; 2 &#xAC00;&#xB2E5; DNA &#xD569;&#xC131; &#xC774;&#xC678;&#xC758; AAV &#xC804;&#xB2EC;&#xC758; &#xCE21;&#xBA74;&#xC5D0;&#xB3C4; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBBF8;&#xCE69;&#xB2C8;&#xB2E4; EGFR PTK &#xC2E0;&#xD638;&#xB97C; &#xC81C;&#xC548; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294;, &#xCC28;&#xB840;&#xB85C;, AAV &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xD504;&#xB85C;&#xD14C;&#xC544;&#xC880; &#xC911;&#xC7AC; &#xC800;&#xD558;&#xB97C; &#xC81C;&#xD55C; &#xD558; &#xC5EC; &#xD575; &#xAD50;&#xD1B5;&#xC744; &#xC6A9;&#xC774; &#xD558; &#xAC8C; AAV2 capsids&#xC758; &#xAC10;&#xC18C; ubiquitination EGFR PTK &#xC2E0;&#xD638; &#xB9AC;&#xB4DC;&#xC758; &#xADF8; &#xC800;&#xD574; &#xBB38;&#xC11C;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB610;&#xD55C; &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728;&#xC740; &#xB354; &#xD2B9;&#xC815; &#xD504;&#xB85C;&#xD14C;&#xC544;&#xC880; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C; mg132&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; AAV2 Tyr23 &#xC911;&#xC7AC; &#xC99D;&#xAC00; &#xADF8; &#xBB38;&#xC11C;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, &#xC720;&#xBE44;&#xD034;&#xD2F4; (Ub) &#xBCC0;&#xC870; EGFR PTK &#xC2E0;&#xD638; / &#xD504;&#xB85C;&#xD14C;&#xC544;&#xC880; &#xD1B5;&#xB85C; &#xC911;&#xC7AC; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; &#xBC00;&#xB9E4; AAV2 &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xB450; &#xBC88;&#xC9F8; &#xAC00;&#xB2E5; DNA &#xD569;&#xC131; FKBP52 &#xC911;&#xC7AC; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C;. &#xC774; AAV &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xCE58;&#xB8CC; &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xCD5C;&#xC801;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC758;&#xBBF8;&#xB97C;&#xAC00;&#xC9C0;&#xACE0;.

Ubiquitination AAV2 capsids &#xBC0F; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; 2 &#xAC00;&#xB2E5; DNA &#xD569;&#xC131;&#xC5D0;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2E0;&#xD638;&#xB294; EGFR &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544;&#xC758; &#xC774;&#xC911; &#xC5ED;&#xD560;.

2 &#xFF08;AAV2&#xFF09; &#x7684;&#x91CD;&#x7EC4;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8F7D;&#x4F53;&#x4E2D;&#x6B63;&#x5728;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x51E0;&#x4E2A;&#x9636;&#x6BB5;&#x6211; / &#x7B2C;&#x4E8C;&#x4E34;&#x5E8A;&#x8BD5;&#x9A8C;&#xFF0C;&#x4F46;&#x5242;&#x91CF;&#x8F83;&#x5927;&#x7684;&#x5411;&#x91CF;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53D6;&#x5F97;&#x6CBB;&#x7597;&#x7684;&#x597D;&#x5904;&#x3002;&#x77E2;&#x91CF;&#x5927;&#x5242;&#x91CF;&#x4E5F;&#x89E6;&#x53D1;&#x514D;&#x75AB;&#x53CD;&#x5E94;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x8F7D;&#x4F53;&#x7684;&#x5F88;&#x5927;&#x4E00;&#x90E8;&#x5206;&#x672A;&#x80FD;&#x6709;&#x6548;&#x5730;&#x5411;&#x6838;&#x4EA4;&#x901A;&#x548C;&#x9000;&#x5316;&#x7684;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x4F53;&#x673A;&#x68B0;&#x76EE;&#x6807;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x4E86;&#x8FD9;&#x8868;&#x76AE;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6FC0;&#x9176; &#xFF08;EGFR &#x90AE;&#x7535;&#x5C40;) &#x4FE1;&#x53F7;&#x4EA7;&#x751F;&#x8D1F;&#x9762;&#x5F71;&#x54CD;&#x8F6C;&#x5BFC; AAV2 &#x8F7D;&#x4F53;&#x7684;&#x635F;&#x5BB3;&#x6838;&#x8FD0;&#x8F93;&#x7684;&#x8F7D;&#x4F53;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FD8;&#x53D1;&#x73B0; EGFR &#x90AE;&#x7535;&#x5C40;&#x53EF;&#x4EE5; phosphorylate AAV2 capsids &#x5728;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x57FA;&#x3002;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x78F7;&#x9178; AAV2 &#x8F7D;&#x4F53;&#x6709;&#x6548;&#x8F93;&#x5165;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#xFF0C;&#x4F46;&#x4E0D;&#x80FD;&#x6362;&#x80FD;&#x5668;&#x6709;&#x6548;&#xFF0C;&#x90E8;&#x5206;&#x7531;&#x4E8E;&#x6CDB;&#x8DDF;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x4F53;&#x964D;&#x89E3;&#x7684;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; capsids&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x63A8;&#x65AD;&#x8868;&#x9762;&#x66B4;&#x9732;&#x7684;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x57FA;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x53EF;&#x80FD;&#x4F1A;&#x5141;&#x8BB8;&#x5411;&#x91CF;&#x4EE5;&#x9003;&#x907F;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x548C;&#x968F;&#x540E;&#x6CDB;&#xFF0C;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x9632;&#x6B62;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x4F53;&#x964D;&#x89E3;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x6587;&#x6863;&#x7684;&#x7F51;&#x7AD9;&#x9488;&#x5BF9;&#x5BFC;&#x81F4;&#x7684;&#x6362;&#x80FD;&#x5668; HeLa &#x7EC6;&#x80DE;&#x7EA6; 10 &#x500D;&#x7684;&#x8F7D;&#x4F53;&#x751F;&#x4EA7;&#x8FD1;&#x8FD0;&#x8F93;&#x91CF;&#x66F4;&#x6709;&#x6548;&#x5730;&#x5728;&#x4F53;&#x5185;&#x5728;&#x65E5;&#x5FD7;&#x8F83;&#x77E2;&#x91CF;&#x5242;&#x91CF;&#x66F4;&#x591A;&#x6709;&#x6548;&#x7684;&#x4F53;&#x5916;&#x53CA;&#x5C0F;&#x9F20;&#x809D;&#x8868;&#x9762;&#x66B4;&#x9732;&#x7684;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x57FA;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x3002;&#x5927;&#x7EA6; 10 &#x500D;&#x51CF;&#x5C11;&#x7684;&#x77E2;&#x91CF;&#x5242;&#x91CF;&#x4E5F;&#x751F;&#x4EA7;&#x6CBB;&#x7597;&#x6C34;&#x5E73;&#x7684;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x56E0;&#x5B50; IX &#xFF08;F.IX&#xFF09;&#x3002;&#x589E;&#x52A0;&#x7684;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x6548;&#x7387;&#x7684;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x7A81;&#x53D8;&#x8F7D;&#x4F53;&#x662F;&#x7531;&#x4E8E;&#x7F3A;&#x4E4F;&#x8863;&#x58F3;&#x6CDB;&#x548C;&#x6539;&#x8FDB;&#x80DE;&#x5185;&#x8D29;&#x5356;&#x5411;&#x6838;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7814;&#x7A76;&#x5DF2;&#x5BFC;&#x81F4;&#x80FD;&#x591F;&#x9AD8;&#x6548;&#x7387;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x5242;&#x91CF;&#x8F83;&#x4F4E;&#xFF0C;&#x5176;&#x4F7F;&#x7528;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x57FA;&#x56E0;&#x6CBB;&#x7597;&#x4E2D;&#x5177;&#x6709;&#x91CD;&#x8981;&#x610F;&#x4E49;&#x7684;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8F7D;&#x4F53;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x8FDB;&#x5C55;&#x3002;

&#x4E0B;&#x4E00;&#x4EE3;&#x7684; 2 &#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8F7D;&#x4F53;&#xFF1A; &#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x70B9;&#x7A81;&#x53D8;&#x5BFC;&#x81F4;&#x5242;&#x91CF;&#x8F83;&#x4F4E;&#x7684;&#x9AD8;&#x6548;&#x7387;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x3002;

Recombinant adeno-associated virus 2 (AAV2) vectors are in use in several Phase I/II clinical trials, but relatively large vector doses are needed to achieve therapeutic benefits. Large vector doses also trigger an immune response as a significant fraction of the vectors fails to traffic efficiently to the nucleus and is targeted for degradation by the host cell proteasome machinery. We have reported that epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase (EGFR-PTK) signaling negatively affects transduction by AAV2 vectors by impairing nuclear transport of the vectors. We have also observed that EGFR-PTK can phosphorylate AAV2 capsids at tyrosine residues. Tyrosine-phosphorylated AAV2 vectors enter cells efficiently but fail to transduce effectively, in part because of ubiquitination of AAV capsids followed by proteasome-mediated degradation. We reasoned that mutations of the surface-exposed tyrosine residues might allow the vectors to evade phosphorylation and subsequent ubiquitination and, thus, prevent proteasome-mediated degradation. Here, we document that site-directed mutagenesis of surface-exposed tyrosine residues leads to production of vectors that transduce HeLa cells approximately 10-fold more efficiently in vitro and murine hepatocytes nearly 30-fold more efficiently in vivo at a log lower vector dose. Therapeutic levels of human Factor IX (F.IX) are also produced at an approximately 10-fold reduced vector dose. The increased transduction efficiency of tyrosine-mutant vectors is due to lack of capsid ubiquitination and improved intracellular trafficking to the nucleus. These studies have led to the development of AAV vectors that are capable of high-efficiency transduction at lower doses, which has important implications in their use in human gene therapy.

Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses.

Vecteurs recombinants ad&#xE9;no-associ&#xE9;s virus 2 (AAV2) sont utilis&#xE9;s dans la phase I de plusieurs essais cliniques de, mais des doses relativement importantes de vecteurs sont n&#xE9;cessaires pour obtenir des avantages th&#xE9;rapeutiques. Doses grand vecteur aussi d&#xE9;clencher une r&#xE9;ponse immunitaire sous forme de fraction importante des vecteurs &#xE9;choue &#xE0; la circulation efficace dans le noyau et est pr&#xE9;vue pour la d&#xE9;gradation par le prot&#xE9;asome machines cellule h&#xF4;te. Nous avons signal&#xE9; que l&#x26;#39;&#xE9;piderme du r&#xE9;cepteur du facteur de croissance tyrosine prot&#xE9;ine kinase (EGFR-PTK) de signalisation affecte n&#xE9;gativement la transduction par les vecteurs AAV2 en alt&#xE9;rant le transport nucl&#xE9;aire des vecteurs. Nous avons &#xE9;galement observ&#xE9; que l&#x26;#39;EGFR-PTK peut phosphoryler AAV2 capsides au niveau des r&#xE9;sidus tyrosine. Tyrosine-phosphoryl&#xE9;es AAV2 vecteurs p&#xE9;n&#xE8;trent dans les cellules de mani&#xE8;re efficace, mais ne parviennent pas &#xE0; transduire efficacement, en partie parce que d&#x26;#39;ubiquitination de capsides AAV suivies par la d&#xE9;gradation par le prot&#xE9;asome. Nous avons pens&#xE9; que les mutations des r&#xE9;sidus expos&#xE9;s en surface tyrosine pourrait permettre aux vecteurs d&#x26;#39;&#xE9;chapper &#xE0; la phosphorylation et l&#x26;#39;ubiquitination ult&#xE9;rieure et, par cons&#xE9;quent, d&#x26;#39;&#xE9;viter la d&#xE9;gradation par le prot&#xE9;asome. Ici, on document qui mutagen&#xE8;se dirig&#xE9;e de la surface expos&#xE9;e des r&#xE9;sidus de tyrosine-conduit &#xE0; la production de vecteurs qui transduire des cellules HeLa environ 10 fois plus efficacement in vitro et h&#xE9;patocytes murins pr&#xE8;s de 30 fois plus efficacement in vivo &#xE0; une dose inf&#xE9;rieure vecteur journal. Niveaux th&#xE9;rapeutiques de facteur IX humain (F.IX) sont &#xE9;galement produits &#xE0; une dose r&#xE9;duite vecteur environ 10 fois. L&#x26;#39;efficacit&#xE9; de transduction accrue de la tyrosine-mutants vecteurs est due au manque d&#x26;#39;ubiquitination de la capside et l&#x26;#39;am&#xE9;lioration trafic intracellulaire vers le noyau. Ces &#xE9;tudes ont conduit au d&#xE9;veloppement de vecteurs AAV qui sont capables de haute efficacit&#xE9; de transduction &#xE0; des doses inf&#xE9;rieures, ce qui a des implications importantes dans leur utilisation en th&#xE9;rapie g&#xE9;nique humaine.

La prochaine g&#xE9;n&#xE9;ration de virus ad&#xE9;no-associ&#xE9; 2 Vecteurs: mutations ponctuelles dans tyrosines plomb &#xE0; haute efficacit&#xE9; de transduction &#xE0; des doses inf&#xE9;rieures

Rekombinante Adeno-assoziierte Virus 2 (AAV2) Vektoren sind im Einsatz in mehreren Phase I / II Studien, aber relativ gro&szlig;e Vektor-Dosen sind erforderlich, um den therapeutische Nutzen zu erzielen. Gro&szlig;e Vektor Dosen ausl&ouml;sen auch eine Immunantwort, wie ein betr&auml;chtlicher Anteil der Vektoren nicht effizient zum Kern Verkehr und f&uuml;r Abbau der Host Zelle Proteasom-Maschine gezielt ist. Wir haben berichtet, dass dieser epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor Proteintyrosinkinase (EGFR-PTK) Signalisierung negativ Transduktion von AAV2 Vektoren beeinflusst, indem die Nukleartransporten der Vektoren zu beeintr&auml;chtigen. Wir haben auch festgestellt, dass die EGFR-PTK AAV2 Capsids an Tyrosin R&uuml;ckst&auml;nde phosphoryliert werden kann. Tyrosin-phosphoryliert AAV2 Vektoren geben Sie Zellen effizient, aber nicht effektiv, teilweise wegen der AAV Capsids gefolgt von Proteasom-vermittelten Abbau Ubiquitination zur&uuml;ckwirken. Wir glaubten, dass Mutationen der Oberfl&auml;che exponierten Tyrosin R&uuml;ckst&auml;nde die Vektoren Phosphorylierung und nachfolgende Ubiquitination zu entgehen und verhindern so, Proteasom-vermittelten Abbau erm&ouml;glichen k&ouml;nnte. Hier dokumentieren wir die Site-verwiesene Mutagenese Oberfl&auml;che exponierten Tyrosin R&uuml;ckst&auml;nde f&uuml;hrt zur Produktion von Vektoren, die HeLa-Zellen ca. 10fach verbesserter zur&uuml;ckwirken mehr effizient in vitro und murinen Hepatozyten, die fast 30-fold effizienter in-vivo in einer Protokolldatei niedriger Vektor-Dosis. Therapeutische Ebenen des menschlichen Faktor IX (F.IX) werden auch bei einer Dosis von ca. 10fach verbesserter reduzierte Vektor hergestellt. Die erh&ouml;hte Transduktion Effizienz der Tyrosin-Mutant-Vektoren ist wegen des Mangels von Kapsid Ubiquitination und verbesserte intrazellul&auml;re Menschenhandel zum Kern. Diese Studien f&uuml;hrten zu die Entwicklung der AAV-Vektoren, die hocheffiziente Signaltransduktion bei niedrigeren Dosen sind in ihrer Verwendung in menschlichen Gentherapie hat wichtige Implikationen.

N&auml;chste Generation der Adeno-assoziierte Virus 2 Vektoren: Punktmutationen in Tyrosines zu hocheffizienten Signaltransduktion bei niedrigeren Dosen f&uuml;hren.

Recombinant virus adeno-associati 2 (AAV2) vettori sono in uso in diverse fase / studi clinici II, ma dosi relativamente grande vettore sono necessari per ottenere benefici terapeutici. Dosi grandi vettoriale anche innescano una risposta immunitaria come una frazione significativa dei vettori non riesce a efficiente del traffico nel nucleo e si rivolge per degradazione dalla macchina host cell del proteasoma. Abbiamo segnalato che epidermal growth factor receptor tirosina chinasi di proteina (EGFR-PTK) segnalazione negativa colpisce trasduzione di AAV2 vettori da compromettere trasporto nucleare dei vettori. Abbiamo anche osservato che EGFR-PTK pu&ograve; fosforilare AAV2 capsidi a residui di tirosina. Tirosina fosforilata AAV2 vettori Inserisci celle in modo efficiente ma non riescono a trasdurre efficacemente, in parte a causa di ubiquitination dei capsidi AAV seguita dalla degradazione mediata dal proteasoma. Abbiamo ragionato che mutazioni dei residui di tirosina esposti in superficie potrebbero consentire i vettori a eludere la fosforilazione e successive ubiquitination e, quindi, prevenire la degradazione mediata dal proteasoma. Qui, abbiamo documento che sito-directed mutagenesi dei residui di tirosina superficie esposta conduce alla produzione di vettori che trasducono le cellule HeLa circa 10 volte pi&ugrave; efficientemente in vitro e murini epatociti quasi 30-fold pi&ugrave; efficientemente in vivo a una dose di vettore registro inferiore. Livelli terapeutici di umano fattore IX (F.IX) sono prodotti anche a una dose di circa 10 volte ridotto vettore. L&#39;efficienza aumentata trasduzione della tirosina-mutante vettori &egrave; dovuto alla mancanza di capside ubiquitination e traffico intracellulare migliorata nel nucleo. Questi studi hanno portato allo sviluppo di vettori AAV capaci di trasduzione ad alta efficienza a basse dosi, che ha importanti implicazioni nel loro uso nella terapia del gene umano.

Prossima generazione di vettori di virus adeno-associati 2: mutazioni puntiformi tirosine portare a trasduzione ad alta efficienza a basse dosi.

&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30A2;&#x30C7;&#x30CE;&#x968F;&#x4F34;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;2&#xFF08;AAV2&#xFF09;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x7B2C;I / II&#x76F8;&#x81E8;&#x5E8A;&#x8A66;&#x9A13;&#x3067;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x304C;&#x3001;&#x6BD4;&#x8F03;&#x7684;&#x5927;&#x898F;&#x6A21;&#x306A;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306E;&#x7528;&#x91CF;&#x306F;&#x3001;&#x6CBB;&#x7642;&#x52B9;&#x679C;&#x3092;&#x9054;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5FC5;&#x8981;&#x3068;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306E;&#x304B;&#x306A;&#x308A;&#x306E;&#x90E8;&#x5206;&#x304C;&#x6838;&#x306B;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x30C8;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30C3;&#x30AF;&#x306B;&#x969C;&#x5BB3;&#x304C;&#x767A;&#x751F;&#x3057;&#x3001;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x7D30;&#x80DE;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x6A5F;&#x69CB;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x5206;&#x89E3;&#x306E;&#x5BFE;&#x8C61;&#x3068;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x5927;&#x898F;&#x6A21;&#x306A;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306E;&#x7528;&#x91CF;&#x306F;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x514D;&#x75AB;&#x5FDC;&#x7B54;&#x3092;&#x8A98;&#x767A;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x4E0A;&#x76AE;&#x6210;&#x9577;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#xFF08;EGFR-PTK&#xFF09;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x306F;&#x8CA0;&#x306E;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306E;&#x6838;&#x8F38;&#x9001;&#x3092;&#x640D;&#x306A;&#x3046;&#x3053;&#x3068;&#x3067;AAV2&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5F62;&#x8CEA;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53CA;&#x307C;&#x3059;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x5831;&#x544A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;EGFR-PTK&#x306F;&#x3001;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x6B8B;&#x57FA;&#x3067;AAV2&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x3092;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;AAV2&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x5165;&#x529B;&#x3057;&#x3066;&#x3082;&#x3001;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x5206;&#x89E3;&#x306B;&#x7D9A;&#x3044;&#x3066;&#x306E;AAV&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x306E;&#x30E6;&#x30D3;&#x30AD;&#x30C1;&#x30F3;&#x5316;&#x306E;&#x4E00;&#x74B0;&#x3067;&#x3001;&#x52B9;&#x679C;&#x7684;&#x306B;&#x4F1D;&#x9054;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x306A;&#x3044;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x8868;&#x9762;&#x9732;&#x51FA;&#x306E;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x306F;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x304C;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x5F8C;&#x306E;&#x30E6;&#x30D3;&#x30AD;&#x30C1;&#x30F3;&#x5316;&#x3092;&#x56DE;&#x907F;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x3001;&#x5F93;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x5206;&#x89E3;&#x3092;&#x9632;&#x3050;&#x304B;&#x3082;&#x3057;&#x308C;&#x306A;&#x3044;&#x3068;&#x8003;&#x3048;&#x305F;&#x3002;&#x8868;&#x9762;&#x9732;&#x51FA;&#x306E;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x90E8;&#x4F4D;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x8A98;&#x767A;&#x6CD5;&#x306F;&#x3001;&#x7D04;10&#x500D;&#x3001;&#x3088;&#x308A;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;in vitro&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x306E;&#x809D;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x7D04;30&#x500D;&#x3001;&#x3088;&#x308A;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x751F;&#x4F53;&#x5185;&#x3067;&#x306E;&#x30ED;&#x30B0;&#x4F4E;&#x3044;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x91CF;&#x3067;&#x5F62;&#x8CEA;&#x5C0E;&#x5165;&#x3057;&#x305F;HeLa&#x7D30;&#x80DE;&#x306F;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x751F;&#x7523;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x6587;&#x66F8;&#x3002;&#x30D2;&#x30C8;&#x7B2C;IX&#x56E0;&#x5B50;&#xFF08;F.IX&#xFF09;&#x306E;&#x6CBB;&#x7642;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3082;&#x7D04;10&#x500D;&#x306E;&#x6E1B;&#x5C11;&#x306E;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x91CF;&#x3067;&#x751F;&#x7523;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x5909;&#x7570;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x4F1D;&#x9054;&#x52B9;&#x7387;&#x306F;&#x3001;&#x30AB;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x30E6;&#x30D3;&#x30AD;&#x30C1;&#x30F3;&#x5316;&#x3068;&#x6838;&#x3078;&#x306E;&#x6539;&#x826F;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x8F38;&#x9001;&#x306E;&#x6B20;&#x5982;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x3082;&#x306E;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x3001;&#x30D2;&#x30C8;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x6CBB;&#x7642;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x3067;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x610F;&#x5473;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x4F4E;&#x7528;&#x91CF;&#x3067;&#x9AD8;&#x52B9;&#x7387;&#x4F1D;&#x9054;&#x3001;&#x53EF;&#x80FD;&#x3067;&#x3042;&#x308B;AAV&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

&#x30A2;&#x30C7;&#x30CE;&#x968F;&#x4F34;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;2&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306E;&#x6B21;&#x4E16;&#x4EE3;&#xFF1A;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x306E;&#x70B9;&#x5909;&#x7570;&#x306F;&#x4F4E;&#x7528;&#x91CF;&#x3067;&#x9AD8;&#x52B9;&#x7387;&#x4F1D;&#x9054;&#x3059;&#x308B;&#x30EA;&#x30FC;&#x30C9;

&#xC7AC;&#xC870;&#xD569; adeno &#xC81C;&#xD734;&#xD574; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; 2 (AAV2) &#xC5EC;&#xB7EC; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCA1;&#xD130;&#xB294; / 2 &#xCC28; &#xC784;&#xC0C1; &#xC2DC;&#xD5D8;, &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC0C1;&#xB300;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD070; &#xBCA1;&#xD130; &#xBCF5;&#xC6A9; &#xCE58;&#xB8CC; &#xD61C;&#xD0DD;&#xC744; &#xB2EC;&#xC131; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xD544;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD070; &#xBCA1;&#xD130; &#xBCF5;&#xC6A9;&#xB7C9; &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC77C;&#xBD80; &#xD2B8;&#xB798;&#xD53D;&#xC744; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD575;&#xC744; &#xC2E4;&#xD328; &#xD558; &#xACE0; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xC138;&#xD3EC; &#xD504;&#xB85C;&#xD14C;&#xC544;&#xC880; &#xAE30;&#xACC4; &#xC131;&#xB2A5; &#xC800;&#xD558;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xBA74;&#xC5ED; &#xBC18;&#xC751;&#xC744; &#xBC29; &#xC544; &#xC1E0;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xADF8; &#xD45C; &#xD53C; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xD0A4; (EGFR PTK) &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xC2E0;&#xD638; &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xD575; &#xC6B4;&#xC1A1;&#xC744; &#xBC29;&#xD574; &#xD558; &#xC5EC; AAV2 &#xBCA1;&#xD130;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC804;&#xB2EC; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBCF4;&#xACE0; &#xC788;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB610;&#xD55C; &#xAD00;&#xCC30; PTK EGFR &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC5D0;&#xC11C; AAV2 capsids phosphorylate &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. AAV2 &#xBCA1;&#xD130; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; phosphorylated &#xC138;&#xD3EC;&#xB97C; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC785;&#xB825; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; transduce &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC77C;&#xBD80; &#xD504;&#xB85C;&#xD14C;&#xC544;&#xC880; &#xC911;&#xC7AC; &#xC800;&#xD558; &#xC21C;&#xC774; AAV capsids&#xC758; ubiquitination &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xC2E4;&#xD328; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0; &#xB178;&#xCD9C; &#xB41C; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC758; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654; &#xBC0F; &#xD6C4;&#xC18D; ubiquitination&#xC744; &#xD68C;&#xD53C; &#xD558; &#xACE0;, &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, &#xD504;&#xB85C;&#xD14C;&#xC544;&#xC880; &#xC911;&#xC7AC; &#xC800;&#xD558;&#xB97C; &#xBC29;&#xC9C0; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; &#xBCA1;&#xD130; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xAD8C;&#xC720;. &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0;&#xC11C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xBB38;&#xC11C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xAC10;&#xB3C5; &#xD45C;&#xBA74; &#xB178;&#xCD9C; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; mutagenesis &#xD5EC;&#xB7EC; &#xC138;&#xD3EC; &#xC57D; &#xC0AC;&#xC9C4; transduce &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC744; &#xB354; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xCCB4; &#xC678; &#xBC0F; murine hepatocytes &#xAC70;&#xC758; 30-fold &#xBCF4;&#xB2E4; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; in vivo &#xB85C;&#xADF8; &#xB0AE;&#xC740; &#xBCA1;&#xD130; &#xBCF5;&#xC6A9;&#xB7C9;&#xC5D0; &#xB9AC;&#xB4DC;. &#xCE58;&#xB8CC; &#xC218;&#xC900; &#xC778;&#xAC04; &#xC778;&#xC790; IX (F.IX)&#xC758; &#xC57D; &#xC0AC;&#xC9C4; &#xAC10;&#xC18C; &#xBCA1;&#xD130; &#xBCF5;&#xC6A9;&#xB7C9;&#xC5D0; &#xC0DD;&#xC131; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xC99D;&#xAC00; &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728; capsid ubiquitination&#xC640; &#xD575;&#xC5D0; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; &#xBC00;&#xB9E4;&#xC758; &#xBD80;&#xC871; &#xB54C;&#xBB38; &#xC774;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB294; &#xC778;&#xAC04; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xCE58;&#xB8CC;&#xC5D0; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBBF8;&#xCE58;&#xBBC0;&#xB85C; &#xB0AE;&#xC740; &#xBCF5;&#xC6A9;&#xB7C9; &#xACE0;&#xD6A8;&#xC728; &#xBCC0;&#xD658; AAV &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC744; &#xC774;&#xB04C;&#xC5B4; &#xB0C8;&#xB2E4;.

&#xCC28;&#xC138;&#xB300; adeno &#xC81C;&#xD734;&#xD574; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; 2 &#xBCA1;&#xD130;: &#xC810; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; tyrosines&#xC5D0; &#xB354; &#xB0AE;&#xC740; &#xBCF5;&#xC6A9;&#xB7C9;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728; &#xC774;&#xC5B4;&#xC9C8;.

Recombinantes vectores de virus adeno-asociado 2 (AAV2) est&#xE1;n en uso en la Fase Los I / II de ensayos cl&#xED;nicos, pero las dosis de vectores relativamente grandes son necesarios para alcanzar los beneficios terap&#xE9;uticos. Las dosis grandes vectores tambi&#xE9;n desencadenar una respuesta inmune que una fracci&#xF3;n significativa de los vectores no al tr&#xE1;fico de manera eficiente al n&#xFA;cleo y est&#xE1; destinada a la degradaci&#xF3;n por el proteasoma la maquinaria de la c&#xE9;lula hu&#xE9;sped. Nos han informado de que el factor de crecimiento epid&#xE9;rmico receptor de la prote&#xED;na tirosina quinasa (PTK-EGFR) de se&#xF1;alizaci&#xF3;n afecta negativamente a la transducci&#xF3;n de AAV2 vectores al afectar el transporte nuclear de los vectores. Tambi&#xE9;n hemos observado que el EGFR-PTK puede fosforilar AAV2 c&#xE1;psides en residuos de tirosina. La tirosina fosforilados AAV2 vectores de entrar en las c&#xE9;lulas de manera eficiente, pero no de la transducci&#xF3;n de manera eficaz, en parte debido a la ubiquitinaci&#xF3;n de c&#xE1;psidas AAV seguido por proteosoma mediada por la degradaci&#xF3;n. Se razon&#xF3; que las mutaciones de los residuos expuestos en la superficie de tirosina podr&#xED;a permitir que los vectores de evadir fosforilaci&#xF3;n y ubiquitinaci&#xF3;n posterior y, por lo tanto, prevenir proteasoma mediada por la degradaci&#xF3;n. En este sentido, el documento que mutag&#xE9;nesis dirigida al sitio de la superficie expuesta residuos de tirosina conduce a la producci&#xF3;n de vectores que transduce c&#xE9;lulas HeLa aproximadamente 10 veces m&#xE1;s eficaz in vitro y hepatocitos murinos casi 30 veces m&#xE1;s eficaz in vivo en una dosis de registro vectorial inferior. Los niveles terap&#xE9;uticos del factor IX humano (F.IX) tambi&#xE9;n se producen en un vector de dosis aproximadamente 10 veces menor. El aumento de la eficacia de transducci&#xF3;n de la tirosina-mutantes vectores se debe a la falta de ubiquitinaci&#xF3;n c&#xE1;pside y el tr&#xE1;fico intracelular de la mejora en el n&#xFA;cleo. Estos estudios han conducido al desarrollo de vectores AAV que son capaces de transducci&#xF3;n de alta eficiencia en dosis m&#xE1;s bajas, lo cual tiene implicaciones importantes en su uso en terapia de genes humanos.

Pr&#xF3;xima generaci&#xF3;n de virus adeno-asociado 2 Vectores: mutaciones puntuales en tirosinas de plomo a la transducci&#xF3;n de alta eficacia a dosis m&#xE1;s bajas

&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x4E0A;&#x76AE;&#x6210;&#x9577;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#xFF08;EGFR-PTK&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x304C;&#x8CA0;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x8F38;&#x9001;&#x3001;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x30A2;&#x30C7;&#x30CE;&#x968F;&#x4F34;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;2&#xFF08;AAV2&#xFF09;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x5C0E;&#x5165;&#x52B9;&#x7387;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x8A18;&#x8F09;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5177;&#x4F53;&#x7684;&#x306B;&#x306F;&#x3001;EGFR-PTK&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x306E;&#x963B;&#x5BB3;&#x306F;&#x3001;&#x9806;&#x756A;&#x306B;&#x3001;AAV2&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x5206;&#x89E3;&#x3092;&#x5236;&#x9650;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E;&#x6838;&#x8F38;&#x9001;&#x3092;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;AAV2&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30E6;&#x30D3;&#x30AD;&#x30C1;&#x30F3;&#x5316;&#x306E;&#x6E1B;&#x5C11;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x73FE;&#x5728;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;AAV&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x304C;&#x5B9F;&#x969B;&#x306B;in vitro&#x3067;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306B;&#x304A;&#x3044;&#x3066;EGFR-PTK&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x6B8B;&#x57FA;&#x304C;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x306E;AAV&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x7684;&#x5B8C;&#x5168;&#x6027;&#x3092;&#x4FDD;&#x6301;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;AAV&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x306E;&#x5BFE;&#x5FDC;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x5165;&#x529B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x5F7C;&#x3089;&#x306E;&#x4F1D;&#x9054;&#x52B9;&#x7387;&#x304C;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x524A;&#x6E1B;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x6E1B;&#x5C11;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x305E;&#x308C;&#x7D04;68&#xFF05;&#x3068;&#x7D04;74&#xFF05;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x4E00;&#x672C;&#x9396;AAV&#xFF08;ssAAV&#xFF09;&#x3068;&#x81EA;&#x5DF1;&#x76F8;&#x88DC;&#x7684;AAV&#xFF08;scAAV&#xFF09;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x5F62;&#x8CEA;&#x5C0E;&#x5165;&#x52B9;&#x7387;&#x4EE5;&#x6765;&#x3001;&#x969C;&#x5BB3;&#x3001;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x4E8C;&#x672C;&#x9396;DNA&#x306E;&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x3082;&#x306E;&#x3067;&#x306F;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x304B;&#x3089;&#x6838;&#x3078;&#x306E;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;AAV&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x305D;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x8F38;&#x9001;&#x304C;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x30AB;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x30E6;&#x30D3;&#x30AD;&#x30C1;&#x30F3;&#x5316;&#x306E;&#x4E0B;&#x6D41;&#x306E;&#x5F71;&#x97FF;&#x3082;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x306E;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53D7;&#x3051;&#x308B;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x304C;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30BD;&#x30FC;&#x30E0;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x5206;&#x89E3;&#x306B;&#x7D9A;&#x3044;&#x3066;&#x306E;AAV&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x306E;&#x30E6;&#x30D3;&#x30AD;&#x30C1;&#x30F3;&#x5316;&#x304B;&#x3089;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x3001;&#x30D2;&#x30C8;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x6CBB;&#x7642;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;AAV&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x6700;&#x9069;&#x306A;&#x4F7F;&#x7528;&#x3067;&#x610F;&#x5473;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D5;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x3067;&#x306E;AAV&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x306E;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x306B;&#x65B0;&#x305F;&#x306A;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x8F38;&#x9001;&#x3068;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x306B;AAV2&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306E;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;

&#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xD45C; &#xD53C; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; (PTK EGFR) &#xC2E0;&#xD638; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; adeno &#xC81C;&#xD734;&#xD574; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; 2 (AAV2)&#xC758; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; &#xC778;&#xC2E0; &#xB9E4;&#xB9E4; &#xBC0F; &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728;&#xC131; &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBB38;&#xC11C;&#xD654; &#xBCA1;&#xD130;. &#xD2B9;&#xD788; EGFR PTK &#xC2DC;&#xADF8;&#xB110;&#xB9C1;&#xC758; &#xC800;&#xD574; &#xCC28;&#xB840;&#xB85C; AAV2 &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xD504;&#xB85C;&#xD14C;&#xC544;&#xC880; &#xC911;&#xC7AC; &#xC800;&#xD558;&#xB97C; &#xC81C;&#xD55C; &#xD558; &#xC5EC; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xD575; &#xC804;&#xC1A1; &#xC6A9;&#xC774; &#xD558; &#xAC8C; AAV2 capsid &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xAC10;&#xC18C; ubiquitination &#xB9AC;&#xB4DC;. &#xD604;&#xC7AC; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C;&#xB294; AAV capsids &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xCC38;&#xC73C;&#xB85C; &#xC218; phosphorylated &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC5D0;&#xC11C; EGFR PTK &#xC5EC; &#xCCB4; &#xC678; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0; phosphorylated AAV capsids &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xBB34;&#xACB0;&#xC131;&#xC744; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558; &#xACE0; &#xAD00;&#xCC30; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, phosphorylated AAV &#xBCA1;&#xD130; &#xC785;&#xB825; &#xC140; unphosphorylated &#xB4E4; &#xCC98;&#xB7FC; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;, &#xBE44;&#xB85D; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728;&#xC774; &#xD06C;&#xAC8C; &#xC904;&#xC5B4;&#xB4ED;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xAC10;&#xC18C; &#xC7A5;&#xC560; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; 2 &#xAC00;&#xB2E5; DNA &#xD569;&#xC131;&#xC73C;&#xB85C; &#xC778;&#xD574; &#xC774;&#xD6C4; &#xB450; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; AAV (ssAAV)&#xC758; &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728; &#xC774;&#xBA70; &#xC790;&#xCCB4; &#xBCF4;&#xC644; AAV (scAAV) &#xBCA1;&#xD130;&#xB294; &#xAC01;&#xAC01; &#xC57D; 68%, &#xC57D; 74%&#xB85C; &#xAC10;&#xC18C; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB610;&#xD55C; &#xADF8; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; phosphorylated AAV &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD575; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; &#xC778;&#xC2E0; &#xB9E4;&#xB9E4;&#xB294; &#xD06C;&#xAC8C; &#xAC10;&#xC18C;, AAV capsids&#xC758; ubiquitination&#xC5D0;&#xC11C; &#xACB0;&#xACFC;&#xAC00; &#xB4A4; &#xD504;&#xB85C;&#xD14C;&#xC544;&#xC880; &#xC911;&#xC7AC; &#xC800;&#xD558; capsid ubiquitination&#xC758; &#xB2E4;&#xC6B4;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB9BC; &#xACB0;&#xACFC; &#xB610;&#xD55C; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBC1B;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xAD00;&#xCC30; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB294; &#xC778;&#xAC04; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xCE58;&#xB8CC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; AAV &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xCD5C;&#xC801;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBBF8;&#xCE58;&#xBBC0;&#xB85C; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xB77C;&#xC774;&#xD504; &#xC0AC;&#xC774;&#xD074;&#xC5D0; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC5D0;&#xC11C; AAV capsids&#xC758; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654;&#xC758; &#xC5ED;&#xD560;&#xC5D0; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

AAV2 &#xBCA1;&#xD130; &#xBC0F; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; &#xB9E4;&#xB9E4; &#xBC0F; transgene &#xC2DD;&#xC5D0; &#xADF8; &#xACB0;&#xACFC;&#xC758; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654;.

Hemos documentado que el factor de crecimiento epid&#xE9;rmico receptor de la prote&#xED;na tirosina quinasa (PTK-EGFR) de se&#xF1;alizaci&#xF3;n afecta negativamente el tr&#xE1;fico intracelular y la eficiencia de la transducci&#xF3;n de los vectores recombinantes virus adeno-asociado 2 (AAV2). Espec&#xED;ficamente, la inhibici&#xF3;n de EGFR PTK se&#xF1;alizaci&#xF3;n conduce a ubiquitinaci&#xF3;n disminuci&#xF3;n de AAV2 prote&#xED;nas de la c&#xE1;pside, que a su vez, facilita el transporte nuclear viral mediante la limitaci&#xF3;n de proteasoma mediada por la degradaci&#xF3;n de AAV2 vectores. En el presente estudio, se observ&#xF3; que c&#xE1;psides AAV hecho puede ser fosforilada en residuos de tirosina por el EGFR-PTK en los ensayos de fosforilaci&#xF3;n in vitro y que fosforilados c&#xE1;psides AAV mantener su integridad estructural. Sin embargo, aunque fosforilados vectores AAV entrar en las c&#xE9;lulas tan eficientemente como sus hom&#xF3;logos no fosforilados, su eficacia de transducci&#xF3;n se reduce significativamente. Esta reducci&#xF3;n no se debe a la alteraci&#xF3;n de la s&#xED;ntesis de ADN viral del segundo cap&#xED;tulo ya que la eficiencia de transducci&#xF3;n de ambos una sola cadena AAV (ssAAV) y la auto-complementarios vectores AAV (scAAV) se reduce en aproximadamente un 68% y aproximadamente el 74%, respectivamente. Tambi&#xE9;n se observ&#xF3; que el tr&#xE1;fico intracelular de la tirosina fosforilados vectores AAV desde el citoplasma al n&#xFA;cleo se redujo significativamente, lo que resulta de la ubiquitinaci&#xF3;n de c&#xE1;psidas AAV seguido por proteosoma mediada por la degradaci&#xF3;n, a pesar de las consecuencias aguas abajo de la c&#xE1;pside de ubiquitinaci&#xF3;n tambi&#xE9;n puede verse afectada por la fosforilaci&#xF3;n de la tirosina-. Estos estudios proporcionan nuevos conocimientos sobre el papel de la fosforilaci&#xF3;n de la tirosina-de c&#xE1;psidas AAV en diversas etapas del ciclo de vida del virus, lo cual tiene implicaciones en el uso &#xF3;ptimo de los vectores AAV recombinantes en terapia g&#xE9;nica en humanos.

La tirosina-fosforilaci&#xF3;n de AAV2 Vectores y sus consecuencias sobre el tr&#xE1;fico viral intracelular y expresi&#xF3;n transg&#xE9;nica

&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x8BB0;&#x5F55;&#x5728;&#x6848;&#x8868;&#x76AE;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6FC0;&#x9176; &#xFF08;EGFR &#x90AE;&#x7535;&#x5C40;) &#x4FE1;&#x53F7;&#x4EA7;&#x751F;&#x6D88;&#x6781;&#x5F71;&#x54CD;&#x80DE;&#x5185;&#x7684;&#x8D29;&#x8FD0;&#x548C;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x6548;&#x7387;&#x91CD;&#x7EC4;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; 2 &#xFF08;AAV2&#xFF09; &#x7684;&#x5411;&#x91CF;&#x3002;&#x5177;&#x4F53;&#x800C;&#x8A00;&#xFF0C;&#x6291;&#x5236;&#x8868;&#x76AE;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x90AE;&#x7535;&#x5C40;&#x4FE1;&#x53F7;&#x5BFC;&#x81F4;&#x51CF;&#x5C11;&#x6CDB;&#x7684; AAV2 &#x8863;&#x58F3;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x53CD;&#x8FC7;&#x6765;&#x6709;&#x52A9;&#x4E8E;&#x75C5;&#x6BD2;&#x6027;&#x6838;&#x8FD0;&#x8F93;&#x901A;&#x8FC7;&#x9650;&#x5236; AAV2 &#x8F7D;&#x4F53;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x4F53;&#x964D;&#x89E3;&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; capsids &#x53EF;&#x4EE5;&#x786E;&#x5B9E;&#x78F7;&#x9178;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x57FA;&#x5728;&#x7531; EGFR &#x90AE;&#x7535;&#x5C40;&#x5728;&#x4F53;&#x5916;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x68C0;&#x6D4B;&#x548C;&#x78F7;&#x9178;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; capsids &#x4FDD;&#x7559;&#x5176;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684;&#x5B8C;&#x6574;&#x6027;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x867D;&#x7136;&#x78F7;&#x9178;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8F7D;&#x4F53; unphosphorylated &#x540C;&#x884C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x6709;&#x6548;&#x8F93;&#x5165;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#xFF0C;&#x5176;&#x4F20;&#x5BFC;&#x6548;&#x7387;&#x4F1A;&#x5927;&#x5927;&#x964D;&#x4F4E;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x51CF;&#x5C11;&#x4E0D;&#x662F;&#x56E0;&#x4E3A;&#x53D7;&#x635F;&#x75C5;&#x6BD2;&#x6027;&#x4E8C;&#x80A1; DNA &#x5408;&#x6210;&#x4EE5;&#x6765;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x6548;&#x7387;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5355;&#x94FE;&#x57FA;&#x56E0;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; (ssAAV) &#x548C;&#x81EA;&#x6211;&#x8865;&#x5145;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; (scAAV) &#x5411;&#x91CF;&#x5927;&#x7EA6; 68%&#x548C;&#x7EA6; 74%&#xFF0C;&#x5206;&#x522B;&#x4E0B;&#x8DCC;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FD8;&#x6CE8;&#x610F;&#x5230;&#x80DE;&#x5185;&#x8D29;&#x5356;&#x7684;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x78F7;&#x9178;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8F7D;&#x4F53;&#x4ECE;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x5411;&#x6838;&#x4F1A;&#x5927;&#x5927;&#x964D;&#x4F4E;&#xFF0C;&#x7ED3;&#x679C;&#x4ECE;&#x6CDB;&#x7684;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; capsids &#x968F;&#x540E;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x4F53;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684;&#x9000;&#x5316;&#xFF0C;&#x867D;&#x7136;&#x8863;&#x58F3;&#x6CDB;&#x4E0B;&#x6E38;&#x540E;&#x679C;&#x4E5F;&#x53EF;&#x80FD;&#x53D7;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7814;&#x7A76;&#x5728;&#x75C5;&#x6BD2;&#x7684;&#x751F;&#x547D;&#x5468;&#x671F;&#xFF0C;&#x5728;&#x91CD;&#x7EC4;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8F7D;&#x4F53;&#x5728;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x57FA;&#x56E0;&#x6CBB;&#x7597;&#x7684;&#x6700;&#x4F73;&#x5229;&#x7528;&#x5177;&#x6709;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x65B0;&#x7684;&#x89C1;&#x89E3;&#xFF0C;&#x5230;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7684;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; capsids &#x4E2D;&#x5404;&#x6B65;&#x9AA4;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7684; AAV2 &#x8F7D;&#x4F53;&#x548C;&#x5176;&#x5BF9;&#x75C5;&#x6BD2;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5185;&#x8D29;&#x8FD0;&#x548C;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x540E;&#x679C;&#x3002;

We have documented that epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase (EGFR-PTK) signaling negatively affects intracellular trafficking and transduction efficiency of recombinant adeno-associated virus 2 (AAV2) vectors. Specifically, inhibition of EGFR-PTK signaling leads to decreased ubiquitination of AAV2 capsid proteins, which in turn, facilitates viral nuclear transport by limiting proteasome-mediated degradation of AAV2 vectors. In the present studies, we observed that AAV capsids can indeed be phosphorylated at tyrosine residues by EGFR-PTK in in vitro phosphorylation assays and that phosphorylated AAV capsids retain their structural integrity. However, although phosphorylated AAV vectors enter cells as efficiently as their unphosphorylated counterparts, their transduction efficiency is significantly reduced. This reduction is not due to impaired viral second-strand DNA synthesis since transduction efficiency of both single-stranded AAV (ssAAV) and self-complementary AAV (scAAV) vectors is decreased by approximately 68% and approximately 74%, respectively. We also observed that intracellular trafficking of tyrosine-phosphorylated AAV vectors from cytoplasm to nucleus is significantly decreased, which results from ubiquitination of AAV capsids followed by proteasome-mediated degradation, although downstream consequences of capsid ubiquitination may also be affected by tyrosine-phosphorylation. These studies provide new insights into the role of tyrosine-phosphorylation of AAV capsids in various steps in the virus life cycle, which has implications in the optimal use of recombinant AAV vectors in human gene therapy.

Tyrosine-phosphorylation of AAV2 vectors and its consequences on viral intracellular trafficking and transgene expression.

Nous avons d&#xE9;montr&#xE9; que l&#x26;#39;&#xE9;piderme du r&#xE9;cepteur du facteur de croissance tyrosine prot&#xE9;ine kinase (EGFR-PTK) de signalisation affecte n&#xE9;gativement le trafic intracellulaire et efficacit&#xE9; de la transduction des vecteurs recombinants de virus 2 (AAV2) ad&#xE9;no-associ&#xE9;s. Plus pr&#xE9;cis&#xE9;ment, l&#x26;#39;inhibition de l&#x26;#39;EGFR-PTK signalisation conduit &#xE0; l&#x26;#39;ubiquitination diminu&#xE9; de AAV2 prot&#xE9;ines de la capside, qui &#xE0; son tour, facilite le transport nucl&#xE9;aire virale en limitant la d&#xE9;gradation par le prot&#xE9;asome des AAV2 vecteurs. Dans les pr&#xE9;sentes &#xE9;tudes, nous avons observ&#xE9; que capsides AAV peuvent en effet &#xEA;tre phosphoryl&#xE9;e au niveau des r&#xE9;sidus tyrosine par EGFR-PTK dans des essais in vitro la phosphorylation et que les capsides AAV phosphoryl&#xE9;es conservent leur int&#xE9;grit&#xE9; structurelle. Cependant, bien que phosphoryl&#xE9;es vecteurs AAV p&#xE9;n&#xE9;trer dans les cellules aussi efficacement que leurs homologues non phosphoryl&#xE9;s, leur efficacit&#xE9; de transduction est consid&#xE9;rablement r&#xE9;duite. Cette r&#xE9;duction n&#x26;#39;est pas due &#xE0; une mauvaise synth&#xE8;se d&#x26;#39;ADN viral second brin depuis efficacit&#xE9; de la transduction des deux monocat&#xE9;naire AAV (ssAAV) et l&#x26;#39;auto-compl&#xE9;mentaires (AAV scAAV) vecteurs est diminu&#xE9; d&#x26;#39;environ 68% et environ 74%, respectivement. Nous avons &#xE9;galement observ&#xE9; que le trafic intracellulaire des vecteurs AAV tyrosine-phosphoryl&#xE9;s du cytoplasme au noyau est consid&#xE9;rablement diminu&#xE9;, ce qui r&#xE9;sulte de l&#x26;#39;ubiquitination de capsides AAV suivies par le prot&#xE9;asome de d&#xE9;gradation, bien que les cons&#xE9;quences en aval de l&#x26;#39;ubiquitination capside peut &#xE9;galement &#xEA;tre affect&#xE9;e par la tyrosine-phosphorylation. Ces &#xE9;tudes fournissent de nouveaux aper&#xE7;us sur le r&#xF4;le de la tyrosine-phosphorylation de capsides AAV dans les diff&#xE9;rentes &#xE9;tapes du cycle de vie du virus, qui a des implications dans l&#x26;#39;utilisation optimale des vecteurs recombinants AAV dans la th&#xE9;rapie g&#xE9;nique humaine.

Tyrosine-phosphorylation de AAV2 Vecteurs et ses cons&#xE9;quences sur le trafic viral intracellulaire et l&#x26;#39;expression du transg&#xE8;ne

Wir haben dokumentiert, dass die epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Protein Tyrosin Kinase (EGFR-PTK) Signalisierung beeintr&auml;chtigt intrazellul&auml;re Menschenhandel und Transduktion Effizienz des rekombinanten Adeno-assoziierte Virus 2 (AAV2) Vektoren. Insbesondere f&uuml;hrt die Hemmung der EGFR-PTK Signalisierung zu verminderte Ubiquitination AAV2 Kapsid-Proteine, die wiederum virale Nukleartransporten erleichtert durch Begrenzung der Proteasom-vermittelten Degradation der AAV2 Vektoren. In den vorliegenden Studien beobachteten wir, dass AAV Capsids tats&auml;chlich an Tyrosin R&uuml;ckst&auml;nde von EGFR-PTK bei in-vitro-Phosphorylierung-Assays phosphoryliert werden k&ouml;nnen und dass phosphorylierten AAV Capsids ihre strukturelle Integrit&auml;t beizubehalten. Obwohl phosphorylierte AAV-Vektoren Zellen so effizient wie die entsprechenden unphosphorylated eintragen, wird ihre Transduktion Effizienz jedoch erheblich verringert. Diese Reduktion ist nicht aufgrund gest&ouml;rter virale Sekunde-Strang DNA Synthese seit Transduktion Effizienz der beiden einzelstr&auml;ngige AAV (SsAAV) und selbst-erg&auml;nzende AAV (ScAAV) Vektoren sanken um ca. 68 % und etwa 74 %, bzw.. Wir beobachteten auch, dass die intrazellul&auml;re Handel mit Tyrosin-phosphoryliert AAV Vektoren aus Zytoplasma, Zellkern erheblich verringert wird das Proteasom-vermittelten Erniedrigung, Ergebnisse von Ubiquitination AAV Capsids folgte zwar flussabw&auml;rts folgen Kapsid Ubiquitination auch von Tyrosin-Phosphorylierung betroffen sein k&ouml;nnten. Diese Studien liefern neue Erkenntnisse &uuml;ber die Rolle der Tyrosin-Phosphorylierung von AAV Capsids in verschiedenen Schritten im Lebenszyklus Virus, die Auswirkungen bei der optimalen Verwendung rekombinanter AAV-Vektoren in menschlichen Gentherapie hat.

Tyrosin-Phosphorylierung von AAV2 Vektoren und ihre Folgen auf virale intrazellul&auml;re Menschenhandel und Transgene Ausdruck.

Abbiamo documentato che epidermal growth factor receptor proteina tirosina chinasi (EGFR-PTK) segnalazione lede efficienza traffico e trasduzione intracellulare di recombinant virus adeno-associati 2 (AAV2) vettori. In particolare, l&#39;inibizione di EGFR-PTK segnalazione porta a ubiquitination diminuzione delle proteine del capside AAV2, che a sua volta, facilita il trasporto nucleare virale limitando la degradazione mediata dal proteasoma di AAV2 vettori. Negli studi presenti, abbiamo osservato che capsidi AAV infatti possono essere fosforilate a residui di tirosina di EGFR-PTK fosforilazione in vitro dosaggi e che fosforilate capsidi AAV mantengono la loro integrit&agrave; strutturale. Tuttavia, anche se fosforilate vettori AAV inserire celle efficientemente come loro controparti unphosphorylated, loro efficienza di trasduzione &egrave; significativamente ridotta. Questa riduzione non &egrave; dovuto ad alterata sintesi di DNA secondo-filo virale poich&eacute; l&#39;efficienza di trasduzione di entrambi single-stranded AAV (ssAAV) e auto-complementare vettori AAV (scAAV) &egrave; diminuito di circa 68% e circa il 74%, rispettivamente. Abbiamo anche osservato che traffico intracellulare di vettori AAV tirosina fosforilata dal citoplasma al nucleo &egrave; notevolmente diminuito, che risultati di ubiquitination di capsidi AAV seguirono da degradazione mediata dal proteasoma, sebbene le conseguenze a valle del capside ubiquitination possono anche essere colpite da fosforilazione della tirosina. Questi studi forniscono nuove intuizioni nel ruolo di fosforilazione della tirosina di capsidi AAV in varie fasi il ciclo di vita del virus, che ha implicazioni nell&#39;uso ottimo dei vettori AAV ricombinante nella terapia del gene umano.

Fosforilazione della tirosina di AAV2 vettori e le sue conseguenze sull&#39;espressione virale di traffico e il transgene intracellulare.

Astratta i nostri studi hanno dimostrato che co-iniezione di virus adeno-associati single-stranded convenzionale 2 vettori (ssAAV2) che trasportano il verde avanzato gene proteina fluorescente (EGFP) con scAAV2-proteina fosfatasi-5 (PP5) vettori e di auto-complementare (sc) AAV2-T cell proteina tirosina fosfatasi (TC-PTP) ha provocato un aumento di circa magazzino a 16 posizioni in espressione di EGFP epatociti murini primari in vivo [Jayandharan, G.R., Zhong, L., Li, B., KachniarzB. e Srivastava, A. (2008). Gene Ther. 15, 1287-1293]. Negli studi presenti, questa strategia &egrave; stata ulteriormente ottimizzata per ottenere l&#39;espressione del transgene dosi ridotte vector/helper virus. Queste includevano l&#39;uso di virus helper scAAV contenente (1) degli epatociti specifici promotori, capsidi AAV2 tirosina-mutante (2) e (3) ulteriori vettori AAV sierotipo conosciuti a trasdurre in modo efficiente gli epatociti. Il promotore del hepatocyte specifici transtiretina (TTR) era circa 6 - a 7 volte pi&ugrave; efficiente rispetto al promotore di Rous sarcoma virus (RSV); capsidi AAV2 tirosina-mutante erano circa 6 - a 11 volte pi&ugrave; efficiente i capsidi AAV2 wild-type; e il virus helper AAV8 sierotipo era circa 16-fold pi&ugrave; efficiente AAV2 sierotipo helper virus. Con queste modifiche, la dose di vettore del virus helper potrebbe essere ulteriormente ridotto di circa 50-volte. Ultima, coadministration di virus helper scAAV8-PP5 aumentata espressione di coagulazione fattore IX da un vettore di ssAAV2 di circa 7-a 10 volte, ottenendo livelli terapeutici a basse dosi di vettore. In una qualsiasi di queste condizioni sperimentali &egrave; stato osservato nessun effetto negativo su epatociti. La strategia presentata qui dovrebbe essere adattabile a qualsiasi ssAAV transgene cassetta e, specificamente, applicazioni fegato-regia di ssAAV2 vettori contenenti geni pi&ugrave; grandi che non possono essere incapsidato nei vettori scAAV.

Ottimizzato virus adeno-associati (AAV)-virus helper fosfatasi-5 proteine di trasduzione efficiente fegato da vettori di AAV single-stranded: terapeutico espressione del fattore IX a dosi ridotte vettoriale.

&#x62BD;&#x8C61;&#x6211;&#x4EEC;&#x7814;&#x7A76;&#x8868;&#x660E;&#xFF0C;&#x5171;&#x6CE8;&#x5C04;&#x7684;&#x5E38;&#x89C4;&#x5355;&#x7EDE;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; 2 (ssAAV2) &#x8F7D;&#x4F53;&#x589E;&#x5F3A;&#x578B;&#x7684;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D; (EGFP) &#x4E0E;&#x81EA;&#x6211;&#x8865;&#x5145; (sc) AAV2 T &#x7EC6;&#x80DE;&#x86CB;&#x767D;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x78F7;&#x9178;&#x9176; (TC PTP) &#x548C; scAAV2 &#x86CB;&#x767D;&#x78F7;&#x9178;&#x9176;-5 (PP5) &#x8F7D;&#x4F53;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x5BFC;&#x81F4;&#x7684;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;&#x8868;&#x8FBE;&#x5728;&#x539F;&#x5C0F;&#x9F20;&#x809D;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4F53;&#x5185;&#x7EA6; 16-fold &#x589E;&#x52A0; [Jayandharan&#x3001; G.R.&#x3001; &#x949F;&#x3001; L.&#x3001; &#x674E;&#x3001; B.&#x3001; KachniarzB.&#x548C;&#x65AF;&#x91CC;&#xFF0C;A.&#xFF08;2008 &#x5E74;&#xFF09;&#x3002;&#x57FA;&#x56E0;&#x90A3;&#x91CC;&#x3002;15 1287&#x5E74; 1293&#x5E74;]&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E00;&#x6218;&#x7565;&#x662F;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x4F18;&#x5316;&#xFF0C;&#x8FBE;&#x5230;&#x51CF;&#x5C11;&#x7684;&#x77E2;&#x91CF;/&#x52A9;&#x624B;&#x75C5;&#x6BD2;&#x5242;&#x91CF;&#x7684;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5305;&#x62EC; scAAV &#x8F85;&#x52A9;&#x75C5;&#x6BD2;&#x5305;&#x542B; (1) &#x809D;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x3001; (2) &#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x7A81;&#x53D8; AAV2 capsids &#x548C; (3) &#x5176;&#x4ED6;&#x5DF2;&#x77E5;&#x9AD8;&#x6548;&#x6362;&#x80FD;&#x5668;&#x7684;&#x809D;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8840;&#x6E05;&#x578B;&#x8F7D;&#x4F53;&#x7684;&#x4F7F;&#x7528;&#x3002;&#x809D;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7279;&#x5B9A;&#x53D1;&#x73B0; &#xFF08;TTR&#xFF09; &#x542F;&#x52A8;&#x5B50;&#x662F;&#x5927;&#x7EA6; 6-&#x5BF9; 7 &#x500D;&#x6BD4;&#x52B3;&#x65AF;&#x8089;&#x7624;&#x75C5;&#x6BD2; (RSV) &#x542F;&#x52A8;&#x5B50; &#xFF1B; &#x6548;&#x7387;&#x66F4;&#x9AD8;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x7A81;&#x53D8; AAV2 capsids &#x662F;&#x5927;&#x7EA6; 6-&#x5230; 11 &#x500D;&#x6BD4;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; AAV2 capsids &#xFF1B; &#x6548;&#x7387;&#x66F4;&#x9AD8;&#x800C; AAV8 &#x8840;&#x6E05;&#x578B; helper &#x75C5;&#x6BD2;&#x5927;&#x7EA6;&#x6BD4; AAV2 &#x8840;&#x6E05;&#x578B; helper &#x75C5;&#x6BD2;&#x6570;&#x91CF;&#x66F4;&#x6709;&#x6548;&#x7387;&#x3002;&#x7ECF;&#x8FC7;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x4FEE;&#x6539;&#xFF0C;&#x5E2E;&#x52A9;&#x5668;&#x75C5;&#x6BD2;&#x7684;&#x77E2;&#x91CF;&#x5242;&#x91CF;&#x53EF;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x51CF;&#x5C11;&#x7531;&#x5927;&#x7EA6; 50 &#x500D;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;scAAV8 PP5 helper &#x75C5;&#x6BD2;&#x5408;&#x7528;&#x589E;&#x52A0;&#x51DD;&#x8840;&#x56E0;&#x5B50; IX ssAAV2 &#x5411;&#x91CF;&#x4ECE;&#x5927;&#x7EA6; 7-&#x5230; 10 &#x500D;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x5B9E;&#x73B0;&#x5411;&#x91CF;&#x5242;&#x91CF;&#x8F83;&#x4F4E;&#x7684;&#x6CBB;&#x7597;&#x6C34;&#x5E73;&#x3002;&#x4EFB;&#x4F55;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x6709;&#x4EBA;&#x5BF9;&#x809D;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6CA1;&#x6709;&#x4E0D;&#x5229;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;&#x8FD9;&#x91CC;&#x63D0;&#x51FA;&#x7684;&#x6218;&#x7565;&#x5E94;&#x8BE5;&#x9002;&#x5E94;&#x4EFB;&#x4F55; ssAAV &#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x5361;&#x5E26;&#x548C;&#xFF0C;&#x5177;&#x4F53;&#x5730;&#x8BF4;&#xFF0C;&#x809D;&#x810F;&#x5B9A;&#x5411;&#x5E94;&#x7528; ssAAV2 &#x8F7D;&#x4F53;&#x4E0D;&#x80FD; encapsidated scAAV &#x5411;&#x91CF;&#x4E2D;&#x7684;&#x5927;&#x57FA;&#x56E0;&#x3002;

&#x4F18;&#x5316;&#x7684;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; (&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#xFF09;-&#x5355;&#x7EDE;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8F7D;&#x4F53;&#x9AD8;&#x6548;&#x809D;&#x4F20;&#x5BFC;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x78F7;&#x9178;&#x9176; 5 &#x8F85;&#x52A9;&#x75C5;&#x6BD2;&#xFF1A; &#x56E0;&#x5B50; IX &#x5728;&#x51CF;&#x5C11;&#x7684;&#x77E2;&#x91CF;&#x5242;&#x91CF;&#x6CBB;&#x7597;&#x8868;&#x8FBE;&#x3002;

Abstract Our studies have shown that coinjection of conventional single-stranded adeno-associated virus 2 (ssAAV2) vectors carrying the enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene with self-complementary (sc) AAV2-T cell protein tyrosine phosphatase (TC-PTP) and scAAV2-protein phosphatase-5 (PP5) vectors resulted in an approximately 16-fold increase in EGFP expression in primary murine hepatocytes in vivo [Jayandharan, G.R., Zhong, L., Li, B., Kachniarz, B., and Srivastava, A. (2008). Gene Ther. 15, 1287-1293]. In the present studies, this strategy was further optimized to achieve transgene expression at reduced vector/helper virus doses. These included the use of scAAV helper viruses containing (1) hepatocyte-specific promoters, (2) tyrosine-mutant AAV2 capsids, and (3) additional AAV serotype vectors known to efficiently transduce hepatocytes. The hepatocyte-specific transthyretin (TTR) promoter was approximately 6- to 7-fold more efficient than the Rous sarcoma virus (RSV) promoter; tyrosine-mutant AAV2 capsids were approximately 6- to 11-fold more efficient than the wild-type AAV2 capsids; and the AAV8 serotype helper virus was approximately 16-fold more efficient than AAV2 serotype helper virus. With these modifications, the vector dose of the helper virus could be further reduced by approximately 50-fold. Last, coadministration of scAAV8-PP5 helper virus increased coagulation factor IX expression from an ssAAV2 vector by approximately 7- to 10-fold, thereby achieving therapeutic levels at lower vector doses. No adverse effect on hepatocytes was observed under any of these experimental conditions. The strategy presented here should be adaptable to any ssAAV transgene cassette and, specifically, liver-directed applications of ssAAV2 vectors containing larger genes that cannot be encapsidated in scAAV vectors.

Optimized adeno-associated virus (AAV)-protein phosphatase-5 helper viruses for efficient liver transduction by single-stranded AAV vectors: therapeutic expression of factor IX at reduced vector doses.

R&#xE9;sum&#xE9; Nos &#xE9;tudes ont montr&#xE9; que co-injection de classique simple brin virus ad&#xE9;no-associ&#xE9; 2 (ssAAV2) vecteurs portant le renforcement de la prot&#xE9;ine fluorescente verte (EGFP) g&#xE8;ne avec l&#x26;#39;auto-compl&#xE9;mentaire (sc) AAV2-T de la prot&#xE9;ine phosphatase cellulaire tyrosine (TC-PTP) et scAAV2-prot&#xE9;ine phosphatase-5 (PP5) vecteurs a entra&#xEE;n&#xE9; une augmentation d&#x26;#39;environ 16 fois dans l&#x26;#39;expression EGFP dans des h&#xE9;patocytes primaires murins in vivo [Jayandharan, GR, Zhong, L., Li, B., Kachniarz, B., et Srivastava , A. (2008). Ther Gene. 15, 1287-1293]. Dans les pr&#xE9;sentes &#xE9;tudes, cette strat&#xE9;gie a en outre &#xE9;t&#xE9; optimis&#xE9;e pour obtenir l&#x26;#39;expression du transg&#xE8;ne &#xE0; une r&#xE9;duction des doses vecteur / virus auxiliaire. Il s&#x26;#39;agit notamment de l&#x26;#39;utilisation de virus helper scAAV contenant (1) h&#xE9;patocytes promoteurs sp&#xE9;cifiques, (2) tyrosine-mutantes AAV2 capsides, et (3) suppl&#xE9;mentaires vecteurs AAV de s&#xE9;rotype connus pour transduire efficacement les h&#xE9;patocytes. L&#x26;#39;h&#xE9;patocyte sp&#xE9;cifique transthyr&#xE9;tine (TTR) promoteur &#xE9;tait d&#x26;#39;environ 6 - &#xE0; 7 fois plus efficace que le virus du sarcome de Rous (RSV); tyrosine-mutantes AAV2 capsides &#xE9;taient environ 6 - &#xE0; 11 fois plus efficace que la AAV2 de type sauvage capsides, et le virus de s&#xE9;rotype AAV8 aide &#xE9;tait d&#x26;#39;environ 16 fois plus efficace que AAV2 virus helper s&#xE9;rotype. Avec ces modifications, la dose vecteur du virus helper pourrait &#xEA;tre r&#xE9;duite d&#x26;#39;environ 50 fois. Enfin, l&#x26;#39;administration concomitante de virus scAAV8-PP5 aide accrue facteur IX de coagulation expression d&#x26;#39;un vecteur ssAAV2 d&#x26;#39;environ 7 - &#xE0; 10 fois, et atteindre ainsi des niveaux th&#xE9;rapeutiques &#xE0; des doses inf&#xE9;rieures vecteur. Aucun effet ind&#xE9;sirable n&#x26;#39;a &#xE9;t&#xE9; observ&#xE9; sur des h&#xE9;patocytes en vertu de ces conditions exp&#xE9;rimentales. La strat&#xE9;gie pr&#xE9;sent&#xE9;e ici devrait &#xEA;tre adaptable &#xE0; n&#x26;#39;importe quelle cassette ssAAV transg&#xE8;ne et, applications sp&#xE9;cifiquement, le foie-dirig&#xE9;s de ssAAV2 vecteurs contenant de grandes g&#xE8;nes qui ne peuvent pas &#xEA;tre encapsid&#xE9; dans des vecteurs scAAV.

Optimisation de virus ad&#xE9;no-associ&#xE9; (AAV)-prot&#xE9;ine phosphatase-5 Helper virus pour la transduction du foie efficace par des vecteurs AAV simple brin: Expression th&#xE9;rapeutique du facteur IX &#xE0; des doses vecteur r&#xE9;duit

Abstrakte unsere Studien haben gezeigt, dass 2K des konventionellen einzelstr&auml;ngige Adeno-assoziierte Virus 2 (ssAAV2)-Vektoren, die Durchf&uuml;hrung des erweiterten gr&uuml;n fluoreszierendes Protein (EGFP) Gen mit selbst-erg&auml;nzende (sc) AAV2-T Zelle Protein-Tyrosin-Phosphatase (TC-PTP) und scAAV2-Protein Phosphatase-5 (PP5) Vektoren etwa versechzehnfacht und produziert Zunahme EGFP Ausdruck in prim&auml;ren murinen Hepatozyten in-vivo ergab [Jayandharan, g.r., Zhong, L., Li, B., KachniarzB., und Srivastava, A. (2008). Gene Ther. 15, 1287 &ndash; 1293]. In den vorliegenden Studien wurde diese Strategie weiter optimiert, um Transgenexpression bei reduzierten Vektor/Helfer Virus Dosen zu erreichen. Dazu geh&ouml;ren die Verwendung von ScAAV Helfer Viren, (1) Hepatozyten-spezifische Promotoren, (2) Tyrosin-Mutant AAV2 Capsids und (3) zus&auml;tzliche AAV-Serotyp-Vektoren, die bekannt, um effizient Hepatozyten zur&uuml;ckwirken. Der Projekttr&auml;ger Hepatozyten-spezifische Transthyretin (TTR) war etwa 6 - bis 7 - 8-fach effizienter als der Projekttr&auml;ger des Rous-Sarkom-Virus (RSV); Tyrosin-Mutant AAV2 Capsids wurden ca. 6 - bis 11 - 8-fach effizienter als der Wildtyp AAV2 Capsids; und das AAV8-Serotyp-Helfer-Virus war etwa 16fache effizienter als AAV2 Serotyp Helfer Virus. Mit diesen &Auml;nderungen konnte die Vektor-Dosis des Virus Helfer weiter von etwa 50-fache reduziert werden. Schlie&szlig;lich erh&ouml;ht gleichzeitige Gabe des scAAV8-PP5 Helfer Virus Koagulation Faktor IX Ausdruck aus einer ssAAV2-Vektor von etwa 7-zu 10-fache, so eine therapeutische Ebenen bei niedrigeren Dosen in Vektor. Ohne Beeintr&auml;chtigung der Hepatozyten wurde unter dieser experimentellen Bedingungen beobachtet. Die hier vorgestellte Strategie sollte jeder SsAAV Transgene Kassette und insbesondere unter der Regie von Leber Anwendungen von ssAAV2 Vektoren, gr&ouml;&szlig;ere Gene enthalten, die Encapsidated in ScAAV Vektoren nicht anpassungsf&auml;hig.

Optimierte Adeno-assoziierte Virus (AAV)-Protein Phosphatase-5 Helfer Viren f&uuml;r effiziente Leber Transduktion von einzeln-angeschwemmte AAV Vektoren: therapeutische Ausdruck des Faktors IX bei reduzierten Vektor-Dosen.

&#x62BD;&#x8C61;&#x7684;&#x306A;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x3001;&#x81EA;&#x5DF1;&#x76F8;&#x88DC;&#x7684;&#xFF08;SC&#xFF09;AAV2-T&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;&#xFF08;TC-PTP&#xFF09;&#x3067;&#x5F37;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7DD1;&#x8272;&#x86CD;&#x5149;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08;EGFP&#xFF09;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x904B;&#x3076;&#x5F93;&#x6765;&#x306E;&#x4E00;&#x672C;&#x9396;&#x306E;&#x30A2;&#x30C7;&#x30CE;&#x968F;&#x4F34;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;2&#x306E;&#x540C;&#x6642;&#x6CE8;&#x5165;&#xFF08;ssAAV2&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x304C;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3068;scAAV2&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;5&#xFF08;PP5&#xFF09;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x304C;in vivo [Jayandharan&#x3001;GR&#x3001;&#x5FE0;&#x3001;L.&#x3001;&#x674E;&#x3001;B.&#x3001;Kachniarz&#x3001;B.&#x3068;Srivastava&#x3055;&#x3093;&#x306E;&#x4E3B;&#x306A;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x809D;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;EGFP&#x767A;&#x73FE;&#x306E;&#x7D04;16&#x500D;&#x306B;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x3001;A.&#xFF08;2008&#xFF09;&#x3002;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x71B1;&#x3002; 15&#x65E5;&#x3001;1287&#x5E74;&#x304B;&#x3089;1293&#x5E74;]&#x3002;&#x73FE;&#x5728;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x6226;&#x7565;&#x3092;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x4F4E;&#x6E1B;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;/&#x30D8;&#x30EB;&#x30D1;&#x30FC;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E;&#x7528;&#x91CF;&#x3067;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#x9054;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x6700;&#x9069;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x3092;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x809D;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x5F62;&#x8CEA;&#x5C0E;&#x5165;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x77E5;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#xFF08;1&#xFF09;&#x809D;&#x7D30;&#x80DE;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3001;&#xFF08;2&#xFF09;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x5909;&#x7570;AAV2&#x30AB;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#xFF08;3&#xFF09;&#x8FFD;&#x52A0;&#x306E;AAV&#x8840;&#x6E05;&#x578B;&#x306E;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x3092;&#x542B;&#x6709;&#x3059;&#x308B;scAAV&#x30D8;&#x30EB;&#x30D1;&#x30FC;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x5909;&#x7570;AAV2&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x306F;&#x7D04;6&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F; -  11&#x500D;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;AAV2&#x3088;&#x308A;&#x3082;&#x3001;&#x30E9;&#x30A6;&#x30B9;&#x8089;&#x816B;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#xFF08;RSV&#xFF09;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3088;&#x308A;&#x3082;7&#x500D;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A; - &#x809D;&#x7D30;&#x80DE;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30EC;&#x30C1;&#x30F3;&#xFF08;TTR&#xFF09;&#x30D7;&#x30ED;&#x30E2;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306F;&#x7D04;6&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x30AB;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;AAV8&#x8840;&#x6E05;&#x578B;&#x30D8;&#x30EB;&#x30D1;&#x30FC;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306F;&#x3001;&#x7D04;16&#x500D;AAV2&#x8840;&#x6E05;&#x578B;&#x30D8;&#x30EB;&#x30D1;&#x30FC;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x3088;&#x308A;&#x3082;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5909;&#x66F4;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x30D8;&#x30EB;&#x30D1;&#x30FC;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x6295;&#x4E0E;&#x91CF;&#x3092;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x7D04;50&#x500D;&#x306B;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;scAAV8-PP5&#x30D8;&#x30EB;&#x30D1;&#x30FC;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E;&#x540C;&#x6642;&#x6295;&#x4E0E;&#x306F;&#x3001;&#x7D04;7&#x3067;ssAAV2&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x304B;&#x3089;&#x51DD;&#x56FA;&#x7B2C;IX&#x56E0;&#x5B50;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#x5897;&#x52A0; -  10&#x500D;&#x306B;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3088;&#x308A;&#x4F4E;&#x3044;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x7528;&#x91CF;&#x3067;&#x6CBB;&#x7642;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3092;&#x9054;&#x6210;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x809D;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x6709;&#x5BB3;&#x306A;&#x5F71;&#x97FF;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x306E;&#x3044;&#x305A;&#x308C;&#x304B;&#x306E;&#x6761;&#x4EF6;&#x3067;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x7D39;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B;&#x6226;&#x7565;&#x306F;&#x3001;&#x3069;&#x306E;ssAAV&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30AB;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3068;&#x3001;scAAV&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x3067;&#x5305;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x306A;&#x3044;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x542B;&#x3080;ssAAV2&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306E;&#x3001;&#x7279;&#x306B;&#x809D;&#x81D3;&#x6307;&#x5411;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;&#x9069;&#x5FDC;&#x53EF;&#x80FD;&#x3067;&#x306A;&#x3051;&#x308C;&#x3070;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;

&#x4E00;&#x672C;&#x9396;AAV&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x809D;&#x4F1D;&#x9054;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x6700;&#x9069;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30A2;&#x30C7;&#x30CE;&#x968F;&#x4F34;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#xFF08;AAV&#xFF09;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30BC;-5&#x30D8;&#x30EB;&#x30D1;&#x30FC;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#xFF1A;&#x524A;&#x6E1B;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x7528;&#x91CF;&#x3067;&#x7B2C;IX&#x56E0;&#x5B50;&#x306E;&#x6CBB;&#x7642;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;

&#xCD94;&#xC0C1; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xAE30;&#xC874;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; adeno &#xAD00;&#xB828; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xC758; &#xADF8; coinjection &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xB179;&#xC0C9; &#xD615;&#xAD11; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (EGFP) &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC790;&#xCCB4; &#xBCF4;&#xC644; (sc) AAV2-T &#xC138;&#xD3EC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC778;&#xC0B0; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD6A8;&#xC18C; (TC PTP)&#xC640; scAAV2 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC778;&#xC0B0; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD6A8;&#xC18C;-5 (PP5) &#xBCA1;&#xD130; &#xAE30;&#xBCF8; murine hepatocytes &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74;&#xC5D0;&#xC11C; EGFP &#xC2DD;&#xC5D0; &#xC57D; 16-fold &#xC99D;&#xAC00; &#xADC0;&#xCC29;&#xB418; &#xB4E4;&#xACE0; 2 (ssAAV2) &#xBCA1;&#xD130; [Jayandharan, G.R., Zhong, L., Li, 2., Kachniarz2., &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; Srivastava, &#xB300;&#xB2F5; (2008). &#xC9C4; &#xAC70;&#xAE30;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. 15, 1287-1293]&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD604;&#xC7AC; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC774; &#xC804;&#xB7B5; &#xCD94;&#xAC00; transgene &#xC2DD; &#xAC10;&#xC18C; &#xBCA1;&#xD130;/&#xB3C4;&#xC6B0;&#xBBF8; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xBCF5;&#xC6A9;&#xB7C9;&#xC744; &#xB2EC;&#xC131; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xCD5C;&#xC801;&#xD654; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; scAAV &#xB3C4;&#xC6B0;&#xBBF8; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; (1) hepatocyte &#xD2B9;&#xC815; &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778;, (2) &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; AAV2 capsids, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; hepatocytes transduce &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4; (3) &#xCD94;&#xAC00; AAV serotype &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568;. Hepatocyte &#xD2B9;&#xC815; transthyretin (TTR) &#xBAA8;&#xD130;&#xB294; &#xC57D; 6-&#xC744; 7 &#xBC30; &#xB77C;&#xC6B0; &#xC2A4; &#xC721; &#xC885; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; (RSV) &#xBC1C;&#xAE30;&#xC778;; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; AAV2 capsids&#xC740; &#xC57D; 6-&#xB97C; 11 &#xBC30; &#xC57C;&#xC0DD;-&#xD0C0;&#xC785; AAV2 capsids; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801; &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; AAV8 serotype &#xB3C4;&#xC6B0;&#xBBF8; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xB294; &#xC57D; 16-fold AAV2 serotype &#xB3C4;&#xC6B0;&#xBBF8; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC218;&#xC815; &#xB3C4;&#xC6B0;&#xBBF8; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xBCA1;&#xD130; &#xBCF5;&#xC6A9;&#xB7C9; &#xC218; &#xB354; &#xC904;&#xC5B4;&#xB4E4;&#xB85C; &#xC57D; 50-fold. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;, coadministration scAAV8 PP5 &#xB3C4;&#xC6B0;&#xBBF8; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xC758; &#xC99D;&#xAC00; ssAAV2 &#xBCA1;&#xD130;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC751;&#xACE0; &#xC778;&#xC790; IX &#xC2DD; &#xC57D; 7-10 &#xBC30;, &#xADF8;&#xB85C; &#xC778;&#xD558;&#xC5EC; &#xB0AE;&#xC740; &#xBCA1;&#xD130; &#xBCF5;&#xC6A9;&#xB7C9; &#xCE58;&#xB8CC; &#xC218;&#xC900;&#xC744; &#xB2EC;&#xC131;. Hepatocytes&#xC5D0; &#xBD88;&#xB9AC; &#xD55C; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC8FC;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC870;&#xAC74;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xCC30; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0; &#xC81C;&#xC2DC; &#xD558;&#xB294; &#xC804;&#xB7B5; &#xC5B4;&#xB5A4; ssAAV transgene &#xCE74;&#xC138;&#xD2B8; &#xBC0F;, &#xD2B9;&#xD788;, &#xAC04; &#xAC10;&#xB3C5; &#xC751;&#xC6A9; scAAV &#xBCA1;&#xD130;&#xC5D0; encapsidated &#xC218; &#xC5C6;&#xB294; &#xB354; &#xD070; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; ssAAV2 &#xBCA1;&#xD130;&#xC5D0; &#xC801;&#xC751;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC5B4;&#xC57C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xCD5C;&#xC801;&#xD654; &#xB41C; adeno &#xC81C;&#xD734;&#xD574; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; (AAV)-&#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; AAV &#xBCA1;&#xD130;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xAC04; &#xBCC0;&#xD658;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC778;&#xC0B0; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD6A8;&#xC18C; 5 &#xB3C4;&#xC6B0;&#xBBF8; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4;: &#xC778;&#xC790; IX &#xAC10;&#xC18C; &#xBCA1;&#xD130; &#xBCF5;&#xC6A9;&#xB7C9;&#xC758; &#xCE58;&#xB8CC; &#xC2DD;&#xC774;.

Resumen Nuestros estudios han demostrado que la coinyecci&#xF3;n de convencional de una sola hebra virus adeno-asociado 2 (ssAAV2) vectores portadores de la mayor prote&#xED;na verde fluorescente (EGFP) de genes con la auto-complementaria (sc) AAV2-T prote&#xED;na fosfatasa de c&#xE9;lulas tirosina (TC-PTP) y scAAV2-prote&#xED;na fosfatasa-5 (PP5) vectores result&#xF3; en un incremento de aproximadamente 16-veces en la expresi&#xF3;n EGFP en primarias hepatocitos murinos in vivo [Jayandharan, GR, Zhong, L., Li, B., Kachniarz, B., y Srivastava , A. (2008). Gene Ther. 15, 1287-1293]. En el presente estudio, esta estrategia se ha optimizado a&#xFA;n m&#xE1;s para lograr la expresi&#xF3;n del transgen en la reducci&#xF3;n de las dosis de virus vectores / ayudante. Estos incluyen el uso de scAAV virus auxiliares que contienen (1) de hepatocitos promotores espec&#xED;ficos, (2) tirosina-mutantes c&#xE1;psidas AAV2, y (3) vectores adicionales serotipo AAV conocidos para transducir eficientemente hepatocitos. El hepatocito espec&#xED;fica transtiretina (TTR), el promotor era de aproximadamente 6 - 7-a veces m&#xE1;s eficiente que el virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor; tirosina-mutantes AAV2 c&#xE1;psidas fueron aproximadamente 6 - a 11-veces m&#xE1;s eficiente que el AAV2 de tipo salvaje c&#xE1;psidas, y el virus helper AAV8 serotipo fue aproximadamente 16 veces m&#xE1;s eficiente que AAV2 virus ayudante serotipo. Con estas modificaciones, la dosis vector del virus ayudante podr&#xED;a reducirse a&#xFA;n m&#xE1;s por aproximadamente 50 veces. Coadministraci&#xF3;n pasado, de scAAV8-PP5 virus helper aument&#xF3; factor de coagulaci&#xF3;n IX expresi&#xF3;n de un vector de ssAAV2 por aproximadamente 7 - a 10 veces, consigui&#xE9;ndose as&#xED; los niveles terap&#xE9;uticos en dosis m&#xE1;s bajas de vectores. No tiene efecto adverso sobre los hepatocitos se observ&#xF3; bajo cualquiera de estas condiciones experimentales. La estrategia presentada aqu&#xED; debe ser adaptable a cualquier casete ssAAV transg&#xE9;n y, en concreto las aplicaciones, dirigidos al h&#xED;gado de ssAAV2 vectores que contienen genes mayores que no pueden ser encapsulados en vectores scAAV.

Optimizado virus adeno-asociado (AAV)-prote&#xED;na fosfatasa-5 auxiliares para la transducci&#xF3;n de los virus del h&#xED;gado eficiente por parte de una sola hebra vectores AAV: Expresi&#xF3;n terap&#xE9;utico de factor IX en dosis reducidas vectoriales

Adeno-associated virus 2 (AAV2) vectors transduce fibroblasts and mesenchymal stem cells (MSCs) inefficiently, which limits their potential widespread applicability in combinatorial gene and cell therapy. We have reported that AAV2 vectors fail to traffic efficiently to the nucleus in murine fibroblasts. We have also reported that site-directed mutagenesis of surface-exposed tyrosine residues on viral capsids leads to improved intracellular trafficking of the mutant vectors, and the transduction efficiency of the single tyrosine-mutant vectors is âˆ¼10-fold higher in human cells. In the current studies, we evaluated the transduction efficiency of single as well as multiple tyrosine-mutant AAV2 vectors in murine fibroblasts. Our results indicate that the Y444F mutant vectors transduce these cells most efficiently among the seven single-mutant vectors, with >30-fold increase in transgene expression compared with the wild-type vectors. When the Y444F mutation is combined with additional mutations (Y500F and Y730F), the transduction efficiency of the triple-mutant vectors is increased by âˆ¼130-fold and the viral intracellular trafficking is also significant improved. Similarly, the triple-mutant vectors are capable of transducing up to 80-90% of bone marrow-derived primary murine as well as human MSCs. Thus, high-efficiency transduction of fibroblasts with reprogramming genes to generate induced pluripotent stem cells, and the MSCs for delivering therapeutic genes, should now be feasible with the tyrosine-mutant AAV vectors.

High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy.

Virus ad&#xE9;no-associ&#xE9; 2 (AAV2) fibroblastes vecteurs transduisent et les cellules souches m&#xE9;senchymateuses (CSM) inefficace, ce qui limite leur potentiel d&#x26;#39;application g&#xE9;n&#xE9;ralis&#xE9;e dans le g&#xE8;ne combinatoire et la th&#xE9;rapie cellulaire. Nous avons rapport&#xE9; que AAV2 vecteurs ne parviennent pas &#xE0; la circulation efficace dans le noyau de fibroblastes murins. Nous avons &#xE9;galement signal&#xE9; que la mutagen&#xE8;se dirig&#xE9;e de la surface expos&#xE9;e au r&#xE9;sidus tyrosine sur des capsides virales conduit &#xE0; l&#x26;#39;am&#xE9;lioration trafic intracellulaire des vecteurs mutants, et l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de transduction des simples mutants tyrosine-vecteurs est ~ 10 fois plus &#xE9;lev&#xE9;e dans les cellules humaines. Dans les &#xE9;tudes actuelles, nous avons &#xE9;valu&#xE9; l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de la transduction des simples, ainsi que plusieurs tyrosine-mutantes AAV2 vecteurs dans les fibroblastes murins. Nos r&#xE9;sultats indiquent que les vecteurs Y444F mutantes transduire ces cellules le plus efficacement possible parmi les sept seule-mutants vecteurs, avec&#x26;gt; 30 fois plus &#xE9;lev&#xE9;e dans l&#x26;#39;expression du transg&#xE8;ne par rapport aux vecteurs de type sauvage. Lorsque la mutation Y444F est combin&#xE9; avec d&#x26;#39;autres mutations (Y500F et Y730F), l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de transduction des vecteurs triple mutants est augment&#xE9; de ~ 130 fois et le trafic viral intracellulaire est &#xE9;galement significatif am&#xE9;lior&#xE9;e. De m&#xEA;me, les vecteurs triple mutants sont capables de transduire jusqu&#x26;#39;&#xE0; 80-90% de la moelle osseuse murine d&#xE9;riv&#xE9; primaire ainsi que MSC humaines. Ainsi, &#xE0; haute efficacit&#xE9; de la transduction des fibroblastes avec la reprogrammation des g&#xE8;nes pour produire des cellules souches pluripotentes induites, et le MSC pour d&#xE9;livrer des g&#xE8;nes th&#xE9;rapeutiques, devrait maintenant &#xEA;tre possible avec les vecteurs AAV tyrosine-mutantes.

Haute-efficacit&#xE9; de la transduction des fibroblastes et des cellules souches m&#xE9;senchymateuses par Tyrosine-mutantes AAV2 Vecteurs pour leur utilisation potentielle en th&#xE9;rapie cellulaire

Virus adeno-asociado 2 (AAV2) transduce fibroblastos vectores y c&#xE9;lulas madre mesenquimales (MSC) ineficiente, lo que limita su potencial de aplicaci&#xF3;n general en el gen de combinatoria y la terapia celular. Nos han informado de que AAV2 vectores no al tr&#xE1;fico de manera eficiente al n&#xFA;cleo de los fibroblastos de rat&#xF3;n. Se han reportado tambi&#xE9;n que mutag&#xE9;nesis dirigida al sitio de la superficie expuesta residuos de tirosina en c&#xE1;psidas v&#xED;ricas conduce a la mejora tr&#xE1;fico intracelular de los vectores de mutantes, y la eficacia de transducci&#xF3;n de las individuales tirosina-mutantes vectores es de ~ 10-veces mayor en las c&#xE9;lulas humanas. En los estudios actuales, se evalu&#xF3; la eficacia de transducci&#xF3;n de individuales, as&#xED; como m&#xFA;ltiples tirosina-mutantes AAV2 vectores en los fibroblastos de rat&#xF3;n. Nuestros resultados indican que los vectores Y444F mutantes transducir estas c&#xE9;lulas m&#xE1;s eficientemente entre los siete solo mutantes vectores, con&#x26;gt; 30-veces mayor en la expresi&#xF3;n del transg&#xE9;n en comparaci&#xF3;n con los vectores de tipo salvaje. Cuando la mutaci&#xF3;n Y444F se combina con mutaciones adicionales (Y500F y Y730F), la eficacia de transducci&#xF3;n de los vectores de triple mutantes se aument&#xF3; ~ 130-veces y el tr&#xE1;fico intracelular viral es tambi&#xE9;n significativa mejorado. De manera similar, los vectores de triple mutantes son capaces de transducir hasta 80-90% de la m&#xE9;dula &#xF3;sea derivado murino primario, as&#xED; como MSC humano. Por lo tanto, de alta eficiencia de transducci&#xF3;n de los fibroblastos con la reprogramaci&#xF3;n de los genes para generar c&#xE9;lulas madre pluripotentes inducidas, y el MSC para la entrega de los genes terap&#xE9;uticos, ahora deber&#xED;a ser posible con los vectores de la tirosina-mutantes AAV.

Alta eficiencia de transducci&#xF3;n de fibroblastos y c&#xE9;lulas madre mesenquimales de la tirosina-mutantes AAV2 vectores para su posible uso en terapia celular

&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; &#xFF08;AAV2&#xFF09; 2 &#x6362;&#x80FD;&#x5411;&#x91CF;&#x5668;&#x6210;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x7EC6;&#x80DE;&#x548C;&#x95F4;&#x5145;&#x8D28;&#x5E72;&#x7EC6;&#x80DE; (MSCs) &#x6548;&#x7387;&#x4F4E;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x5C31;&#x9650;&#x5236;&#x4E86;&#x5176;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x666E;&#x904D;&#x9002;&#x7528;&#x6027;&#xFF0C;&#x7EC4;&#x5408;&#x57FA;&#x56E0;&#x548C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6CBB;&#x7597;&#x4E2D;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x62A5;&#x9053; AAV2 &#x8F7D;&#x4F53;&#x4E0D;&#x80FD;&#x9AD8;&#x6548;&#x5730;&#x5411;&#x6838;&#x4EA4;&#x901A;&#x5C0F;&#x9F20;&#x6210;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FD8;&#x62A5;&#x544A;&#x8BF4;&#x8868;&#x9762;&#x66B4;&#x9732;&#x7684;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x57FA;&#x4E0A;&#x75C5;&#x6BD2;&#x6027; capsids &#x5B9A;&#x70B9;&#x7A81;&#x53D8;&#x5BFC;&#x81F4;&#x7A81;&#x53D8;&#x7684;&#x8F7D;&#x4F53;&#xFF0C;&#x6539;&#x8FDB;&#x80DE;&#x5185;&#x8D29;&#x5356;&#x548C;&#x5355;&#x4E00;&#x7684;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x7A81;&#x53D8;&#x8F7D;&#x4F53;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x6548;&#x7387;&#x662F; &sim;10-&#x8936;&#x76B1;&#x66F4;&#x9AD8;&#x7684;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x3002;&#x5728;&#x5F53;&#x524D;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BA1;&#x7B97;&#x5355;&#x4E2A;&#x548C;&#x591A;&#x4E2A;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x7A81;&#x53D8; AAV2 &#x8F7D;&#x4F53;&#x5728;&#x5C0F;&#x9F20;&#x6210;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x7684;&#x6548;&#x7387;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E; Y444F &#x7A81;&#x53D8;&#x8F7D;&#x4F53;&#x4E0E;&#x6362;&#x80FD;&#x5668;&#x6700;&#x6709;&#x6548;&#x5730;&#x4E4B;&#x95F4;&#x4E03;&#x5355;&#x7A81;&#x53D8;&#x8F7D;&#x4F53;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7EC6;&#x80DE; &gt; 30-fold &#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x8F83;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x8F7D;&#x4F53;&#x3002;&#x5F53; Y444F &#x7A81;&#x53D8;&#x7ED3;&#x5408;&#x5176;&#x4ED6;&#x7A81;&#x53D8; &#xFF08;Y500F &#x548C; Y730F&#xFF09;&#x3001; &#x4E09;&#x91CD;&#x7A81;&#x53D8;&#x8F7D;&#x4F53;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x6548;&#x7387;&#x589E;&#x52A0; &sim;130 &#x500D;&#x548C;&#x75C5;&#x6BD2;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5185;&#x8D29;&#x5356;&#x4E5F;&#x662F;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x6539;&#x8FDB;&#x3002;&#x540C;&#x6837;&#xFF0C;&#x4E09;&#x91CD;&#x7A81;&#x53D8;&#x8F7D;&#x4F53;&#x90FD;&#x80FD;&#x591F;&#x6C19;&#x6C14;&#x9AA8;&#x9AD3;&#x4E3B;&#x5C0F;&#x9F20;&#x4EE5;&#x53CA;&#x4EBA;&#x7C7B; MSCs &#x7684; 80-90%&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x9AD8;&#x6548;&#x7387;&#x7684;&#x6210;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x7EC6;&#x80DE;&#x91CD;&#x7F16;&#x7A0B;&#x751F;&#x6210;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x591A;&#x80FD;&#x5E72;&#x7EC6;&#x80DE;&#x548C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x6CBB;&#x7597;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#xFF0C;MSCs &#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x73B0;&#x5728;&#x5E94;&#x8BE5;&#x53EF;&#x884C;&#x4E0E;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x7A81;&#x53D8;&#x57FA;&#x56E0;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8F7D;&#x4F53;&#x3002;

&#x9AD8;&#x6548;&#x7387;&#x7684;&#x6210;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x7EC6;&#x80DE;&#x548C;&#x95F4;&#x5145;&#x8D28;&#x5E72;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x7A81;&#x53D8; AAV2 &#x8F7D;&#x4F53;&#x4F9B;&#x5176;&#x5728;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7597;&#x6CD5;&#x7684;&#x6F5C;&#x5728;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x4F20;&#x5BFC;&#x3002;

Adeno-assoziierte Virus 2 (AAV2) Vektoren zur&uuml;ckwirken Fibroblasten und mesenchymale Stammzellen (MSCs) ineffizient, welche Grenzen ihre potenziellen weit verbreiteten Anwendbarkeit in der kombinatorischen gen- und Therapie. Wir haben berichtet, dass AAV2 Vektoren nicht effizient Verkehr zum Kern in murine Fibroblasten. Wir haben auch berichtet, dass Site-verwiesene Mutagenese Oberfl&auml;che exponierten Tyrosin R&uuml;ckst&auml;nde auf viralen Capsids f&uuml;hrt zu verbesserten intrazellul&auml;re Menschenhandel der Mutanten Vektoren und die Transduktion Effizienz der einzelnen Tyrosin-Mutant Vektoren &sim;10-fach h&ouml;her in den menschlichen Zellen. In aktuellen Studien werteten wir die Transduktion Effizienz der einzelne als auch mehrere Tyrosin-Mutant AAV2 Vektoren in murine Fibroblasten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Y444F-Mutanten-Vektoren dieser Zellen am effizientesten unter den sieben Einzel-Mutant-Vektoren mit zur&uuml;ckwirken &gt; 30-fold Anstieg Transgenexpression im Vergleich mit den Wildtyp-Vektoren. Wenn die Y444F-Mutation mit zus&auml;tzlichen Mutationen (Y500F und Y730F kombiniert wird), die Transduktion Effizienz der Dreifach-Mutant Vektoren sich um &sim;130-fach erh&ouml;ht und virale intrazellul&auml;re Menschenhandel auch erhebliche ist verbesserte. Ebenso k&ouml;nnen die Dreifach-Mutant-Vektoren transducing bis zu 80-90 % der Knochenmark-abgeleitete prim&auml;ren murinen sowie menschliche MSCs. Daher sollten hocheffiziente Transduktion von Fibroblasten mit Umprogrammierung Gene zum Generieren von induzierten pluripotenten Stammzellen und die MSCs f&uuml;r die Bereitstellung von therapeutischen Gene, jetzt bei der Tyrosin-Mutant-AAV-Vektoren durchf&uuml;hrbar.

Hocheffiziente Transduktion von Fibroblasten und mesenchymalen Stammzellen durch Tyrosin-Mutant AAV2 Vektoren auf ihre m&ouml;gliche Verwendung bei Zelltherapie.

Virus adeno-associati 2 (AAV2) vettori trasducono fibroblasti e cellule staminali mesenchimali (MSCs) in modo inefficiente, che limita il loro potenziale applicabilit&agrave; diffusa nella combinatoria terapia genica e cellulare. Abbiamo segnalato che AAV2 vettori non efficiente del traffico nel nucleo in fibroblasti murini. Abbiamo anche segnalato che mutagenesi luogo-diretta dei residui di tirosina superficie esposta su capsidi virali conduce a maggiore traffico intracellulare dei vettori del mutanti e l&#39;efficienza di trasduzione dei singoli vettori tirosina-mutante &egrave; &sim;10 volte pi&ugrave; elevati nelle cellule umane. Negli studi attuali, abbiamo valutato l&#39;efficienza di trasduzione del singolo cos&igrave; come molteplici vettori di AAV2 tirosina-mutante in fibroblasti murini. I nostri risultati indicano che i vettori mutanti Y444F trasducono queste cellule in modo pi&ugrave; efficiente tra i sette vettori single-mutante, con &amp;gt; 30-fold aumento di espressione del transgene confrontato con i vettori di tipo selvatico. Quando la mutazione Y444F &egrave; combinata con altre mutazioni (Y500F e Y730F), l&#39;efficienza di trasduzione dei vettori triple-mutante &egrave; aumentato da &sim;130-piega e il traffico virale intracellulare &egrave; anche significativo miglioramento. Analogamente, i vettori di triple-mutante sono capaci di transducing fino a 80-90% delle derivate da midollo osseo primario murino cos&igrave; come umana MSCs. Cos&igrave;, ad alta efficienza trasduzione dei fibroblasti con riprogrammazione geni per generare cellule staminali pluripotenti indotte e MSCs per la consegna di geni terapeutici, ora dovrebbe essere fattibile con i vettori AAV tirosina-mutante.

Ad alta efficienza trasduzione di fibroblasti e cellule staminali mesenchimali da vettori AAV2 tirosina-mutante per il loro potenziale utilizzo in terapia cellulare.

&#x30A2;&#x30C7;&#x30CE;&#x968F;&#x4F34;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;2&#xFF08;AAV2&#xFF09;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x7D30;&#x80DE;&#x6CBB;&#x7642;&#x306B;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x5E83;&#x7BC4;&#x306A;&#x9069;&#x7528;&#x6027;&#x3092;&#x5236;&#x9650;&#x3057;&#x3001;&#x975E;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#xFF08;MSC&#xFF09;&#x306E;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x82BD;&#x7D30;&#x80DE;&#x3068;&#x9593;&#x8449;&#x7CFB;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x5F62;&#x8CEA;&#x5C0E;&#x5165;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;AAV2&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x82BD;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x6838;&#x306B;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x30C8;&#x30E9;&#x30D5;&#x30A3;&#x30C3;&#x30AF;&#x306B;&#x5931;&#x6557;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x5831;&#x544A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x30AB;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x306E;&#x8868;&#x9762;&#x306B;&#x9732;&#x51FA;&#x306E;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x90E8;&#x4F4D;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x8A98;&#x767A;&#x6CD5;&#x306F;&#x3001;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x6539;&#x826F;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x8F38;&#x9001;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x308B;&#x3057;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x5C0E;&#x5165;&#x52B9;&#x7387;&#x306F;&#x3001;&#x30D2;&#x30C8;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x7D04;10&#x500D;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3002;&#x5831;&#x544A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x73FE;&#x5728;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x82BD;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x5358;&#x4E00;&#x306A;&#x3089;&#x3073;&#x306B;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x5909;&#x7570;AAV2&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x5C0E;&#x5165;&#x52B9;&#x7387;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;Y444F&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x306E;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x3066;&#x5C0E;&#x5165;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x306E;&#x26;gt; 30&#x500D;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x3068;&#x3001;7&#x3064;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306E;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306E;&#x4E2D;&#x3067;&#x6700;&#x3082;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x5F62;&#x8CEA;&#x5C0E;&#x5165;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002; Y444F&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x306F;&#x3001;&#x8FFD;&#x52A0;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#xFF08;Y500F&#x3068;Y730F&#xFF09;&#x3068;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x308B;&#x3068;&#x3001;&#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30EB;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x5C0E;&#x5165;&#x52B9;&#x7387;&#x304C;&#x301C;130&#x500D;&#x306B;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x3001;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x8F38;&#x9001;&#x306F;&#x6539;&#x5584;&#x3082;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;&#x3001;&#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30EB;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x9AA8;&#x9AC4;&#x7531;&#x6765;&#x306E;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x3068;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;&#x30D2;&#x30C8;MSC&#x306E;80-90&#xFF05;&#x307E;&#x3067;&#x4F1D;&#x9054;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x53EF;&#x80FD;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x6CBB;&#x7642;&#x7528;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x9AD8;&#x52B9;&#x7387;&#x8A98;&#x5C0E;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x591A;&#x80FD;&#x6027;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x518D;&#x30D7;&#x30ED;&#x30B0;&#x30E9;&#x30DF;&#x30F3;&#x30B0;&#x3057;&#x305F;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x82BD;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x60C5;&#x5831;&#x4F1D;&#x9054;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;MSC&#x306F;&#x73FE;&#x5728;&#x3001;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;AAV&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x3067;&#x53EF;&#x80FD;&#x3067;&#x306A;&#x3051;&#x308C;&#x3070;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;

&#x7D30;&#x80DE;&#x7642;&#x6CD5;&#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x4F7F;&#x7528;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x5909;&#x7570;AAV2&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x82BD;&#x7D30;&#x80DE;&#x3068;&#x9593;&#x8449;&#x7CFB;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x9AD8;&#x52B9;&#x7387;&#x4F1D;&#x9054;

Adeno &#xC81C;&#xD734;&#xD574; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; 2 (AAV2) &#xBCA1;&#xD130; transduce &#xC12C;&#xC720; &#xC544; &#xC138;&#xD3EC;&#xC640; &#xC911;&#xAC04; &#xC5FD; &#xC904;&#xAE30; &#xC138;&#xD3EC; (MSCs) &#xBE44;&#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC870;&#xD569; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC0F; &#xC138;&#xD3EC; &#xCE58;&#xB8CC;&#xC5D0; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xAD11;&#xBC94;&#xC704; &#xD55C; &#xC801;&#xC6A9; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131; &#xC81C;&#xD55C; &#xD558;&#xB294;. &#xC6B0;&#xB9AC; AAV2 &#xBCA1;&#xD130; murine &#xC12C;&#xC720; &#xC544; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD575;&#xC744; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xAD50;&#xD1B5; &#xD558;&#xC9C0; &#xBABB;&#xD558;&#xB294; &#xAC83;&#xC744; &#xBCF4;&#xACE0; &#xC788;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB610;&#xD55C; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; capsids&#xC5D0; &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0; &#xB178;&#xCD9C; &#xB41C; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC758; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xAC10;&#xB3C5; mutagenesis &#xB9AC;&#xB4DC; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; &#xBC00;&#xB9E4; &#xD558; &#xACE0; &#xB2E8;&#xC77C; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728;&#xC740; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC138;&#xD3EC;&#xB97C; &#xB354; &#xB192;&#xC740; &sim;10-&#xBC30; &#xBCF4;&#xACE0;. &#xD604;&#xC7AC; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; murine &#xC12C;&#xC720; &#xC544; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; AAV2 &#xBCA1;&#xD130; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xB2E8;&#xC77C;&#xC758; &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728;&#xC131; &#xD3C9;&#xAC00;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; Y444F &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBCA1;&#xD130;&#xC640; 7 &#xAC1C;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBCA1;&#xD130; &#xC911;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC00;&#xC7A5; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC140;&#xC744; transduce &amp;gt; transgene &#xC2DD; 30-fold &#xC99D;&#xAC00; &#xBE44;&#xD574; &#xC57C;&#xC0DD;-&#xD0C0;&#xC785; &#xBCA1;&#xD130;. Y444F &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xCD94;&#xAC00; &#xBCC0;&#xC774; (Y500F &#xBC0F; Y730F)&#xC640; &#xD568;&#xAED8; &#xD2B8;&#xB9AC;&#xD50C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728;&#xC740; &sim;130 &#xBC30; &#xC99D;&#xAC00; &#xD558; &#xACE0; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; &#xB9E4;&#xB9E4;&#xB294; &#xB610;&#xD55C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xAC1C;&#xC120;. &#xB9C8;&#xCC2C;&#xAC00;&#xC9C0;&#xB85C;, &#xD2B8;&#xB9AC;&#xD50C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBCA1;&#xD130; transducing &#xACE8; &#xC218; &#xD30C;&#xC0DD; &#xB41C; &#xAE30;&#xBCF8; murine &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; Mscs&#xC758; 80-90%&#xAE4C;&#xC9C0; &#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, &#xC720;&#xB3C4; &#xB9CC;&#xB2A5; &#xC904;&#xAE30; &#xC138;&#xD3EC;&#xC640; &#xCE58;&#xB8CC; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB97C; &#xC804;&#xB2EC; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; Mscs&#xB97C; &#xC0DD;&#xC131; &#xD558;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC7AC;&#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB798;&#xBC0D; &#xB41C; &#xC12C;&#xC720; &#xC544; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xACE0;&#xD6A8;&#xC728; &#xBCC0;&#xD658; &#xC774;&#xC81C; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; AAV &#xBCA1;&#xD130;&#xC640; &#xC2E4;&#xD604; &#xB418;&#xC5B4;&#xC57C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC12C;&#xC720; &#xC544; &#xC138;&#xD3EC; &#xBC0F; &#xC138;&#xD3EC; &#xCE58;&#xB8CC;&#xC5D0; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; AAV2 &#xBCA1;&#xD130;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC911;&#xAC04; &#xC5FD; &#xC904;&#xAE30; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xACE0;&#xD6A8;&#xC728; &#xBCC0;&#xD658;.

Virus adeno-asociados (AAV) utilizan una variedad de receptores celulares o correceptores para poder entrar en las c&#xE9;lulas. Un n&#xFA;mero de serotipos de AAV ya est&#xE1;n disponibles, y los receptores afines o correceptores para s&#xF3;lo un pu&#xF1;ado de ellos han sido identificados hasta el momento. De los 10 serotipos de AAV de uso com&#xFA;n, AAV3 es por lejos el menos eficiente en la transducci&#xF3;n de las c&#xE9;lulas en general. Sin embargo, en nuestros estudios m&#xE1;s recientes, se observ&#xF3; que AAV3 vectores transduced c&#xE9;lulas humanas de c&#xE1;ncer de h&#xED;gado muy bien, lo que condujo a la hip&#xF3;tesis de que AAV3 utiliza receptor de factor de crecimiento de hepatocitos (HGFR) como un co-receptor celular para la entrada del virus. AAV3 infecci&#xF3;n de l&#xED;neas celulares de c&#xE1;ncer de h&#xED;gado humano fue mucho m&#xE1;s inhibida por el factor de crecimiento de hepatocitos, HGFR espec&#xED;ficas de ARN peque&#xF1;os de interferencia, y el anticuerpo anti-HGFR, lo que corrobora esta hip&#xF3;tesis. Sin embargo, no AAV3 vectores para transducir hepatocitos murinos, tanto in vitro como in vivo, lo que sugiere que AAV3 utiliza espec&#xED;ficamente HGFR humana, pero no HGFR murino, como un co-receptor celular para la transducci&#xF3;n. AAV3 puede llegar a ser un vector &#xFA;til para la focalizaci&#xF3;n c&#xE1;nceres de h&#xED;gado humano para la terapia g&#xE9;nica potencial.

Humanos del receptor del factor de crecimiento de hepatocitos es un correceptor celular de virus adeno-asociado serotipo 3

&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; (AAVs) &#x4F7F;&#x7528;&#x5404;&#x79CD;&#x5404;&#x6837;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x53D7;&#x4F53;/&#x8F85;&#x52A9;&#x53D7;&#x4F53;&#x8FDB;&#x5165;&#x7EC6;&#x80DE;&#x3002;&#x5927;&#x91CF;&#x7684;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8840;&#x6E05;&#x578B;&#x73B0;&#x5728;&#x53EF;&#x7528;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x8F85;&#x52A9;&#x53D7;&#x540C;&#x6E90;&#x53D7;&#x4F53;/&#x4F53;&#x662F;&#x5C48;&#x6307;&#x53EF;&#x6570;&#x7684;&#x90A3;&#x4E9B;&#x8FC4;&#x4ECA;&#x5DF2;&#x786E;&#x5B9A;&#x3002;10 &#x79CD;&#x5E38;&#x7528;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8840;&#x6E05;&#x578B;&#x4E2D;&#xFF0C;AAV3 &#x662F;&#x5230;&#x76EE;&#x524D;&#x4E3A;&#x6B62;&#x81F3;&#x5C11;&#x6709;&#x6548;&#x5730;&#x4E00;&#x822C;&#x6C19;&#x6C14;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x5728;&#x6211;&#x4EEC;&#x6700;&#x8FD1;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230; AAV3 &#x8F7D;&#x4F53;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x4EBA;&#x809D;&#x764C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x51FA;&#x8272;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x5BFC;&#x81F4;&#x4E86; AAV3 &#x4F7F;&#x7528;&#x809D;&#x7EC6;&#x80DE;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x4F53; (HGFR) &#x7684;&#x5047;&#x8BBE;&#x4F5C;&#x4E3A; hiv &#x75C5;&#x6BD2;&#x8FDB;&#x5165;&#x7EC6;&#x80DE;&#x611F;&#x67D3;&#x6291;&#x5236;&#x3002;AAV3 &#x611F;&#x67D3;&#x4EBA;&#x809D;&#x764C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7CFB;&#x662F;&#x5F3A;&#x70C8;&#x6291;&#x5236;&#x809D;&#x7EC6;&#x80DE;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x3001; &#x7279;&#x5B9A;&#x4E8E; HGFR &#x7684;&#x5C0F;&#x5206;&#x5B50;&#x5E72;&#x6270; RNA &#x548C;&#x6297; HGFR &#x6297;&#x4F53;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x8BC1;&#x5B9E;&#x4E86;&#x8FD9;&#x4E00;&#x5047;&#x8BBE;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;AAV3 &#x5411;&#x91CF;&#x672A;&#x80FD;&#x6362;&#x80FD;&#x5668;&#x5C0F;&#x9F20;&#x809D;&#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;&#x5728;&#x4F53;&#x5916;&#x548C;&#x4F53;&#x5185;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x8868;&#x660E; AAV3 &#x4E13;&#x95E8;&#x4F7F;&#x7528;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7684; HGFR&#xFF0C;&#x4F46;&#x4E0D;&#x662F;&#x5C0F;&#x9F20; HGFR&#xFF0C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E3A;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x7EC6;&#x80DE; hiv &#x611F;&#x67D3;&#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x3002;AAV3 &#x53EF;&#x80FD;&#x662F;&#x9488;&#x5BF9;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x6CBB;&#x7597;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x809D;&#x764C;&#x75C7;&#x6709;&#x7528;&#x5411;&#x91CF;&#x3002;

&#x4EBA;&#x809D;&#x7EC6;&#x80DE;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x4F53;&#x662F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684; hiv &#x611F;&#x67D3;&#x6291;&#x5236;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8840;&#x6E05;&#x578B; 3 &#x5BF9;&#x3002;

Adeno-associated viruses (AAVs) use a variety of cellular receptors/coreceptors to gain entry into cells. A number of AAV serotypes are now available, and the cognate receptors/coreceptors for only a handful of those have been identified thus far. Of the 10 commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells in general. However, in our more recent studies, we observed that AAV3 vectors transduced human liver cancer cells remarkably well, which led to the hypothesis that AAV3 uses hepatocyte growth factor receptor (HGFR) as a cellular coreceptor for viral entry. AAV3 infection of human liver cancer cell lines was strongly inhibited by hepatocyte growth factor, HGFR-specific small interfering RNA, and anti-HGFR antibody, which corroborated this hypothesis. However, AAV3 vectors failed to transduce murine hepatocytes, both in vitro and in vivo, suggesting that AAV3 specifically uses human HGFR, but not murine HGFR, as a cellular coreceptor for transduction. AAV3 may prove to be a useful vector for targeting human liver cancers for the potential gene therapy.

Human hepatocyte growth factor receptor is a cellular coreceptor for adeno-associated virus serotype 3.

Virus ad&#xE9;no-associ&#xE9;s (AAV) utilisent une vari&#xE9;t&#xE9; de r&#xE9;cepteurs cellulaires ou cor&#xE9;cepteurs pour entrer dans les cellules. Un certain nombre de s&#xE9;rotypes d&#x26;#39;AAV sont maintenant disponibles, et les r&#xE9;cepteurs apparent&#xE9;s ou cor&#xE9;cepteurs pour seulement une poign&#xE9;e de ceux qui ont &#xE9;t&#xE9; identifi&#xE9;es &#xE0; ce jour. Parmi les 10 s&#xE9;rotypes d&#x26;#39;AAV couramment utilis&#xE9;s, AAV3 est de loin la moins efficace dans la transduction des cellules en g&#xE9;n&#xE9;ral. Cependant, dans nos &#xE9;tudes les plus r&#xE9;centes, nous avons observ&#xE9; que AAV3 vecteurs transduites cellules humaines de cancer du foie remarquablement bien, qui a conduit &#xE0; l&#x26;#39;hypoth&#xE8;se selon laquelle AAV3 utilise des h&#xE9;patocytes r&#xE9;cepteur du facteur de croissance (HGFR) comme un cor&#xE9;cepteur cellulaire pour l&#x26;#39;entr&#xE9;e virale. AAV3 infection de lignes de foie de cellules canc&#xE9;reuses humaines a &#xE9;t&#xE9; fortement inhib&#xE9;e par le facteur de croissance des h&#xE9;patocytes, HGFR-petits ARN interf&#xE9;rents sp&#xE9;cifiques, et anti-HGFR anticorps, ce qui corrobore cette hypoth&#xE8;se. Toutefois, AAV3 vecteurs &#xE9;chou&#xE9; &#xE0; transduire les h&#xE9;patocytes murins, &#xE0; la fois in vitro et in vivo, ce qui sugg&#xE8;re que AAV3 utilise sp&#xE9;cifiquement HGFR humaine, mais pas HGFR murin, comme un cor&#xE9;cepteur cellulaire pour la transduction. AAV3 peut se r&#xE9;v&#xE9;ler &#xEA;tre un vecteur utile pour le ciblage cancers du foie de l&#x26;#39;homme pour la th&#xE9;rapie g&#xE9;nique potentiel.

R&#xE9;cepteur humain du facteur de croissance des h&#xE9;patocytes est un cor&#xE9;cepteur cellulaire pour virus ad&#xE9;no-associ&#xE9; s&#xE9;rotype 3

Adeno-assoziierte Viren (AAVs) verwenden eine Vielzahl von zellul&auml;ren Rezeptoren/Corezeptors Eintrag in die Zellen zu gewinnen. Eine Reihe von AAV-Serotypen sind jetzt verf&uuml;gbar, und die verwandten Rezeptoren/Corezeptors f&uuml;r nur eine Handvoll davon wurden bisher identifiziert. Die 10 h&auml;ufigsten verwendeten AAV-Serotypen ist AAV3 bei weitem die wenigsten effiziente in transducing Zellen im Allgemeinen. Jedoch in unseren neueren Studien beobachteten wir, dass AAV3 Vektoren menschlicher Leberkrebs Zellen bemerkenswert gut gef&uuml;hrt zu die Hypothese transduzierten, dass AAV3 Hepatozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor (HGFR) verwendet als eine zellul&auml;re Coreceptor f&uuml;r virale Eintrag. AAV3 Infektion der menschlichen Leber Krebszelllinien war stark gehemmt, von Hepatozyten-Wachstumsfaktor, HGFR-spezifische small interfering RNA und Anti-HGFR-Antik&ouml;rper, die diese Hypothese best&auml;tigt. Allerdings gelang es AAV3 Vektoren, zur&uuml;ckwirken murine Hepatozyten, in vitro und in vivo darauf hindeutet, dass AAV3 speziell menschliche HGFR, aber nicht murinen HGFR, als eine zellul&auml;re Coreceptor f&uuml;r Transduktion verwendet. AAV3 k&ouml;nnte sich als n&uuml;tzlich Vektor f&uuml;r die Ausrichtung der menschlichen Leber Krebs f&uuml;r die m&ouml;gliche Gentherapie.

Menschliche Hepatozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor ist ein zellul&auml;rer Coreceptor f&uuml;r Adeno-assoziierte Virus Serotyp 3.

Virus adeno-associati (AAVs) utilizzare una variet&agrave; di recettori cellulari/coreceptors per ottenere l&#39;ingresso nelle cellule. Un certo numero di sierotipi AAV &egrave; ora disponibile, e le cognate recettori/coreceptors per solo una manciata di quelli sono stati identificati finora. 10 Sierotipi AAV comunemente usati, AAV3 &egrave; di gran lunga il meno efficiente in transducing cellule in generale. Tuttavia, nei nostri studi pi&ugrave; recenti, abbiamo osservato che AAV3 vettori transduced cellule di cancro del fegato umano straordinariamente bene, che ha condotto all&#39;ipotesi che AAV3 USA del hepatocyte growth factor receptor (HGFR) come un cellulare coreceptor per entrata virale. AAV3 infezione di linee di cellule di cancro del fegato umano &egrave; stato fortemente inibito da fattore di crescita degli epatociti e piccolo RNA interferente HGFR specifico anticorpo anti-HGFR, che ha corroborato questa ipotesi. Tuttavia, AAV3 vettori non &egrave; riuscito a trasdurre epatociti murini sia in vitro che in vivo, suggerendo che AAV3 in particolare utilizza umano HGFR, ma HGFR non murino, come un cellulare coreceptor per la trasduzione. AAV3 pu&ograve; rivelarsi un utile vettore per il targeting tumori epatici umani per la terapia genica potenziali.

Recettore del fattore di crescita degli epatociti umani &egrave; un cellulare coreceptor per sierotipo del virus adeno-associati 3.

&#x30A2;&#x30C7;&#x30CE;&#x968F;&#x4F34;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#xFF08;AAV&#x306E;&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x306B;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C8;&#x30EA;&#x3092;&#x5F97;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;/&#x5171;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002; AAV&#x8840;&#x6E05;&#x578B;&#x306E;&#x6570;&#x304C;&#x5229;&#x7528;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x307B;&#x3093;&#x306E;&#x4E00;&#x63E1;&#x308A;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x540C;&#x65CF;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;/&#x5171;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x307E;&#x3067;&#x540C;&#x5B9A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002; 10&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x308B;AAV&#x8840;&#x6E05;&#x578B;&#x306E;&#x3046;&#x3061;&#x3001;AAV3&#x306F;&#x306F;&#x308B;&#x304B;&#x306B;&#x6700;&#x3082;&#x975E;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x3001;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306B;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x5F62;&#x8CEA;&#x5C0E;&#x5165;&#x306E;&#x3053;&#x3068;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x6700;&#x8FD1;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;AAV3&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306F;AAV3&#x306F;&#x3001;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E;&#x4FB5;&#x5165;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x30B3;&#x30EC;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x809D;&#x7D30;&#x80DE;&#x5897;&#x6B96;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#xFF08;HGFR&#xFF09;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x4EEE;&#x8AAC;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x3063;&#x305F;&#x3001;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x3088;&#x304F;&#x30D2;&#x30C8;&#x809D;&#x764C;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x5F62;&#x8CEA;&#x5C0E;&#x5165;&#x3057;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30D2;&#x30C8;&#x809D;&#x764C;&#x7D30;&#x80DE;&#x682A;&#x306E;AAV3&#x611F;&#x67D3;&#x304C;&#x5F37;&#x304F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x4EEE;&#x8AAC;&#x3092;&#x88CF;&#x4ED8;&#x3051;&#x809D;&#x7D30;&#x80DE;&#x5897;&#x6B96;&#x56E0;&#x5B50;&#x3001;HGFR&#x56FA;&#x6709;&#x306E;&#x4F4E;&#x5206;&#x5B50;&#x5E72;&#x6E09;RNA&#x3001;&#x30A2;&#x30F3;&#x30C1;HGFR&#x6297;&#x4F53;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x963B;&#x5BB3;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;AAV3&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306F;AAV3&#x306F;&#x3001;&#x7279;&#x306B;&#x60C5;&#x5831;&#x4F1D;&#x9054;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x30B3;&#x30EC;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;HGFR&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;HGFR&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x306A;&#x3044;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3001;in vitro&#x304A;&#x3088;&#x3073;in vivo&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x3067;&#x3001;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x809D;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x5F62;&#x8CEA;&#x5C0E;&#x5165;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3002; AAV3&#x306F;&#x3001;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x6CBB;&#x7642;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30D2;&#x30C8;&#x809D;&#x764C;&#x3092;&#x6A19;&#x7684;&#x3068;&#x3059;&#x308B;&#x6709;&#x7528;&#x306A;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x8A3C;&#x660E;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30D2;&#x30C8;&#x809D;&#x7D30;&#x80DE;&#x5897;&#x6B96;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306F;&#x3001;&#x30A2;&#x30C7;&#x30CE;&#x968F;&#x4F34;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x8840;&#x6E05;&#x578B;3&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x30B3;&#x30EC;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x3067;&#x3042;&#x308B;

Adeno &#xC81C;&#xD734;&#xD574; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; (AAVs) &#xC140;&#xC5D0; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;/coreceptors&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. AAV serotypes &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC9C0;&#xAE08; &#xD558; &#xACE0; &#xADF8; &#xC911; &#xC18C;&#xC218;&#xB9CC; &#xC704;&#xD55C; &#xB3D9;&#xC871; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;/coreceptors&#xAE4C;&#xC9C0; &#xD655;&#xC778; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. 10 &#xC790;&#xC8FC; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xB294; AAV serotypes&#xC758; AAV3 &#xC9C0;&#xAE08;&#xAE4C;&#xC9C0; &#xC801;&#xC5B4;&#xB3C4; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC140;&#xC744; transducing&#xC5D0; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xB354; &#xCD5C;&#xADFC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xCC30; &#xADF8; AAV3 &#xBCA1;&#xD130; &#xBD88;&#xB9AC;&#xACE0; &#xC778;&#xAC04; &#xAC04; &#xC554; &#xC138;&#xD3EC; &#xB108;&#xBB34;&#xB098; &#xC798; AAV3 hepatocyte &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; (HGFR)&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xAC00;&#xC124;&#xC744; &#xC8FC;&#xB3C4; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD734;&#xB300; &#xC804;&#xD654; coreceptor&#xB85C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC778;&#xAC04; &#xAC04; &#xC554; &#xC138;&#xD3EC; &#xB77C;&#xC778;&#xC758; AAV3 &#xAC10;&#xC5FC;&#xC740; hepatocyte &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790;, HGFR &#xAD00;&#xB828; &#xC791;&#xC740; &#xAC04;&#xC12D; RNA &#xBC0F;&#xC774; &#xAC00;&#xC124;&#xC744; &#xB4B7;&#xBC1B;&#xCE68; &#xD558;&#xB294; &#xC548;&#xD2F0;-HGFR &#xD56D; &#xCCB4;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xAC15;&#xB825; &#xD558; &#xAC8C; &#xC5B5;&#xC81C; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, AAV3 &#xBCA1;&#xD130; transduce murine hepatocytes, &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678; &#xBC0F; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74;, AAV3 &#xD2B9;&#xBCC4;&#xD788;&#xC5D0;&#xC11C;&#xB294; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; HGFR &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xD558;&#xC9C0; murine HGFR &#xBCC0;&#xD658;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD734;&#xB300; &#xC804;&#xD654; coreceptor&#xB85C; &#xC81C;&#xC548; &#xD558;&#xC9C0; &#xBABB;&#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. AAV3 &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xCE58;&#xB8CC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xAC04; &#xC554;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC720;&#xC6A9;&#xD55C; &#xBCA1;&#xD130; &#xC99D;&#xBA85;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC778;&#xAC04;&#xC758; hepatocyte &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; adeno &#xC81C;&#xD734;&#xD574; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; serotype 3&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD734;&#xB300; &#xC804;&#xD654; coreceptor&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#x6D88;&#x9664;&#x7279;&#x5B9A;&#x8868;&#x9762;&#x66B4;&#x9732;&#x5355;&#x4E2A;&#x916A;&#x6C28;&#x9178; (Y) &#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x53EF;&#x663E;&#x8457;&#x63D0;&#x9AD8;&#x809D;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x79FB;&#x4E0E;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x7C7B;&#x578B; 2 &#xFF08;AAV2&#xFF09; &#x8F7D;&#x4F53;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x5F3A;&#x5316;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x6548;&#x7387;&#x8BC4;&#x4EF7;&#x4E86;&#x7A81;&#x53D8;&#x4E2D;&#x7684;&#x4E03;&#x4E2A;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x76F8;&#x5173; Y &#x6B8B;&#x7559;&#x7684;&#x7EC4;&#x5408;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53; capsids &#x6253;&#x5305;&#x5230;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x6548;&#x4EF7;&#x75C5;&#x6BD2;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x548C;&#x4FDD;&#x7559;&#x611F;&#x67D3;&#x529B;&#x3002;&#x4E09;&#x91CD;&#x7A81;&#x53D8; (Y444 + 500 + 730F&#xFF09; &#x77E2;&#x91CF;&#x4E00;&#x8D2F;&#x6709;&#x4F53;&#x5185;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x67D3;&#x5BF9;&#x5C0F;&#x9F20;&#x809D;&#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;&#x6BD4;&#x6700;&#x4F73;&#x5355;-&#x7A81;&#x53D8;&#x548C; ~ 30-80 &#x500D;&#x9AD8;&#x4E0E;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; (WT) AAV2 capsids &#x76F8;&#x6BD4;&#x5927;&#x7EA6;&#x4E09;&#x500D;&#x66F4;&#x6709;&#x6548;&#x7684;&#x6700;&#x9AD8;&#x6C34;&#x5E73;&#x3002;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x79FB;&#x7684;&#x6539;&#x8FDB;&#x662F;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x5355;&#x7EDE;&#x57FA;&#x56E0;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; (ssAAV) &#x548C;&#x81EA;&#x6211;&#x8865;&#x5145;&#x7684;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; (scAAV) &#x5411;&#x91CF;&#xFF0C;&#x6307;&#x793A;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5F71;&#x54CD;&#x72EC;&#x7ACB;&#x7684;&#x75C5;&#x6BD2;&#x6027;&#x4E8C;&#x80A1; DNA &#x5408;&#x6210;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;Y730F &#x548C;&#x4E09;&#x7EA7;&#x8DF3;&#x8FDC;&#x7A81;&#x53D8;&#x8F7D;&#x4F53;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x56E0;&#x5B50; IX (hF.IX) &#x5728;&#x8840;&#x53CB;&#x75C5; B (HB) &#x5C0F;&#x9F20;&#x4E2D;&#x7684;&#x957F;&#x671F;&#x7597;&#x6548;&#x548C;&#x8010;&#x53D7;&#x8868;&#x8FBE;&#x5F0F;&#x540E;&#x7BA1;&#x7406;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5411;&#x91CF;&#x7684;&#x5242;&#x91CF;&#x4E0E; WT AAV2 encapsidated &#x5411;&#x91CF;&#x7684;&#x5408;&#x6210;&#x548C;&#x77AC;&#x6001;&#x8868;&#x8FBE;&#x5F0F;&#x4E2D;&#x7684;&#x552F;&#x4E00;&#x7ED3;&#x679C;&#x3002;&#x603B;&#x4E4B;&#xFF0C;&#x5728;&#x4EA7;&#x91CF;&#x81F3;&#x5C11; 30-fold &#x6539;&#x8FDB;&#x7684;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x8F7D;&#x4F53; AAV2 &#x8863;&#x58F3;&#x7ED3;&#x679C;&#x591A;&#x4E2A;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x7A81;&#x53D8;&#x5F15;&#x5165;&#x4ECE;&#x800C;&#x964D;&#x4F4E;&#x6240;&#x9700;&#x7684;&#x6CBB;&#x7597;&#x5242;&#x91CF;&#x548C;&#x53EF;&#x80FD;&#x4E0E;&#x5411;&#x91CF;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x514D;&#x75AB;&#x539F;&#x6027;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x8F7D;&#x4F53;&#x5E94;&#x5177;&#x5438;&#x5F15;&#x529B;&#x6CBB;&#x7597;&#x8840;&#x53CB;&#x75C5;&#x53CA;&#x5176;&#x4ED6;&#x9057;&#x4F20;&#x75BE;&#x75C5;&#x3002;

&#x9AD8;&#x6548;&#x7387;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x548C;&#x6821;&#x6B63;&#x7684;&#x5C0F;&#x9F20;&#x8840;&#x53CB;&#x75C5; B &#x4F7F;&#x7528;&#x6CA1;&#x6709;&#x591A;&#x4E2A;&#x8868;&#x9762;&#x66B4;&#x9732;&#x916A;&#x6C28;&#x9178; AAV2 &#x8F7D;&#x4F53;&#x3002;

Elimination of specific surface-exposed single tyrosine (Y) residues substantially improves hepatic gene transfer with adeno-associated virus type 2 (AAV2) vectors. Here, combinations of mutations in the seven potentially relevant Y residues were evaluated for further augmentation of transduction efficiency. These mutant capsids packaged viral genomes to similar titers and retained infectivity. A triple-mutant (Y444+500+730F) vector consistently had the highest level of in vivo gene transfer to murine hepatocytes, approximately threefold more efficient than the best single-mutants, and ~30-80-fold higher compared with the wild-type (WT) AAV2 capsids. Improvement of gene transfer was similar for both single-stranded AAV (ssAAV) and self-complementary AAV (scAAV) vectors, indicating that these effects are independent of viral second-strand DNA synthesis. Furthermore, Y730F and triple-mutant vectors provided a long-term therapeutic and tolerogenic expression of human factor IX (hF.IX) in hemophilia B (HB) mice after administration of a vector dose that only results in subtherapeutic and transient expression with WT AAV2 encapsidated vectors. In summary, introduction of multiple tyrosine-mutations into the AAV2 capsid results in vectors that yield at least 30-fold improvement of transgene expression, thereby lowering the required therapeutic dose and potentially vector-related immunogenicity. Such vectors should be attractive for treatment of hemophilia and other genetic diseases.

High-efficiency transduction and correction of murine hemophilia B using AAV2 vectors devoid of multiple surface-exposed tyrosines.

&#xC9;limination de sp&#xE9;cifiques expos&#xE9; en surface tyrosine seule (Y) sensiblement r&#xE9;sidus am&#xE9;liore le transfert de g&#xE8;nes de type h&#xE9;patique avec le virus ad&#xE9;no-associ&#xE9; 2 (AAV2) vecteurs. Ici, les combinaisons de mutations dans les sept r&#xE9;sidus Y potentiellement pertinents ont &#xE9;t&#xE9; &#xE9;valu&#xE9;s pour l&#x26;#39;extension de l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de transduction. Ces mutants capsides emball&#xE9; g&#xE9;nomes viraux &#xE0; des titres d&#x26;#39;infectivit&#xE9; et similaires conserv&#xE9;s. Un triple-mutant (Y444 500 730 F) vecteur toujours eu le plus haut niveau de transfert de g&#xE8;ne in vivo &#xE0; des h&#xE9;patocytes murins, environ trois fois plus efficace que les meilleurs single-mutants, et ~ 30 &#xE0; 80 fois plus &#xE9;lev&#xE9;e par rapport &#xE0; la Nature (WT) capsides AAV2. Am&#xE9;lioration du transfert de g&#xE8;nes a &#xE9;t&#xE9; similaire pour les deux monocat&#xE9;naire AAV (ssAAV) et l&#x26;#39;auto-compl&#xE9;mentaires (AAV scAAV) vecteurs, ce qui indique que ces effets sont ind&#xE9;pendants de la synth&#xE8;se de l&#x26;#39;ADN viral second brin. En outre, Y730F et triple-mutants vecteurs fourni une expression th&#xE9;rapeutique &#xE0; long terme et tol&#xE9;rog&#xE8;ne du facteur IX humain (hF.IX) dans l&#x26;#39;h&#xE9;mophilie B (HB) des souris apr&#xE8;s l&#x26;#39;administration d&#x26;#39;une dose de vecteur que seuls les r&#xE9;sultats de l&#x26;#39;expression sous-th&#xE9;rapeutique et transitoires avec WT AAV2 vecteurs encapsid&#xE9;s. En r&#xE9;sum&#xE9;, l&#x26;#39;introduction de plusieurs tyrosine-mutations dans les r&#xE9;sultats AAV2 capside dans des vecteurs qui donnent au moins 30 fois l&#x26;#39;am&#xE9;lioration de l&#x26;#39;expression du transg&#xE8;ne, ce qui diminue la dose th&#xE9;rapeutique n&#xE9;cessaire et l&#x26;#39;immunog&#xE9;nicit&#xE9; potentiellement vecteur li&#xE9;. De tels vecteurs doivent &#xEA;tre attrayants pour le traitement de l&#x26;#39;h&#xE9;mophilie et d&#x26;#39;autres maladies g&#xE9;n&#xE9;tiques.

Haute-efficacit&#xE9; de la transduction et la correction de l&#x26;#39;h&#xE9;mophilie B murin utilisant AAV2 Vecteurs d&#xE9;pourvus de multiples expos&#xE9;s en surface tyrosines

Eliminaci&#xF3;n de la tirosina espec&#xED;ficos de superficie expuesta (Y) los residuos de mejora sustancialmente la transferencia g&#xE9;nica hep&#xE1;tica con el tipo de virus adeno-asociado 2 (AAV2) vectores. Aqu&#xED;, las combinaciones de mutaciones en los siete residuos Y potencialmente relevantes fueron evaluados para el aumento en la eficiencia de la transducci&#xF3;n. Estos mutantes c&#xE1;psidas envasados &#x200B;&#x200B;genomas virales a t&#xED;tulos similares y su infectividad retenido. Un triple mutante (Y444 500 730 F) de vectores tenido constantemente el mayor nivel de transferencia g&#xE9;nica in vivo de los hepatocitos de rat&#xF3;n, aproximadamente tres veces m&#xE1;s eficiente que la mejor medida &#xFA;nica mutantes, y ~ 30 a 80 veces mayor en comparaci&#xF3;n con su h&#xE1;bitat type (WT) AAV2 c&#xE1;psides. Mejora de la transferencia de genes es similar tanto para una sola cadena AAV (ssAAV) y la auto-complementarios vectores AAV (scAAV), lo que indica que estos efectos son independientes de la s&#xED;ntesis de ADN viral del segundo cap&#xED;tulo. Por otra parte, Y730F y los vectores de tres mutantes siempre una expresi&#xF3;n a largo plazo terap&#xE9;utico y tolerog&#xE9;nico de factor IX humano (hF.IX) en la hemofilia B (HB) en ratones despu&#xE9;s de la administraci&#xF3;n de una dosis de vector que s&#xF3;lo los resultados en la expresi&#xF3;n subterap&#xE9;uticas y transitorios con WT AAV2 vectores encapsulados. En resumen, la introducci&#xF3;n de m&#xFA;ltiples tirosina-mutaciones en los resultados AAV2 c&#xE1;pside en vectores que producen al menos 30 veces la mejora de la expresi&#xF3;n del transg&#xE9;n, reduciendo as&#xED; la dosis necesaria terap&#xE9;utico e inmunogenicidad potencialmente vectores relacionados. Tales vectores debe ser atractivo para el tratamiento de la hemofilia y otras enfermedades gen&#xE9;ticas.

Alta eficiencia de transducci&#xF3;n y correcci&#xF3;n de la hemofilia B murino Con AAV2 Vectores carentes de m&#xFA;ltiples expuestas en superficie tirosinas

Beseitigung der R&uuml;ckst&auml;nde der spezifischen Oberfl&auml;che exponierten einzelne Tyrosin (Y) verbessert deutlich die hepatische Gentransfer mit Adeno-assoziierte Virus Typ 2 (AAV2) Vektoren. Hier wurden Kombinationen von Mutationen in den sieben potenziell relevante Y-R&uuml;ckst&auml;nde f&uuml;r weitere Vermehrung des Transduktion Effizienz bewertet. Diese mutierten Capsids verpackt virale Genome, &auml;hnliche Titer und Infektiosit&auml;t beibehalten. Ein dreifach-Mutant (Y444 + 500 + 730F) Vektor hatte konsequent h&ouml;chste in-vivo Gentransfer in murinen Hepatozyten, etwa dreifach effizienter als die besten Einzel-Mutanten und ~ 30-80-Fach h&ouml;her gegen&uuml;ber dem Wildtyp (WT) AAV2 Capsids. Verbesserung des Gentransfers war bei einstr&auml;ngiger AAV (SsAAV) und selbst-erg&auml;nzende AAV (ScAAV)-Vektoren, die darauf hinweist, dass diese Effekte unabh&auml;ngig von viralen Sekunde-Strang-DNA-Synthese sind &auml;hnlich. Dar&uuml;ber hinaus zur Y730F und dreifach-Mutant Vektoren einen langfristigen therapeutischen und Tolerogenic Ausdruck der menschlichen Faktor IX (hF.IX) in H&auml;mophilie B (HB) M&auml;use, nachdem die Verwaltung eines Vektors Dosis, die nur Ergebnisse in subtherapeutic und vor&uuml;bergehende Ausdruck mit WT AAV2 Encapsidated Vektoren. Zusammenfassend, Einf&uuml;hrung von mehrere Tyrosin-Mutationen in der AAV2 Kapsid Ergebnisse in Vektoren, die mindestens 30-fold Verbesserung der Transgenexpression, ergeben senken somit die erforderlichen therapeutischen Dosis und potenziell Vektor-bezogene Immunogenit&auml;t. Solche Vektoren sollten zur Behandlung der H&auml;mophilie und andere Erbkrankheiten attraktiv sein.

Hocheffiziente Transduktion und Korrektur von murinen H&auml;mophilie B mit AAV2 Vektoren mehrere Oberfl&auml;che exponierten Tyrosines.

Eliminazione dei residui di tirosina singola superficie esposta specifico (Y) migliora sostanzialmente il trasferimento genico epatica con virus adeno-associati di tipo 2 (AAV2) vettori. Qui, combinazioni di mutazioni nei sette residui potenzialmente rilevanti Y sono state valutate per ulteriore aumento dell&#39;efficienza di trasduzione. Questi mutanti capsidi confezionato genomi virali per simili titoli e mantenuto infettivit&agrave;. Un vettore di triple-mutante (Y444 + 730F 500++) aveva costantemente il massimo livello di trasferimento genico in vivo di epatociti murini, circa triplice pi&ugrave; efficienti rispetto al miglior singolo-mutanti e ~ 30-80 volte superiore rispetto i capsidi AAV2 (WT) wild-type. Miglioramento del trasferimento del gene &egrave; stata simile per auto-complementare vettori di AAV (scAAV), che indica che questi effetti sono indipendenti della sintesi di DNA virale secondo-filo e single-stranded AAV (ssAAV). Inoltre, Y730F e triple-mutante vettori fornito un&#39;espressione terapeutica e tollerogenico a lungo termine di fattore IX (hF.IX) in topi di emofilia B (HB) dopo somministrazione di un vettore di dose che risultati solo nell&#39;espressione subterapeutiche e transitorio con WT AAV2 incapsidato vettori. In sintesi, introduzione di tirosina-mutazioni multiple nei risultati del capside AAV2 nei vettori che producono almeno 30-fold miglioramento dell&#39;espressione del transgene, quindi abbassare la dose terapeutica necessaria e potenzialmente correlati a vector immunogenicit&agrave;. Tali vettori dovrebbero essere attraente per il trattamento dell&#39;emofilia e altre malattie genetiche.

Ad alta efficienza trasduzione e correzione di murino emofilia B utilizzando vettori AAV2 privo di tirosine pi&ugrave; superficie esposta.

&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x8868;&#x9762;&#x306B;&#x9732;&#x51FA;&#x3057;&#x305F;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#xFF08;Y&#xFF09;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x9664;&#x53BB;&#x306F;&#x5B9F;&#x8CEA;&#x7684;&#x306B;&#x30A2;&#x30C7;&#x30CE;&#x968F;&#x4F34;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;2&#x578B;&#xFF08;AAV2&#xFF09;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x809D;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5C0E;&#x5165;&#x3092;&#x5411;&#x4E0A;&#x3055;&#x305B;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;7&#x95A2;&#x9023;&#x3059;&#x308B;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x306E;&#x3042;&#x308B;Y&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x306F;&#x3001;&#x5C0E;&#x5165;&#x52B9;&#x7387;&#x306E;&#x66F4;&#x306A;&#x308B;&#x5897;&#x5F37;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x540C;&#x69D8;&#x306E;&#x529B;&#x4FA1;&#x3068;&#x4FDD;&#x6301;&#x3055;&#x308C;&#x611F;&#x67D3;&#x3059;&#x308B;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x3092;&#x30D1;&#x30C3;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x3002;&#x4E09;&#x91CD;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#xFF08;Y444 500 730 F&#xFF09;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306F;&#x4E00;&#x8CAB;&#x3057;&#x3066;&#x7D04;3&#x500D;&#x3001;&#x3088;&#x308A;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x6700;&#x9AD8;&#x306E;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x30EB;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x809D;&#x7D30;&#x80DE;&#x3078;&#x306E;in vivo&#x3067;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5C0E;&#x5165;&#x3067;&#x306E;&#x6700;&#x9AD8;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x301C;30&#x304B;&#x3089;80&#x500D;&#x9AD8;&#x3044;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x3066;&#x578B;&#xFF08;WT&#xFF09;AAV2&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x3002;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5C0E;&#x5165;&#x306E;&#x6539;&#x5584;&#x306F;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x4E8C;&#x672C;&#x9396;DNA&#x5408;&#x6210;&#x306E;&#x72EC;&#x7ACB;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3001;&#x4E00;&#x672C;&#x9396;AAV&#xFF08;ssAAV&#xFF09;&#x3068;&#x81EA;&#x5DF1;&#x76F8;&#x88DC;&#x7684;AAV&#xFF08;scAAV&#xFF09;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x306B;&#x985E;&#x4F3C;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;Y730F&#x3001;&#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30EB;&#x5909;&#x7570;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#xB7;&#x7528;&#x91CF;&#x306E;&#x6295;&#x4E0E;&#x5F8C;&#x3001;&#x8840;&#x53CB;&#x75C5;B&#xFF08;HB&#xFF09;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30D2;&#x30C8;&#x7B2C;IX&#x56E0;&#x5B50;&#xFF08;hF.IX&#xFF09;&#x306E;&#x9577;&#x671F;&#x6CBB;&#x7642;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x514D;&#x75AB;&#x5BDB;&#x5BB9;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x305F;WT AAV2&#x306E;&#x6CBB;&#x7642;&#x91CF;&#x4EE5;&#x4E0B;&#x306E;&#x3068;&#x4E00;&#x904E;&#x6027;&#x767A;&#x73FE;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306E;&#x307F;&#x30AB;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x3002;&#x6982;&#x8981;&#x3001;&#x5C0E;&#x5165;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x306E;&#x5C11;&#x306A;&#x304F;&#x3068;&#x3082;30&#x500D;&#x306E;&#x6539;&#x5584;&#x304C;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x308B;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306B;AAV2&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x7D50;&#x679C;&#x306B;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x5C0E;&#x5165;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5FC5;&#x8981;&#x306A;&#x6CBB;&#x7642;&#x7528;&#x91CF;&#x3092;&#x524A;&#x6E1B;&#x3057;&#x3001;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x95A2;&#x9023;&#x514D;&#x75AB;&#x539F;&#x6027;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x305D;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x8840;&#x53CB;&#x75C5;&#x3084;&#x305D;&#x306E;&#x4ED6;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x6027;&#x75BE;&#x60A3;&#x306E;&#x6CBB;&#x7642;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x9B45;&#x529B;&#x7684;&#x3067;&#x306A;&#x3051;&#x308C;&#x3070;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;

&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x8868;&#x9762;&#x306B;&#x9732;&#x51FA;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x3092;&#x6B20;&#x3044;AAV2&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x8840;&#x53CB;&#x75C5;B&#x306E;&#x9AD8;&#x52B9;&#x7387;&#x4F1D;&#x9054;&#x3068;&#x8A02;&#x6B63;

&#xD2B9;&#xC815; &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0; &#xB178;&#xCD9C; &#xB41C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; (Y) &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC758; &#xC81C;&#xAC70;&#xB294; &#xC2E4;&#xC9C8;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xAC04;&#xC7A5; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC804;&#xC1A1;&#xC744; &#xD5A5;&#xC0C1; adeno &#xC81C;&#xD734;&#xD574; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; 2 (AAV2) &#xACBD;&#xB85C; &#xC785;&#xB825; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;, 7 &#xAC1C;&#xC758; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; Y &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xC870;&#xD569; &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728;&#xC758; &#xCD94;&#xAC00; &#xD655;&#xB300;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; capsids &#xBE44;&#xC2B7;&#xD55C; titers&#xC5D0; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; &#xAC8C;&#xB188; &#xB418;&#xBA70; infectivity &#xC720;&#xC9C0;. &#xD2B8;&#xB9AC;&#xD50C;-&#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; (Y444 + 500 + 730F) &#xBCA1;&#xD130;&#xB294; &#xC77C;&#xAD00; &#xB418; &#xAC8C; murine hepatocytes, &#xC57D; &#xC0BC; &#xBC30; &#xB354; &#xCD5C;&#xACE0;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; ~ 30-80 &#xBC30; &#xB354; &#xB192;&#xC740; &#xC57C;&#xC0DD;-&#xD0C0;&#xC785; (WT) AAV2 capsids&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; in vivo &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC774;&#xB3D9;&#xC758; &#xAC00;&#xC7A5; &#xB192;&#xC740; &#xC218;&#xC900;&#xC744; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC774;&#xB3D9;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; AAV (ssAAV)&#xC640; &#xC790;&#xCCB4; &#xBCF4;&#xC644; AAV (scAAV) &#xBCA1;&#xD130;, &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xD6A8;&#xACFC; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; 2 &#xAC00;&#xB2E5; DNA &#xD569;&#xC131;&#xC5D0; &#xAD00;&#xACC4; &#xC5C6;&#xC774; &#xBAA8;&#xB450; &#xBE44;&#xC2B7; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, Y730F &#xBC0F; &#xD2B8;&#xB9AC;&#xD50C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBCA1;&#xD130; &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xBCF5;&#xC6A9;&#xB7C9; WT AAV2 encapsidated &#xBCA1;&#xD130;&#xC640; subtherapeutic &#xBC0F; &#xACFC;&#xB3C4; &#xC2DD;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC720;&#xC77C;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; &#xADF8; &#xD6C4; &#xD608;&#xC6B0;&#xBCD1; B (HB) &#xC0DD;&#xC950;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC778;&#xAC04; &#xC778;&#xC790; IX (hF.IX)&#xC758; &#xC7A5;&#xAE30;&#xC801;&#xC778; &#xCE58;&#xB8CC;&#xC640; tolerogenic &#xC2DD;&#xC5D0; &#xC81C;&#xACF5;. &#xC694;&#xC57D; &#xD558;&#xC790;&#xBA74;, &#xC801;&#xC5B4;&#xB3C4; 30-fold &#xAC1C;&#xC120; transgene &#xC2DD;&#xC758; &#xC591;&#xBCF4;&#xB294; &#xBCA1;&#xD130;&#xB97C; AAV2 capsid &#xACB0;&#xACFC;&#xC5D0; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0;-&#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xB3C4;&#xC785; &#xD568;&#xC73C;&#xB85C;&#xC368; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; &#xCE58;&#xB8CC; &#xBCF5;&#xC6A9;&#xB7C9; &#xBC0F; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCA1;&#xD130; &#xAD00;&#xB828; immunogenicity &#xB0AE;&#xCD94;&#xB294;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xBCA1;&#xD130; &#xD608;&#xC6B0;&#xBCD1;&#xACFC; &#xB2E4;&#xB978; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC9C8;&#xD658;&#xC758; &#xCE58;&#xB8CC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB9E4;&#xB825;&#xC774; &#xC788;&#xC5B4;&#xC57C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xACE0;&#xD6A8;&#xC728; &#xBCC0;&#xD658; &#xBC0F; murine &#xD608;&#xC6B0;&#xBCD1; B&#xC758; &#xAD50;&#xC815; &#xC5C6;&#xB294; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xD45C;&#xBA74; &#xB178;&#xCD9C; tyrosines AAV2 &#xBCA1;&#xD130;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;.

&#x5728;&#x8BB8;&#x591A;&#x57FA;&#x56E0;&#x4F20;&#x9012;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x5728;&#x89C6;&#x7F51;&#x819C;&#x4E2D;&#x7684;&#x51E0;&#x4E2A;&#x6210;&#x529F;&#x7684;&#x4E34;&#x5E8A;&#x8BD5;&#x9A8C;&#x7684;&#x4E00;&#x79CD;&#x7C7B;&#x578B;&#x7684;&#x83B1;&#x5148;&#x5929;&#x6027; amaurosis &#x5DF2;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x4F7F;&#x7528;&#x57FA;&#x4E8E;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8840;&#x6E05;&#x578B; 2 &#xFF08;AAV2&#xFF09; &#x7684;&#x5411;&#x91CF;&#x3002;&#x8BB8;&#x591A;&#x7814;&#x7A76;&#x4FA7;&#x91CD;&#x4E8E;&#x63D0;&#x9AD8; AAV2 &#x8F6C;&#x5BFC;&#x6548;&#x7387;&#x548C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x57FA;&#x56E0;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x53CA;&#x5176;&#x8863;&#x58F3;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4EE5;&#x524D;&#x5DF2;&#x7ECF;&#x8868;&#x660E;&#x542B;&#x6709;&#x8F7D;&#x4F53;&#x7684;&#x5355;&#x70B9;&#x7A81;&#x53D8;&#x7684;&#x8863;&#x58F3;&#x8868;&#x9762;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x5728;&#x8840;&#x6E05;&#x578B; AAV2&#x3001; AAV8&#x3001; AAV9 &#x663E;&#x793A;&#x5728;&#x89C6;&#x7F51;&#x819C;&#x4E0E;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x7684;&#x540C;&#x884C;&#x76F8;&#x6BD4;&#x5927;&#x5927;&#x589E;&#x52A0;&#x7684;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x6548;&#x7387;&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BC4;&#x4EF7; AAV2 &#x8F7D;&#x4F53;&#x7EC4;&#x5408;&#x591A;&#x4E2A;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x5BF9;&#x6210;&#x5E74;&#x5C0F;&#x9F20;&#x89C6;&#x7F51;&#x819C;&#x6216;&#x73BB;&#x7483;&#x4F53;&#x8154;&#x5185;&#x5206;&#x5A29;&#x540E;&#x7684;&#x4E03;&#x4E2A;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x4FDD;&#x5B88;&#x7684;&#x8868;&#x9762;&#x66B4;&#x9732;&#x8863;&#x58F3;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x4E2D;&#x7684;&#x82EF;&#x4E19;&#x6C28;&#x9178;&#x7A81;&#x53D8;&#x7684;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x7279;&#x5F81;&#x3002;&#x4E58;&#x6CD5;&#x7A81;&#x53D8;&#x8F7D;&#x4F53;&#x5C55;&#x793A;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x4F53;&#x5185;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x5C5E;&#x6027;&#xFF0C;&#x5177;&#x6709;&#x4E00;&#x4E9B;&#x72EC;&#x7279;&#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#xFF0C;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x5728;&#x89C6;&#x7F51;&#x819C;&#x7684;&#x6240;&#x6709;&#x56FE;&#x5C42;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B0;&#x578B;&#x7684;&#x8F7D;&#x4F53;&#x53EF;&#x80FD;&#x6709;&#x76CA;&#x4E8E;&#x53D1;&#x5C55;&#x4E2D;&#x56FD;&#x5BB6;&#x7684;&#x8BB8;&#x591A;&#x9057;&#x4F20;&#x75BE;&#x75C5;&#x6CBB;&#x7597;&#x7684;&#x5B9D;&#x8D35;&#x65B0;&#x7684;&#x6CBB;&#x7597;&#x7B56;&#x7565;&#x3002;

&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x7A81;&#x53D8; AAV2 &#x8F7D;&#x4F53;&#x5728;&#x5C0F;&#x9F20;&#x89C6;&#x7F51;&#x819C;&#x7684;&#x65B0;&#x9896;&#x7279;&#x6027;&#x3002;

Vectors based on adeno-associated virus serotype 2 (AAV2) have been used extensively in many gene-delivery applications, including several successful clinical trials for one type of Leber congenital amaurosis in the retina. Many studies have focused on improving AAV2 transduction efficiency and cellular specificity by genetically engineering its capsid. We have previously shown that vectors-containing single-point mutations of capsid surface tyrosines in serotypes AAV2, AAV8, and AAV9 displayed significantly increased transduction efficiency in the retina compared with their wild-type counterparts. In the present study, we evaluated the transduction characteristics of AAV2 vectors containing combinations of multiple tyrosine to phenylalanine mutations in seven highly conserved surface-exposed capsid tyrosine residues following subretinal or intravitreal delivery in adult mice. The multiply mutated vectors exhibited different in vivo transduction properties, with some having a unique ability of transgene expression in all retinal layers. Such novel vectors may be useful in developing valuable new therapeutic strategies for the treatment of many genetic diseases.

Novel properties of tyrosine-mutant AAV2 vectors in the mouse retina.

Los vectores basados &#x200B;&#x200B;en virus adeno-asociado serotipo 2 (AAV2) han sido ampliamente utilizados en muchas aplicaciones de inserci&#xF3;n de genes, incluyendo varios ensayos cl&#xED;nicos de &#xE9;xito para un tipo de amaurosis cong&#xE9;nita de Leber en la retina. Muchos estudios se han centrado en la mejora de la eficiencia de la transducci&#xF3;n de AAV2 y la especificidad celular de la manipulaci&#xF3;n gen&#xE9;tica de su c&#xE1;pside. Hemos demostrado anteriormente que los vectores que contienen mutaciones de un solo punto de tirosinas superficie de la c&#xE1;psida de los serotipos, la AAV2 AAV8 y AAV9 muestra de eficiencia aument&#xF3; significativamente la transducci&#xF3;n de la retina en comparaci&#xF3;n con sus hom&#xF3;logos de tipo silvestre. En el presente estudio, se evaluaron las caracter&#xED;sticas de transducci&#xF3;n de AAV2 vectores que contienen combinaciones de m&#xFA;ltiples tirosina a la fenilalanina en siete mutaciones altamente conservados expuestos en la superficie los residuos de la c&#xE1;pside de tirosina despu&#xE9;s de la entrega subretiniana o intrav&#xED;trea en ratones adultos. Los vectores se multiplican mutados exhibi&#xF3; diferente en las propiedades de transducci&#xF3;n in vivo, con algo de tener una capacidad &#xFA;nica de expresi&#xF3;n del transg&#xE9;n en todas las capas de la retina. Tales vectores novedosos puede ser &#xFA;til en el desarrollo de nuevas estrategias terap&#xE9;uticas valiosos para el tratamiento de muchas enfermedades gen&#xE9;ticas.

Nuevas propiedades de la tirosina-mutantes AAV2 Vectores en la retina del rat&#xF3;n

Des vecteurs bas&#xE9;s sur le virus ad&#xE9;no-associ&#xE9; de s&#xE9;rotype 2 (AAV2) ont &#xE9;t&#xE9; largement utilis&#xE9;s dans de nombreux g&#xE8;nes de livraison des applications, y compris avec succ&#xE8;s plusieurs essais cliniques pour un type de amaurose cong&#xE9;nitale de Leber dans la r&#xE9;tine. De nombreuses &#xE9;tudes ont mis l&#x26;#39;accent sur l&#x26;#39;am&#xE9;lioration de l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de transduction AAV2 et la sp&#xE9;cificit&#xE9; cellulaire par g&#xE9;nie g&#xE9;n&#xE9;tique de sa capside. Nous avons pr&#xE9;c&#xE9;demment montr&#xE9; que les vecteurs contenant un seul point de mutations tyrosines surface de la capside dans s&#xE9;rotypes AAV2, les AAV8 et AAV9 efficacit&#xE9; affich&#xE9;e transduction augment&#xE9; de fa&#xE7;on significative dans la r&#xE9;tine par rapport &#xE0; leurs homologues de type sauvage. Dans la pr&#xE9;sente &#xE9;tude, nous avons &#xE9;valu&#xE9; les caract&#xE9;ristiques de transduction de AAV2 vecteurs contenant des combinaisons de tyrosine multiples &#xE0; la ph&#xE9;nylalanine mutations dans sept hautement conserv&#xE9;es expos&#xE9;s en surface des r&#xE9;sidus de tyrosine de capside qui suivent l&#x26;#39;accouchement sous-r&#xE9;tinien ou intravitr&#xE9;enne chez des souris adultes. Les vecteurs se multiplient mut&#xE9;s expos&#xE9;es diff&#xE9;rente dans les propri&#xE9;t&#xE9;s de transduction in vivo, certaines ayant une capacit&#xE9; unique d&#x26;#39;expression du transg&#xE8;ne dans toutes les couches de la r&#xE9;tine. Ces nouveaux vecteurs peut &#xEA;tre utile dans le d&#xE9;veloppement de pr&#xE9;cieuses nouvelles strat&#xE9;gies th&#xE9;rapeutiques pour le traitement de nombreuses maladies g&#xE9;n&#xE9;tiques.

De nouvelles propri&#xE9;t&#xE9;s de la tyrosine-mutantes AAV2 Vecteurs dans la r&#xE9;tine de souris

Vektoren, die auf der Grundlage von Adeno-assoziierte Virus Serotyp 2 (AAV2) wurden ausgiebig in viele gen-Lieferung-Anwendungen, einschlie&szlig;lich mehreren erfolgreiche klinische Studien f&uuml;r eine kongenitale Amaurose Leber in der Netzhaut eingesetzt. Viele Studien konzentrierten sich auf die Verbesserung von AAV2 Transduktion Effizienz und zellul&auml;re Spezifit&auml;t von genetisch Ingenieur seine Kapsid. Wir haben bereits gezeigt, dass Vektoren-haltigen Einzelpunkt-Mutationen Kapsid Oberfl&auml;che Tyrosines in Serotypen AAV2, AAV8 und AAV9 in der Retina, verglichen mit ihren Gegenst&uuml;cken Wildtyp deutlich gestiegenen Transduktion Effizienz angezeigt. In der vorliegenden Studie werteten wir die Transduktion Merkmale AAV2 Vektoren mit Kombinationen von mehreren Tyrosin Phenylalanin Mutationen in sieben stark konservierten Oberfl&auml;che exponierten Kapsid Tyrosin R&uuml;ckst&auml;nde nach Subretinal oder Intravitreal Lieferung in Erwachsenen M&auml;usen. Das Multiplizieren mutierte Vektoren ausgestellt verschiedene in-vivo-Transduktion Eigenschaften, einige haben eine einzigartige F&auml;higkeit der Transgenexpression in allen Schichten der Netzhaut. Diese neuartigen Vektoren n&uuml;tzlich bei der Entwicklung wertvoller neuer therapeutischer Strategien zur Behandlung von vielen Erbkrankheiten.

Neuartige Eigenschaften von Tyrosin-Mutant AAV2 Vektoren in der Netzhaut Maus.

Vettori basati su virus adeno-associato sierotipo 2 (AAV2) sono stati ampiamente utilizzati in molte applicazioni di gene-consegna, tra cui diversi studi clinici successo per un tipo di Amaurosi congenita di Leber nella retina. Molti studi si sono concentrati sul miglioramento di efficienza di trasduzione AAV2 e specificit&agrave; cellulare da ingegneria geneticamente suo capside. Abbiamo precedentemente dimostrato che mutazioni di singolo punto vettori contenenti delle tirosine superficie del capside in sierotipi AAV2, AAV8 e AAV9 visualizzato trasduzione significativamente maggiore efficienza nella retina rispetto ai loro omologhi di wild-type. Nel presente studio, abbiamo valutato le caratteristiche di trasduzione di AAV2 vettori contenenti combinazioni di multipla tirosina a mutazioni di fenilalanina in sette residui di tirosina altamente conservata del capside superficie esposta dopo consegna subretinal o intravitreal in topi adulti. Il moltiplicare mutato vettori esposte trasduzione in vivo diverse propriet&agrave;, con alcuni avendo una capacit&agrave; unica di espressione del transgene in tutti gli strati della retina. Tali vettori romanzo possono essere utile nello sviluppo di importanti nuove strategie terapeutiche per il trattamento di molte malattie genetiche.

Nuove propriet&agrave; dei vettori AAV2 tirosina-mutante nella retina del mouse.

&#x30A2;&#x30C7;&#x30CE;&#x968F;&#x4F34;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;2&#x578B;&#xFF08;AAV2&#xFF09;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x304F;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x7DB2;&#x819C;&#x306E;&#x30EC;&#x30FC;&#x30D0;&#x30FC;&#x5148;&#x5929;&#x6027;&#x9ED2;&#x5185;&#x969C;&#x306E;1&#x3064;&#x306E;&#x578B;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x6210;&#x529F;&#x3057;&#x305F;&#x81E8;&#x5E8A;&#x8A66;&#x9A13;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3001;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x914D;&#x4FE1;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;&#x5E83;&#x304F;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x3001;&#x907A;&#x4F1D;&#x7684;&#x306B;&#x305D;&#x306E;&#x30AB;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x3092;&#x5DE5;&#x5B66;&#x7684;&#x306B;AAV2&#x5C0E;&#x5165;&#x52B9;&#x7387;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x6539;&#x5584;&#x306B;&#x7126;&#x70B9;&#x3092;&#x5F53;&#x3066;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x4EE5;&#x524D;&#x3001;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x30EB;&#x30DD;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;&#x8840;&#x6E05;&#x578B;AAV2&#x3001;AAV8&#x306E;&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x8868;&#x9762;&#x306E;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x305D;&#x306E;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x3066;&#x7DB2;&#x819C;&#x306B;AAV9&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x5897;&#x52A0;&#x4F1D;&#x9054;&#x52B9;&#x7387;&#x3092;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x304C;&#x542B;&#x3080;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x6210;&#x4F53;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x306E;&#x7DB2;&#x819C;&#x4E0B;&#x53C8;&#x306F;&#x785D;&#x5B50;&#x4F53;&#x5185;&#x9001;&#x9054;&#x5F8C;7&#x9AD8;&#x5EA6;&#x306B;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x8868;&#x9762;&#x306B;&#x9732;&#x51FA;&#x3057;&#x305F;&#x30AB;&#x30D7;&#x30B7;&#x30C9;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306B;&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x30D5;&#x30A7;&#x30CB;&#x30EB;&#x30A2;&#x30E9;&#x30CB;&#x30F3;&#x306B;&#x3001;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x3092;&#x542B;&#x3080;AAV2&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x4F1D;&#x9054;&#x7279;&#x6027;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x4E57;&#x7B97;&#x5909;&#x7570;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306F;&#x3001;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x7DB2;&#x819C;&#x5C64;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x5C0E;&#x5165;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x306E;&#x30E6;&#x30CB;&#x30FC;&#x30AF;&#x306A;&#x80FD;&#x529B;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3068;&#x3082;&#x306B;&#x3001;&#x751F;&#x4F53;&#x5185;&#x60C5;&#x5831;&#x4F1D;&#x9054;&#x306E;&#x7279;&#x6027;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x51FA;&#x5C55;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x65B0;&#x898F;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x6027;&#x75BE;&#x60A3;&#x306E;&#x6CBB;&#x7642;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8CB4;&#x91CD;&#x306A;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x6CBB;&#x7642;&#x6226;&#x7565;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x306B;&#x5F79;&#x306B;&#x7ACB;&#x3064;&#x304B;&#x3082;&#x3057;&#x308C;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;

&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x7DB2;&#x819C;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x5909;&#x7570;AAV2&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x5C0F;&#x8AAC;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D1;&#x30C6;&#x30A3;

&#xBCA1;&#xD130; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; adeno &#xC81C;&#xD734;&#xD574; serotype 2 (AAV2)&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xB9DD;&#xB9C9; Leber&#xC758; &#xC120;&#xCC9C;&#xC801;&#xC778; &#xD751;&#xC758; &#xD55C; &#xC885;&#xB958;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBA87; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC131;&#xACF5;&#xC801;&#xC778; &#xC784;&#xC0C1; &#xC2DC;&#xD5D8;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558; &#xC5EC; &#xB9CE;&#xC740; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC30;&#xB2EC; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD11;&#xBC94;&#xC704; &#xD558; &#xAC8C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB9CE;&#xC740; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xACF5;&#xD559;&#xC758; capsid &#xC5EC; AAV2 &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728;&#xACFC; &#xC138;&#xD3EC; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC744; &#xAC1C;&#xC120;&#xC5D0; &#xC9D1;&#xC911; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; serotypes AAV2, AAV8, &#xBC0F; aav9&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; capsid &#xD45C;&#xBA74; tyrosines&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xD3EC;&#xC778;&#xD2B8; &#xBCC0;&#xC774; &#xBCA1;&#xD130; &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xB9DD;&#xB9C9; &#xC57C;&#xC0DD;-&#xD0C0;&#xC785; &#xB4E4;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xD06C;&#xAC8C; &#xC99D;&#xAC00; &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728; &#xD45C;&#xC2DC; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0AC;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD604;&#xC7AC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC131;&#xC778; &#xC950;&#xC5D0; subretinal &#xB098; intravitreal &#xBC30;&#xB2EC; &#xB2E4;&#xC74C; 7 &#xB192;&#xC740; &#xBCF4;&#xC874;&#xB41C; &#xD45C;&#xBA74; &#xB178;&#xCD9C; capsid &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xD398;&#xB2D0;&#xC54C;&#xB77C;&#xB2CC; &#xBCC0;&#xC774; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0;&#xC758; &#xC870;&#xD569;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; AAV2 &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xBCC0;&#xD658; &#xD2B9;&#xC131; &#xD3C9;&#xAC00;. &#xACF1;&#xD558;&#xAE30; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xB9DD;&#xB9C9; &#xCE35;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC77C;&#xBD80; &#xB370; transgene &#xC2DD;&#xC758; &#xB3C5;&#xD2B9;&#xD55C; &#xB2A5;&#xB825;&#xC744; &#xD568;&#xAED8; &#xC804;&#xC2DC; &#xD558; &#xACE0; &#xBCA1;&#xD130; &#xB2E4;&#xB978; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74; &#xBCC0;&#xD658; &#xC18D;&#xC131;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC18C;&#xC124; &#xBCA1;&#xD130; &#xB9CE;&#xC740; &#xC720;&#xC804; &#xC9C8;&#xD658;&#xC758; &#xCE58;&#xB8CC;&#xB97C; &#xC704;&#xD574; &#xADC0;&#xC911; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xCE58;&#xB8CC; &#xC804;&#xB7B5;&#xC758; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC5D0; &#xC720;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; AAV2 &#xBCA1;&#xD130; &#xB9C8;&#xC6B0;&#xC2A4; &#xB9DD;&#xB9C9;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xC18C;&#xC124; &#xC18D;&#xC131;.

Recientemente hemos demostrado que la co-administraci&#xF3;n de una sola cadena convencional de virus adeno-asociado 2 (ssAAV2) con auto-vectores complementarios (sc) AAV2-prote&#xED;na fosfatasa vectores 5 (PP5) conduce a un aumento significativo en la eficiencia de transducci&#xF3;n de los vectores ssAAV2 en c&#xE9;lulas humanas in vitro, as&#xED; como en los hepatocitos murinos in vivo. En el presente estudio, esta estrategia ha sido optimizado mediante la generaci&#xF3;n de una poblaci&#xF3;n mixta de ssAAV2-EGFP y vectores scAAV2 PP5-en una proporci&#xF3;n de 10:01 para lograr una mayor prote&#xED;na verde fluorescente (EGFP) la expresi&#xF3;n del transgen en aproximadamente 5 - a 10 veces una mayor eficiencia, tanto in vitro como in vivo. Este m&#xE9;todo simple de coproducci&#xF3;n deben ser adaptables a cualquier vector de serotipo ssAAV contiene casetes transg&#xE9;nicos que son demasiado grandes para ser encapsulados en vectores scAAV.

Un m&#xE9;todo simple para aumentar la eficiencia de transducci&#xF3;n de un solo hundidos vectores de virus adeno-asociados in vitro e in vivo

&#xC6B0;&#xB9AC; &#xCD5C;&#xADFC; &#xAE30;&#xC874;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; adeno &#xAD00;&#xB828; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xC758; &#xADF8; co-administration&#xC744; 2 (ssAAV2) &#xBCA1;&#xD130; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD558;&#xB294; &#xC790;&#xCCB4; &#xBCF4;&#xC644; (sc) AAV2-&#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC778;&#xC0B0; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD6A8;&#xC18C; 5 (PP5) &#xBCA1;&#xD130; &#xB9AC;&#xB4DC; &#xD06C;&#xAC8C; &#xC99D;&#xAC00;&#xB97C; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC138;&#xD3EC;&#xB97C; &#xCCB4; &#xC678;&#xC5D0;&#xC11C; ssAAV2 &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBFD0;&#xB9CC; murine hepatocytes in vivo&#xC5D0;&#xC11C;. &#xD604;&#xC7AC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC774; &#xC804;&#xB7B5;&#xC744; &#xB354; ssAAV2 EGFP&#xC758; &#xD63C;&#xD569; &#xB41C; &#xC778;&#xAD6C;&#xB97C; &#xC0DD;&#xC131; &#xD558; &#xC5EC; &#xCD5C;&#xC801;&#xD654; &#xB41C; &#xD558; &#xACE0; &#xB2EC;&#xC131; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; 10:1 &#xBE44;&#xC728;&#xB85C; scAAV2 PP5 &#xBCA1;&#xD130; &#xAC15;&#xD654; &#xC57D; 5-&#xC5D0; 10 &#xBC30; &#xB354; &#xB192;&#xC740; &#xD6A8;&#xC728;, &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678; &#xBC0F; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB179;&#xC0C9; &#xD615;&#xAD11; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (EGFP) transgene &#xC2DD;. &#xC774; &#xAC04;&#xB2E8;&#xD55C; &#xD504;&#xB80C;&#xC988; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC; transgene &#xCE74;&#xC138;&#xD2B8; &#xB108;&#xBB34; &#xCEE4;&#xC11C; &#xC218; encapsidated scAAV &#xBCA1;&#xD130;&#xC5D0; &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xBAA8;&#xB4E0; ssAAV serotype &#xBCA1;&#xD130;&#xC5D0; &#xC801;&#xC751;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC5B4;&#xC57C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678; &#xBC0F; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; adeno &#xC81C;&#xD734;&#xD574; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xBCA1;&#xD130;&#xC758; &#xBCC0;&#xD658; &#xD6A8;&#xC728;&#xC744; &#xC99D;&#xAC00; &#xD558;&#xB294; &#xAC04;&#xB2E8;&#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;.

&#x6211;&#x4EEC;&#x6700;&#x8FD1;&#x663E;&#x793A;&#x7684;&#x5171;&#x7BA1;&#x7684;&#x5E38;&#x89C4;&#x5355;&#x7EDE;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2; 2 (ssAAV2) &#x5411;&#x91CF;&#x4E0E;&#x81EA;&#x6211;&#x8865;&#x5145; (sc) AAV2 &#x86CB;&#x767D;&#x78F7;&#x9178;&#x9176; (PP5) 5 &#x8F7D;&#x4F53;&#x5BFC;&#x81F4;&#x5927;&#x5E45;&#x5EA6;&#x589E;&#x52A0;&#x7684; ssAAV2 &#x5A92;&#x4ECB;&#x5728;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x6548;&#x7387;&#x4EE5;&#x53CA;&#x5728;&#x5C0F;&#x9F20;&#x809D;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4F53;&#x5185;&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E00;&#x6218;&#x7565;&#x5DF2;&#x8FDB;&#x884C;&#x4E86;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x4F18;&#x5316;&#x6240;&#x751F;&#x6210;&#x7684; ssAAV2 &#x4E0E;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x6DF7;&#x5408;&#x7684;&#x4EBA;&#x53E3;&#x548C; scAAV2 PP5 &#x8F7D;&#x4F53;&#x5728; 10:1 &#x7684;&#x6BD4;&#x4F8B;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x8FBE;&#x5230;&#x589E;&#x5F3A;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D; (EGFP) &#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x5728;&#x5927;&#x7EA6; 5-&#x5230; 10 &#x500D;&#x66F4;&#x9AD8;&#x6548;&#x7387;&#xFF0C;&#x5728;&#x4F53;&#x5916;&#x548C;&#x4F53;&#x5185;&#x3002;&#x6B64;&#x7B80;&#x5355;&#x5408;&#x62CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5E94;&#x8BE5;&#x9002;&#x5E94;&#x4EFB;&#x4F55;&#x8F6C;&#x57FA;&#x56E0;&#x5F55;&#x97F3;&#x5E26;&#xFF0C;&#x662F;&#x592A;&#x5927;&#xFF0C;&#x65E0;&#x6CD5;&#x5728; scAAV &#x8F7D;&#x4F53; encapsidated &#x7684; ssAAV &#x8840;&#x6E05;&#x578B;&#x8F7D;&#x4F53;&#x3002;

&#x7B80;&#x5355;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6765;&#x63D0;&#x9AD8;&#x5355;&#x7EDE;&#x817A;&#x76F8;&#x5173;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8F7D;&#x4F53;&#x4F53;&#x5916;&#x548C;&#x4F53;&#x5185;&#x7684;&#x4F20;&#x5BFC;&#x6548;&#x7387;&#x3002;

We have recently shown that co-administration of conventional single-stranded adeno-associated virus 2 (ssAAV2) vectors with self-complementary (sc) AAV2-protein phosphatase 5 (PP5) vectors leads to a significant increase in the transduction efficiency of ssAAV2 vectors in human cells in vitro as well as in murine hepatocytes in vivo. In the present study, this strategy has been further optimized by generating a mixed population of ssAAV2-EGFP and scAAV2-PP5 vectors at a 10:1 ratio to achieve enhanced green fluorescent protein (EGFP) transgene expression at approximately 5- to 10-fold higher efficiency, both in vitro and in vivo. This simple coproduction method should be adaptable to any ssAAV serotype vector containing transgene cassettes that are too large to be encapsidated in scAAV vectors.

A simple method to increase the transduction efficiency of single-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo.

Nous avons r&#xE9;cemment montr&#xE9; que la co-administration de classique simple brin virus ad&#xE9;no-associ&#xE9; 2 (ssAAV2) vecteurs avec l&#x26;#39;auto-compl&#xE9;mentaires (sc) vecteurs phosphatase 5 (PP5) AAV2-prot&#xE9;ine conduit &#xE0; une augmentation significative de l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de transduction des vecteurs ssAAV2 dans les cellules humaines in vitro ainsi que dans les h&#xE9;patocytes murins in vivo. Dans la pr&#xE9;sente &#xE9;tude, cette strat&#xE9;gie a &#xE9;t&#xE9; encore optimis&#xE9; en g&#xE9;n&#xE9;rant une population mixte de ssAAV2-EGFP et scAAV2-PP5 vecteurs &#xE0; un ratio de 10:1 am&#xE9;lior&#xE9; pour atteindre verte fluorescente expression du transg&#xE8;ne prot&#xE9;ines (EGFP) &#xE0; environ 5 - &#xE0; 10 fois une plus grande efficacit&#xE9;, &#xE0; la fois in vitro et in vivo. Cette m&#xE9;thode simple, coproduction doit &#xEA;tre adaptable &#xE0; n&#x26;#39;importe quel vecteur s&#xE9;rotype ssAAV contenant des transg&#xE8;nes cassettes qui sont trop volumineux pour &#xEA;tre encapsid&#xE9; dans des vecteurs scAAV.

Une m&#xE9;thode simple pour augmenter l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de la transduction du simple brin des vecteurs viraux ad&#xE9;no-associ&#xE9;s in vitro et in vivo

Wir haben k&uuml;rzlich gezeigt, dass gleichzeitige Gabe von konventionellen einzelstr&auml;ngige Adeno-assoziierte Virus 2 (ssAAV2) Vektoren mit selbst-erg&auml;nzende (sc) AAV2-Protein Phosphatase 5 (PP5) Vektoren f&uuml;hrt zu einem signifikanten Anstieg der Transduktion Effizienz der ssAAV2 Vektoren in menschlichen Zellen in vitro als auch in murinen Hepatozyten in-vivo. In der vorliegenden Studie wurde diese Strategie durch generieren eine gemischte Bev&ouml;lkerung von ssAAV2-EGFP weiter optimiert, und scAAV2-PP5 Vektoren im Verh&auml;ltnis 10:1 zu erreichen verbesserte gr&uuml;n fluoreszierendes Protein (EGFP) Transgenexpression bei ca. 5 - bis 10 - 8-fach h&ouml;here Effizienz, in vitro und in-vivo. Diese einfache Koproduktion-Methode sollte an jeder SsAAV-Serotyp-Vektor mit Transgene-Kassetten, die zu gro&szlig; werden Encapsidated in ScAAV-Vektoren sind anpassbar.

Eine einfache Methode zur Steigerung der Effizienz der Transduktion einzelstr&auml;ngige Adeno-assoziierte Virus-Vektoren in vitro und in vivo.

Abbiamo recentemente dimostrato che co-somministrazione di virus adeno-associati single-stranded convenzionale 2 vettori (ssAAV2) con fosfatasi self-complementari (sc) AAV2-proteina 5 (PP5) vettori conduce ad un significativo aumento dell&#39;efficienza di trasduzione dei vettori ssAAV2 nelle cellule umane in vitro cos&igrave; come in murini epatociti in vivo. Nel presente studio, questa strategia &egrave; stata ulteriormente ottimizzata generando una popolazione mista di ssAAV2-EGFP e scAAV2-PP5 vettori in un rapporto di 10:1 per ottenere maggiore espressione del transgene green fluorescent protein (EGFP) a circa 5 a 10 volte maggiore efficienza sia in vitro che in vivo. Questo metodo semplice coproduzione dovrebbe essere adattabile a qualsiasi vettore sierotipo ssAAV contenente cassette transgene che sono troppo grandi per essere incapsidato in scAAV vettori.

Un metodo semplice per aumentare l&#39;efficienza di trasduzione dei vettori single-stranded virus adeno-associati in vitro e in vivo.

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Article	Year
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A simple method to increase the transduction efficiency of single-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Human gene therapy\| PubMed ID: 21219084	2011

Baozheng Li

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