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Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

University of California San Francisco 

A film-handling machine (robot) has been built which can, in conjunction with a commercially available film densitometer, exchange and digitize over 300 electron micrographs per day. Implementation of robotic film handling effectively eliminates the delay and tedium associated with digitizing images when data are initially recorded on photographic film. The modulation transfer function (MTF) of the commercially available densitometer is significantly worse than that of a high-end, scientific microdensitometer. Nevertheless, its signal-to-noise ratio (S/N) is quite excellent, allowing substantial restoration of the output to "near-to-perfect" performance. Due to the large area of the standard electron microscope film that can be digitized by the commercial densitometer (up to 10,000 x 13,680 pixels with an appropriately coded holder), automated film digitization offers a fast and inexpensive alternative to high-end CCD cameras as a means of acquiring large amounts of image data in electron microscopy.

High-throughput film-densitometry: an efficient approach to generate large data sets.

A construit une machine de traitement des films (robot) qui peuvent, en conjonction avec un densitom&egrave;tre film disponible sur le march&eacute;, d&#39;&eacute;changer et num&eacute;riser plus de 300 photographies au microscope &eacute;lectronique par jour. Mise en &oelig;uvre du film robotic manipulation efficace &eacute;limine le retard et l&#39;ennui associ&eacute; &agrave; num&eacute;riseurs des images lorsque les donn&eacute;es sont initialement enregistr&eacute;es sur pellicule photographique. La fonction de transfert de modulation (MTF) du densitom&egrave;tre disponible dans le commerce est bien pire que celle d&#39;un microdensitom&egrave;tre haut de gamme, scientifique. N&eacute;anmoins, son ratio signal-bruit (S/N) est tout &agrave; fait excellent, ce qui permet de restauration substantielle de la production au rendement &laquo; pr&egrave;s de perfection &raquo;. En raison de la grande surface du film standard microscope &eacute;lectronique qui peut &ecirc;tre num&eacute;ris&eacute; par le densitom&egrave;tre commercial (jusqu&#39;&agrave; 10 000 x 13 680 pixels avec un support correctement cod&eacute;), num&eacute;risation de film automatis&eacute; offre une alternative rapide et peu co&ucirc;teuse pour les cam&eacute;ras CCD haut de gamme comme un moyen d&#39;acqu&eacute;rir de grandes quantit&eacute;s de donn&eacute;es d&#39;image en microscopie &eacute;lectronique.

High-throughput film-densitom&eacute;trie : une approche efficace pour g&eacute;n&eacute;rer de gros volumes de donn&eacute;es.

&#x819C;&#x5904;&#x7406;&#x673A;&#x5668; &#xFF08;&#x673A;&#x5668;&#x4EBA;&#xFF09; &#x5EFA;&#x6210;&#x4E86;&#x5176;&#x4E2D;&#x53EF;&#x4EE5;&#x3001; &#x7ED3;&#x5408;&#x73B0;&#x6709;&#x5546;&#x4E1A;&#x7535;&#x5F71;&#x5BC6;&#x5EA6;&#x8BA1;&#xFF0C;&#x4EA4;&#x6362;&#x548C;&#x6570;&#x5B57;&#x5316;&#x6BCF;&#x5929;&#x8D85;&#x8FC7; 300 &#x7535;&#x5B50;&#x663E;&#x5FAE;&#x7167;&#x7247;&#x3002;&#x673A;&#x5668;&#x4EBA;&#x7535;&#x5F71;&#x6709;&#x6548;&#x5904;&#x7406;&#x6267;&#x884C;&#x6D88;&#x9664;&#x4E86;&#x5EF6;&#x8FDF;&#x548C;&#x70E6;&#x95F7;&#x65F6;&#x6570;&#x636E;&#x6700;&#x521D;&#x8BB0;&#x5F55;&#x5728;&#x80F6;&#x7247;&#x4E0A;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x6570;&#x5B57;&#x5316;&#x56FE;&#x50CF;&#x5173;&#x8054;&#x3002;&#x8C03;&#x5236;&#x4F20;&#x9012;&#x51FD;&#x6570; (MTF) &#x7684;&#x5546;&#x7528;&#x5BC6;&#x5EA6;&#x8BA1;&#x662F; microdensitometer &#x7684;&#x660E;&#x663E;&#x4F4E;&#x4E8E;&#x9AD8;&#x7AEF;&#x3001; &#x79D1;&#x5B66;&#x3002;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x5176;&#x4FE1;&#x53F7;&#x7684;&#x4FE1;&#x566A;&#x6BD4; (S/N) &#x662F;&#x76F8;&#x5F53;&#x51FA;&#x8272;&#xFF0C;&#x5141;&#x8BB8;&quot;&#x9644;&#x8FD1;-&#x5230;-&#x5B8C;&#x7F8E;&quot;&#x6027;&#x80FD;&#x8F93;&#x51FA;&#x5927;&#x91CF;&#x6062;&#x590D;&#x3002;&#x7531;&#x4E8E;&#x5927;&#x9762;&#x79EF;&#x7684;&#x5546;&#x4E1A;&#x5229;&#x7528; &#xFF08;&#x4E0E;&#x76F8;&#x5E94;&#x7F16;&#x7801;&#x7684;&#x6301;&#x6709;&#x8005;&#x8FBE; 10,000 x 13,680 &#x50CF;&#x7D20;&#xFF09; &#x5206;&#x5149;&#x5149;&#x5EA6;&#x8BA1;&#x90FD;&#x53EF;&#x4EE5;&#x88AB;&#x6570;&#x5B57;&#x5316;&#x7684;&#x6807;&#x51C6;&#x7535;&#x5B50;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x7535;&#x5F71;&#xFF0C;&#x81EA;&#x52A8;&#x7684;&#x7535;&#x5F71;&#x6570;&#x5B57;&#x5316;&#x63D0;&#x4F9B;&#x9AD8;&#x7AEF; CCD &#x76F8;&#x673A;&#x5FEB;&#x901F;&#x548C;&#x5EC9;&#x4EF7;&#x7684;&#x66FF;&#x4EE3;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x624B;&#x6BB5;&#x83B7;&#x53D6;&#x5927;&#x91CF;&#x7684;&#x7535;&#x5B50;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x4E2D;&#x7684;&#x56FE;&#x50CF;&#x6570;&#x636E;&#x3002;

&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x819C;&#x5BC6;&#x5EA6;&#xFF1A; &#x751F;&#x6210;&#x5927;&#x578B;&#x6570;&#x636E;&#x96C6;&#x7684;&#x6709;&#x6548;&#x9014;&#x5F84;&#x3002;

High-Throughput-Film-Densitometrie: ein effizienter Ansatz, um gro&#xDF;e Datenmengen zu generieren.

Una film-movimentazione macchina (robot) &egrave; stata costruita che possono, in concomitanza con un densitometro film disponibili in commercio, scambio e digitalizzare microscopio oltre 300 al giorno. Implementazione del film robotizzato gestisce efficacemente elimina il ritardo e la noia associato digitalizzazione immagini quando i dati sono inizialmente registrati sulla pellicola fotografica. La funzione di trasferimento della modulazione (MTF) del densitometro commercialmente disponibile &egrave; significativamente peggiore di quella di un microdensitometer di fascia alta, scientifico. Tuttavia, il rapporto segnale-rumore (S/N) &egrave; eccellente, permettendo notevole restauro dell&#39;output per prestazioni &quot;vicino a-a-perfetto&quot;. Dovuto la vasta area della pellicola standard microscopio elettronico che pu&ograve; essere digitalizzata dal densitometro commerciale (fino a 10.000 x 13.680 pixel con un titolare opportunamente codificato), la digitalizzazione automatica film offre un&#39;alternativa veloce e poco costosa per telecamere CCD high-end come mezzo di acquisizione di grandi quantit&agrave; di dati di immagine in microscopia elettronica.

Film di alto-rendimento-densitometria: un approccio efficace per generare grandi insiemi di dati.

&#x30D5;&#x30A3;&#x30EB;&#x30E0;&#x306E;&#x6271;&#x3044;&#x65B9;&#x306E;&#x30DE;&#x30B7;&#x30F3; (&#x30ED;&#x30DC;&#x30C3;&#x30C8;) &#x304C;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3001;&#x5E02;&#x8CA9;&#x306E;&#x30D5;&#x30A3;&#x30EB;&#x30E0;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x8A08;&#x3068;&#x9023;&#x643A;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x4EA4;&#x63DB;&#x3001;1 &#x65E5;&#x3042;&#x305F;&#x308A;&#x306E;&#x4EE5;&#x4E0A; 300 &#x306E;&#x96FB;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x5199;&#x771F;&#x3092;&#x30C7;&#x30B8;&#x30BF;&#x30EB;&#x5316;&#x306B;&#x69CB;&#x7BC9;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30ED;&#x30DC;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x30D5;&#x30A3;&#x30EB;&#x30E0;&#x3092;&#x52B9;&#x679C;&#x7684;&#x306B;&#x51E6;&#x7406;&#x5B9F;&#x88C5;&#x306E;&#x9045;&#x5EF6;&#x6642;&#x9593;&#x3068;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x304C;&#x5F53;&#x521D;&#x5199;&#x771F;&#x30D5;&#x30A3;&#x30EB;&#x30E0;&#x306B;&#x8A18;&#x9332;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3068;&#x3001;&#x30C7;&#x30B8;&#x30BF;&#x30EB;&#x5316;&#x306E;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3065;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x8AC4;&#x3055;&#x3093;&#x304C;&#x306A;&#x304F;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5E02;&#x8CA9;&#x306E;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x8A08;&#x306E;&#x5909;&#x8ABF;&#x4F1D;&#x9054;&#x95A2;&#x6570; &#xFF08;MTF&#xFF09; &#x306F;&#x3001;&#x30CF;&#x30A4;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x3001;&#x79D1;&#x5B66;&#x7684;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30C7;&#x30F3;&#x30B7;&#x30C8;&#x306E;&#x305D;&#x308C;&#x3088;&#x308A;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x60AA;&#x5316;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x4FE1;&#x53F7;&#x5BFE;&#x96D1;&#x97F3;&#x6BD4; (S/N) &#x51FA;&#x529B;&#x306E;&#x5B9F;&#x8CEA;&#x7684;&#x4FEE;&#x5FA9;&#x300C;- &#x306B;&#x5B8C;&#x74A7;&#x306B;&#x8FD1;&#x3044;&#x300D;&#x30D1;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30DE;&#x30F3;&#x30B9;&#x3092;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3001;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x512A;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5546;&#x7528;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x8A08; (&#x6700;&#x5927; 10,000 x 13,680 &#x30D4;&#x30AF;&#x30BB;&#x30EB;&#x9069;&#x5207;&#x306B;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30DB;&#x30EB;&#x30C0;&#x30FC;&#x4ED8;&#x3051;) &#x3067;&#x30C7;&#x30B8;&#x30BF;&#x30EB;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x6A19;&#x6E96;&#x306E;&#x96FB;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x30D5;&#x30A3;&#x30EB;&#x30E0;&#x306E;&#x5927;&#x9762;&#x7A4D;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x81EA;&#x52D5;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30D5;&#x30A3;&#x30EB;&#x30E0;&#x306E;&#x30C7;&#x30B8;&#x30BF;&#x30EB;&#x5316;&#x30CF;&#x30A4;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x306E; CCD &#x30AB;&#x30E1;&#x30E9;&#x3001;&#x9AD8;&#x901F;&#x304B;&#x3064;&#x5B89;&#x4FA1;&#x306A;&#x4EE3;&#x66FF;&#x306E;&#x5927;&#x91CF;&#x306E;&#x96FB;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x306E;&#x753B;&#x50CF;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x3092;&#x53D6;&#x5F97;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x624B;&#x6BB5;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8; &#x30D5;&#x30A3;&#x30EB;&#x30E0;-&#x30C7;&#x30F3;&#x30B7;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;: &#x5927;&#x91CF;&#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF; &#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3002;

&#xD544;&#xB984; &#xCC98;&#xB9AC; &#xCEF4;&#xD4E8;&#xD130; (&#xB85C;&#xBD07;)&#xB294; &#xC218;, &#xD568;&#xAED8; &#xC0C1;&#xC6A9; &#xD544;&#xB984; &#xB18D;&#xB3C4;&#xACC4;, &#xAD50;&#xD658; &#xD558; &#xACE0; &#xD558;&#xB8E8; 300 &#xAC1C; &#xC774;&#xC0C1;&#xC758; &#xC804;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xB514;&#xC9C0;&#xD138;&#xD654; &#xAC74;&#xC124; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB85C;&#xBD07; &#xC601;&#xD654;&#xB97C; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xCC98;&#xB9AC;&#xC758; &#xAD6C;&#xD604; &#xC9C0;&#xC5F0;&#xACFC; &#xC9C0; &#xACA8; &#xC6C0;&#xC5D0; &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xCC98;&#xC74C; &#xC0AC;&#xC9C4; &#xD544;&#xB984;&#xC5D0; &#xAE30;&#xB85D; &#xB41C; &#xB54C; &#xB514;&#xC9C0;&#xD138;&#xD654; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0;&#xC640; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xC81C;&#xAC70;. &#xC0C1;&#xC6A9; &#xB18D;&#xB3C4;&#xACC4;&#xC758; &#xBCC0;&#xC870; &#xC804;&#xB2EC; &#xD568;&#xC218; (MTF) &#xB192;&#xC740;-&#xC5D4;&#xB4DC;, &#xACFC;&#xD559;&#xC801;&#xC778; microdensitometer &#xBCF4;&#xB2E4; &#xD6E8;&#xC52C; &#xB098;&#xC058;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7FC;&#xC5D0;&#xB3C4; &#xBD88;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0;, &#xADF8;&#xAC83;&#xC758; &#xC2E0;&#xD638; &#xB300; &#xC7A1;&#xC74C; &#xBE44;&#xC728; (S/N)&#xC740; &#xAF64; &#xB6F0;&#xC5B4;&#xB09C; &#xCD9C;&#xB825;&#xC758; &quot;&#xC5D0;-&#xC644;&#xBCBD;&#xC5D0; &#xAC00;&#xAE4C;&#xC6B4;&quot; &#xC131;&#xB2A5; &#xBCF5;&#xC6D0; &#xCD94;&#xAC00; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xD5C8;&#xC6A9;. &#xC0C1;&#xC6A9; &#xB18D;&#xB3C4;&#xACC4; (&#xC801;&#xC808; &#xD558; &#xAC8C; &#xCF54;&#xB529; &#xB41C; &#xBCF4;&#xC720;&#xC790; &#xCD5C;&#xB300; 10000 x 13,680 &#xD53D;&#xC140;) &#xD558; &#xC5EC; &#xB514;&#xC9C0;&#xD138;&#xD654; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xD45C;&#xC900; &#xC804;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xC601;&#xD654;&#xC758; &#xD070; &#xC601;&#xC5ED;&#xC73C;&#xB85C; &#xC790;&#xB3D9;&#xB41C; &#xD544;&#xB984; &#xB514;&#xC9C0;&#xD138;&#xD654; &#xB300;&#xB7C9;&#xC758; &#xC804;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB97C; &#xD68D;&#xB4DD; &#xD558;&#xB294; &#xC218;&#xB2E8;&#xC73C;&#xB85C; &#xCD5C;&#xACE0;&#xAE09; CCD &#xCE74;&#xBA54;&#xB77C;&#xB97C; &#xC2E0;&#xC18D; &#xD558; &#xACE0; &#xC800;&#xB834; &#xD55C; &#xB300;&#xC548;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; &#xC601;&#xD654; densitometry: &#xB300;&#xD615; &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xC9D1;&#xD569;&#xC744; &#xC0DD;&#xC131; &#xD558;&#xB294; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740;.

Una m&aacute;quina de control de pel&iacute;cula (robot) se ha construido, que puede, junto con un densit&oacute;metro pel&iacute;cula comercialmente disponibles, intercambiar y digitalizar m&aacute;s de 300 micrograf&iacute;as por d&iacute;a. Aplicaci&oacute;n de pel&iacute;cula rob&oacute;tica manejar efectivamente elimina el retraso y el tedio asociados con digitalizaci&oacute;n de im&aacute;genes cuando los datos se registran en pel&iacute;cula fotogr&aacute;fica. La funci&oacute;n de transferencia de modulaci&oacute;n (MTF) del densit&oacute;metro disponible comercialmente es significativamente peor que la de un microdensitometer de high-end, cient&iacute;fico. Sin embargo, su relaci&oacute;n se&ntilde;al a ruido (S/N) es excelente, permitiendo la restauraci&oacute;n substancial de la salida a &quot;cerca de-que-perfecta&quot; desempe&ntilde;o. Debido a la gran superficie de la pel&iacute;cula de microscopio est&aacute;ndar que puede ser digitalizada por el densit&oacute;metro comercial (hasta 10.000 x 13.680 p&iacute;xeles con un titular debidamente codificado), digitalizaci&oacute;n automatizada de la pel&iacute;cula ofrece una alternativa r&aacute;pida y barata para c&aacute;maras CCD de alta gama como un medio de adquirir grandes cantidades de datos de imagen en microscopia electr&oacute;nica.

Pel&iacute;cula de alto rendimiento-densitometr&iacute;a: un enfoque eficaz para generar grandes conjuntos de datos.

&#x5F88;&#x5927;&#x7A0B;&#x5EA6;&#x4E0A;&#x672A;&#x77E5;&#x5982;&#x4F55;&#x52A8;&#x7C92;&#x86CB;&#x767D;&#x5F62;&#x6210;&#x52A8;&#x6001;&#x754C;&#x9762;&#x7684;&#x5FAE;&#x7BA1;&#x3002;&#x5728;&#x51FA;&#x82BD;&#x9175;&#x6BCD;&#xFF0C;&#x590D;&#x6742;&#x7684; 10-&#x86CB;&#x767D;&#x8D28; Dam1 &#x662F;&#x7EBA;&#x9524;&#x7684;&#x65B9;&#x9762;&#x62C5;&#x5F53;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x89D2;&#x8272;&#xFF0C;&#x8C03;&#x8282;&#x4E0E;&#x7EBA;&#x9524;&#x7684;&#x4EA4;&#x4E92;&#x4E0E;&#x7EF4;&#x62A4;&#x5B8C;&#x6574;&#x6027;&#x7684;&#x6781;&#x5149;&#x6FC0;&#x9176;&#x76EE;&#x6807;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8C03;&#x67E5;&#x4E86;&#x7EAF;&#x51C0; Dam1 &#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x751F;&#x5316;&#x5C5E;&#x6027;&#x3002;Oligomerized &#x6210;&#x73AF;&#x5468;&#x56F4;&#x5FAE;&#x7BA1;&#x7684;&#x590D;&#x6742;&#x3002;&#x73AF;&#x5F62;&#x6210;&#x5FAE;&#x7BA1;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x4FBF;&#x5229;&#xFF0C;&#x4F46;&#x53EF;&#x80FD;&#x53D1;&#x751F;&#x5728;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x7684;&#x7F3A;&#x5E2D;&#x3002;&#x57FA;&#x56E0;&#x7A81;&#x53D8;&#x5BFC;&#x81F4;&#x90E8;&#x5206;&#x7EC4;&#x88C5;&#x914D;&#x5408;&#x7269;&#x6216;&#x51CF;&#x5C11;&#x5FAE;&#x7BA1;&#x5177;&#x6709;&#x7EA6;&#x675F;&#x529B;&#x3002;&#x73AF;&#x548C;&#x5FAE;&#x7BA1;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x88AB;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684; Dam1 &#x548C; alphabeta-&#x5FAE;&#x7BA1;&#x86CB;&#x767D; C &#x603B;&#x7AD9;&#x3002;&#x73AF;&#x5F62;&#x6210;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x5FAE;&#x7BA1;&#x88C5;&#x914D;&#x3001; &#x62C6;&#x5378;&#xFF0C;&#x5BF9;&#x7A33;&#x5B9A;&#x548C;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x6346;&#x7ED1;&#x3002;GTP-&#x5FAE;&#x7BA1;&#x86CB;&#x767D;&#x6676;&#x683C;&#x662F;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x9996;&#x9009;&#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5408;&#x4F5C;&#x4F19;&#x4F34;&#x548C; Dam1 &#x73AF;&#x53EF;&#x4EE5;&#x8868;&#x73B0;&#x51FA;&#x5BF9;&#x5FAE;&#x7BA1;&#x7684;&#x6A2A;&#x5411;&#x8C03;&#x52A8;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x610F;&#x89C1;&#x8868;&#x660E;&#x7EBA;&#x9524;&#x53EF;&#x4EE5;&#x8BC6;&#x522B;&#x5E76;&#x4FDD;&#x6301;&#x673A;&#x5236;&#x9644;&#x52A0;&#x5230;&#x52A0;&#x5FAE;&#x7BA1;&#x7684;&#x4E24;&#x7AEF;&#x3002;

&#x5F62;&#x6210;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x52A8;&#x6001;&#x5E73;&#x8861;&#x70B9;-&#x5FAE;&#x7BA1;&#x63A5;&#x53E3;&#x901A;&#x8FC7;&#x590D;&#x6742;&#x7684; Dam1 &#x73AF;&#x7684;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x96C6;&#x3002;

How kinetochore proteins form a dynamic interface with microtubules is largely unknown. In budding yeast, the 10-protein Dam1 complex is an Aurora kinase target that plays essential roles maintaining the integrity of the mitotic spindle and regulating interactions with the kinetochore. Here, we investigated the biochemical properties of purified Dam1 complex. The complex oligomerized into rings around microtubules. Ring formation was facilitated by microtubules but could occur in their absence. Mutant alleles led to partially assembled complexes or reduced microtubule binding. The interaction between rings and microtubules is mediated by the C termini of both Dam1 and alphabeta-tubulin. Ring formation promotes microtubule assembly, stabilizes against disassembly, and promotes bundling. A GTP-tubulin lattice is the preferred binding partner for the complex, and Dam1 rings can exhibit lateral mobility on microtubules. These observations suggest a mechanism by which the kinetochore can recognize and stay attached to the plus ends of microtubules.

Formation of a dynamic kinetochore- microtubule interface through assembly of the Dam1 ring complex.

Comment les prot&#xE9;ines du kin&#xE9;tochore former une interface dynamique avec les microtubules est largement inconnue. Dans la levure bourgeonnante, le complexe 10-prot&#xE9;ines Dam1 est une cible kinase Aurora, qui joue un r&#xF4;le essentiel en maintenant l&#x26;#39;int&#xE9;grit&#xE9; du fuseau mitotique et la r&#xE9;gulation des interactions avec le kin&#xE9;tochore. Ici, nous avons &#xE9;tudi&#xE9; les propri&#xE9;t&#xE9;s biochimiques de purifier Dam1 complexe. Le complexe oligom&#xE9;ris&#xE9; en anneaux autour de microtubules. Formation de l&#x26;#39;anneau a &#xE9;t&#xE9; facilit&#xE9;e par les microtubules, mais pourrait se produire en leur absence. All&#xE8;les mutants a conduit &#xE0; des complexes ou partiellement assembl&#xE9;s contraignantes microtubules r&#xE9;duite. L&#x26;#39;interaction entre les anneaux et les microtubules est m&#xE9;di&#xE9;e par les terminaisons C de deux Dam1 et alphabeta-tubuline. La formation des anneaux favorise l&#x26;#39;assemblage des microtubules, se stabilise contre le d&#xE9;montage, et favorise le regroupement. Un treillis GTP-tubuline est le partenaire privil&#xE9;gi&#xE9; de liaison pour le complexe, et Dam1 anneaux peuvent pr&#xE9;senter une mobilit&#xE9; lat&#xE9;rale sur les microtubules. Ces observations sugg&#xE8;rent un m&#xE9;canisme par lequel le kin&#xE9;tochore peut reconna&#xEE;tre et de rester attach&#xE9;s aux extr&#xE9;mit&#xE9;s ainsi que des microtubules.

Formation d&#x26;#39;une dynamique des microtubules kin&#xE9;tochores-interface &#xE0; travers l&#x26;#39;Assembl&#xE9;e du Complexe Dam1 Anneau

Die Bildung einer dynamischen Kinetochor-Mikrotubuli-Schnittstelle, durch Montage der DAM1 Ring-Komplex.

Come cinetocore proteine formano un&#39;interfaccia dinamica con microtubuli &egrave; in gran parte sconosciuto. Nel lievito gemmante, il Dam1 10-proteina complessa &egrave; una destinazione di Aurora chinasi che interpreta ruoli essenziali mantenendo l&#39;integrit&agrave; del fuso mitotico e che regolano le interazioni con il cinetocore. Qui, abbiamo studiato le propriet&agrave; biochimiche di purificato Dam1 complesso. Il complesso oligomerized ad anelli intorno a microtubuli. Anello formazione &egrave; stata facilitata da microtubuli, ma potrebbe verificarsi in loro assenza. Alleli mutanti guidati a parzialmente assemblati complessi o ridotto legame microtubulo. L&#39;interazione tra gli anelli e i microtubuli &egrave; mediata dalla stazione termini C di Dam1 e di Alfabeta-tubulina. Anello formazione promuove microtubuli, stabilizza contro smontaggio e promuove vendite abbinate. Un reticolo di tubulina GTP &egrave; il partner preferito vincolante per il complesso, e Dam1 anelli possono esibire la mobilit&agrave; laterale sui microtubuli. Queste osservazioni suggeriscono un meccanismo mediante il quale il cinetocore possono riconoscere e rimanere attaccato alle estremit&agrave; plus dei microtubuli.

Formazione di un&#39;interfaccia microtubulo-cinetocore dinamico attraverso il montaggio dell&#39;anello Dam1 complessa.

&#x5FAE;&#x5C0F;&#x3067;&#x52D5;&#x7684;&#x30A4;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC;&#x30D5;&#x30A7;&#x30A4;&#x30B9;&#x3092;&#x3069;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x52D5;&#x539F;&#x4F53;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x5F62;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x5927;&#x90E8;&#x5206;&#x306F;&#x4E0D;&#x660E;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x51FA;&#x82BD;&#x9175;&#x6BCD;&#x3067;&#x306F;&#x3001;10&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;Dam1&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306F;&#x3001;&#x7D21;&#x9318;&#x4F53;&#x306E;&#x6574;&#x5408;&#x6027;&#x3092;&#x7DAD;&#x6301;&#x3057;&#x3001;&#x52D5;&#x539F;&#x4F53;&#x3068;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3059;&#x308B;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x679C;&#x305F;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x30AA;&#x30FC;&#x30ED;&#x30E9;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x6A19;&#x7684;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;Dam1&#x306E;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x3092;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3057;&#x305F;&#x751F;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x6027;&#x8CEA;&#x3092;&#x8ABF;&#x3079;&#x305F;&#x3002;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x304C;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x306E;&#x5468;&#x308A;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306B;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x3002;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x5F62;&#x6210;&#x304C;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x4FC3;&#x9032;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3001;&#x5F7C;&#x3089;&#x306E;&#x4E0D;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067;&#x767A;&#x751F;&#x3059;&#x308B;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5909;&#x7570;&#x5BFE;&#x7ACB;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x304C;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x306B;&#x7D44;&#x307F;&#x7ACB;&#x3066;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x3001;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x7D50;&#x5408;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3068;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306F;Dam1&#x3068;alphabeta-&#x30C1;&#x30E5;&#x30FC;&#x30D6;&#x30EA;&#x30F3;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;C&#x672B;&#x7AEF;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5A92;&#x4ECB;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3002;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x5F62;&#x6210;&#x306F;&#x3001;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3057;&#x5206;&#x89E3;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057;&#x3066;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x3057;&#x3001;&#x7D50;&#x675F;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; GTP-&#x30C1;&#x30E5;&#x30FC;&#x30D6;&#x30EA;&#x30F3;&#x306E;&#x683C;&#x5B50;&#x306F;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x597D;&#x9069;&#x306A;&#x7D50;&#x5408;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30CA;&#x30FC;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;Dam1&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x304C;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x4E0A;&#x306B;&#x6A2A;&#x65B9;&#x5411;&#x306E;&#x79FB;&#x52D5;&#x5EA6;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x89B3;&#x200B;&#x200B;&#x5BDF;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x52D5;&#x539F;&#x4F53;&#x3092;&#x8A8D;&#x8B58;&#x3057;&#x3001;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x306E;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x7AEF;&#x306B;&#x63A5;&#x7D9A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6EDE;&#x5728;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

Dam1&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x3092;&#x52D5;&#x7684;&#x306A;&#x52D5;&#x539F;&#x4F53;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x30A4;&#x30F3;&#x30BF;&#x30D5;&#x30A7;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x5F62;&#x6210;

Kinetochore &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; microtubules&#xC640; &#xB3D9;&#xC801; &#xC778;&#xD130;&#xD398;&#xC774;&#xC2A4;&#xB97C; &#xAD6C;&#xC131; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xD06C;&#xAC8C; &#xBD88;&#xBA85; &#xD558;&#xB2E4;. &#xC2E0;&#xC9C4; &#xD6A8; &#xBAA8;&#xC5D0; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; 10 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; Dam1 mitotic &#xC2A4;&#xD540; &#xB4E4;&#xC758; &#xBB34;&#xACB0;&#xC131;&#xC744; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558; &#xACE0;&#xB294; kinetochore&#xC640;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xC870;&#xC808; &#xD558;&#xB294; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xC218;&#xD589; &#xD558;&#xB294; &#xC624;&#xB85C;&#xB77C; &#xB2C8; &#xB300;&#xC0C1; &#xC774;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC815;&#xD654; Dam1 &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC0DD; &#xD654; &#xD559;&#xC801; &#xC18D;&#xC131;&#xC744; &#xC870;&#xC0AC;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; microtubules &#xC8FC;&#xC704;&#xC5D0; &#xACE0;&#xB9AC;&#xC5D0; oligomerized&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB9C1; &#xD615;&#xC131; microtubules&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xCD09;&#xC9C4; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4; &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xBD80;&#xC7AC;&#xC5D0; &#xBC1C;&#xC0DD;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xCCB4; &#xB300;&#xB9BD;&#xC5D0; &#xBD80;&#xBD84;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB41C; &#xB2E8;&#xC9C0; &#xB610;&#xB294; microtubule &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xAC10;&#xC18C;. &#xBC18;&#xC9C0; microtubules &#xC0C1;&#xD638;&#xC791;&#xC6A9; Dam1 &#xBC0F; alphabeta tubulin C &#xD14C;&#xB974;&#xBBF8;&#xB2C8; &#xC911;&#xC7AC;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB9C1; &#xD615;&#xC131; microtubule &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xB97C; &#xCD09;&#xC9C4; &#xD558; &#xACE0; &#xD574;&#xCCB4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC548;&#xC815;&#xD654; &#xBC88;&#xB4E4;&#xC744; &#xCD09;&#xC9C4;. GTP tubulin &#xACA9;&#xC790;&#xB294; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAE30;&#xBCF8; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD30C;&#xD2B8;&#xB108; &#xC774;&#xBA70; Dam1 &#xBC18;&#xC9C0; &#xCE21;&#xBA74; &#xC774;&#xB3D9;&#xC131; microtubules&#xC5D0; &#xC804;&#xC2DC; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xAD00;&#xCE21; microtubules &#xB354;&#xD558;&#xAE30; &#xB05D;&#xC5D0; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB41C; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC5D0;&#xC11C; kinetochore&#xB294; &#xC778;&#xC2DD; &#xD558; &#xACE0; &#xC788;&#xC5B4; &#xC218; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; Dam1 &#xBC18;&#xC9C0;&#xC758; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xB3D9;&#xC801; kinetochore microtubule &#xC778;&#xD130;&#xD398;&#xC774;&#xC2A4;&#xC758; &#xD615;&#xC131;.

&#xBF;C&#xF3;mo kinetochore prote&#xED;nas forman una interacci&#xF3;n din&#xE1;mica con los microt&#xFA;bulos es en gran parte desconocido. En la levadura en ciernes, el complejo de la prote&#xED;na 10-Dam1 es un objetivo Aurora quinasa que desempe&#xF1;a un papel esencial el mantenimiento de la integridad del huso mit&#xF3;tico y la regulaci&#xF3;n de las interacciones con el cinetocoro. Aqu&#xED;, hemos investigado las propiedades bioqu&#xED;micas de purificado Dam1 complejo. El complejo oligomerizarse en los anillos alrededor de los microt&#xFA;bulos. La formaci&#xF3;n del anillo se vio facilitada por los microt&#xFA;bulos, pero podr&#xED;a ocurrir en su ausencia. Alelos mutantes llev&#xF3; a complejos parcialmente ensamblados o uni&#xF3;n microt&#xFA;bulos reducida. La interacci&#xF3;n entre los anillos y los microt&#xFA;bulos est&#xE1; mediada por las terminales C y de tanto Dam1 alphabeta tubulina. Promueve la formaci&#xF3;n de anillo de ensamblaje de los microt&#xFA;bulos, estabiliza contra el desmontaje, y promueve la agrupaci&#xF3;n. Una red de GTP-tubulina es el socio preferido de uni&#xF3;n para el complejo, y Dam1 anillos pueden exhibir la movilidad lateral de los microt&#xFA;bulos. Estas observaciones sugieren un mecanismo por el cual el cinetocoro se puede reconocer y mantenerse apegado a los extremos positivo de los microt&#xFA;bulos.

Formaci&#xF3;n de una din&#xE1;mica de los microt&#xFA;bulos cinetocoro-interfaz a trav&#xE9;s de la Asamblea del Complejo Anillo Dam1

&#x901A;&#x8FC7;&#x5176;&#x5FAE;&#x7BA1;&#x518D;&#x52A0;&#x4E0A;&#x4E24;&#x7AEF;&#x7684;&#x9002;&#x5EA6;&#x8FDB;&#x884C;&#x4EA4;&#x4E92;&#x7684;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x548C;&#x7EBA;&#x9524;&#x5FAE;&#x7BA1;&#x5728;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6709;&#x4E1D;&#x5206;&#x88C2;&#x540E;&#x671F; A &#x671F;&#x95F4;&#x7F29;&#x77ED;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x88AB;&#x9694;&#x79BB;&#x5230;&#x4E3B;&#x8F74;&#x4E24;&#x6781;&#x3002;&#x5206;&#x5B50;&#x7684;&#x6027;&#x8D28;&#x4E0E;&#x8EAB;&#x4EFD;&#x7684;&#x8026;&#x5408;&#x5141;&#x8BB8;&#x5FAE;&#x7BA1;&#x89E3;&#x805A;&#xFF0C;&#x671F;&#x95F4;&#x540E;&#x671F;&#x5C06;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x62C9;&#x5230;&#x6781;&#x70B9;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x957F;&#x4ECD;&#x7136;&#x96BE;&#x4EE5;&#x6349;&#x6478;&#x3002;&#x840C;&#x82BD;&#x9175;&#x6BCD;&#x4E2D;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x5341;&#x5927;&#x86CB;&#x767D; Dam1 &#x662F;&#x7EBA;&#x9524;&#x7684;&#x5BE1;&#x805A;&#x6210;&#x4E00;&#x53EA;&#x6212;&#x6307; 50 nm &#x5468;&#x56F4;&#x5FAE;&#x7BA1;&#x4F53;&#x5916;&#x5173;&#x952E;&#x5FAE;&#x7BA1;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7EC4;&#x4EF6;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x663E;&#x793A;&#xFF0C;&#x5B9E;&#x65F6;&#x3001; &#x53CC;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x68C0;&#x6D4B;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x7528;&#x590D;&#x6742;&#x73AF; processively &#x79FB;&#x52A8;&#x4E3A;&#x4E24;&#x7AEF;&#x7684;&#x5FAE;&#x7BA1;&#x89E3;&#x805A;&#x65E0;&#x5206;&#x79BB;&#x6676;&#x683C;&#x7684;&#x51E0;&#x4E2A;&#x5FAE;&#x7C73;&#x3002;&#39;&#x7ED3;&#x675F;&#x4E0A;&#x610F;&#x89C1;&#39; &#x7535;&#x955C;&#x5206;&#x6790;&#x63ED;&#x793A;&#x7EBA;&#x9524;&#x73AF; 16-fold &#x5BF9;&#x79F0;&#x6027;&#x3002;13-Fold &#x5FAE;&#x7BA1;&#x5BF9;&#x79F0;&#x8FD9;&#x51FA;&#x7684;&#x767B;&#x8BB0;&#x518C;&#x5B89;&#x6392;&#x662F;&#x7B26;&#x5408;&#x57FA;&#x4E8E;&#x9759;&#x7535;&#x8026;&#x5408;&#x7684;&#x73AF;-&#x5FAE;&#x7BA1;&#x63A5;&#x53E3;&#x6ED1;&#x52A8;&#x673A;&#x7406;&#x3002;&#x590D;&#x6742;&#x7684; Dam1 &#x73AF;&#x662F;&#x5206;&#x5B50;&#x7684;&#x8BBE;&#x5907;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x7FFB;&#x8BD1;&#x751F;&#x6210;&#x7684;&#x5FAE;&#x7BA1;&#x89E3;&#x805A;&#x6210;&#x6CBF;&#x683C;&#x4EE5;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x5206;&#x79BB;&#x8FD0;&#x52A8;&#x7684;&#x529B;&#x91CF;&#x3002;

&#x5728;&#x590D;&#x6742;&#x7684; Dam1 &#x7EBA;&#x9524;&#x73AF; processively &#x79FB;&#x52A8;&#x89E3;&#x805A;&#x5FAE;&#x7BA1;&#x4E24;&#x7AEF;&#x3002;

Chromosomes interact through their kinetochores with microtubule plus ends and they are segregated to the spindle poles as the kinetochore microtubules shorten during anaphase A of mitosis. The molecular natures and identities of coupling proteins that allow microtubule depolymerization to pull chromosomes to poles during anaphase have long remained elusive. In budding yeast, the ten-protein Dam1 complex is a critical microtubule-binding component of the kinetochore that oligomerizes into a 50-nm ring around a microtubule in vitro. Here we show, with the use of a real-time, two-colour fluorescence microscopy assay, that the ring complex moves processively for several micrometres at the ends of depolymerizing microtubules without detaching from the lattice. Electron microscopic analysis of 'end-on views' revealed a 16-fold symmetry of the kinetochore rings. This out-of-register arrangement with respect to the 13-fold microtubule symmetry is consistent with a sliding mechanism based on an electrostatically coupled ring-microtubule interface. The Dam1 ring complex is a molecular device that can translate the force generated by microtubule depolymerization into movement along the lattice to facilitate chromosome segregation.

The Dam1 kinetochore ring complex moves processively on depolymerizing microtubule ends.

Chromosomes interagissent par le biais de leurs kin&#xE9;tochores avec des microtubules, plus fins et ils sont s&#xE9;par&#xE9;s pour les p&#xF4;les du fuseau que les microtubules kin&#xE9;tochoriens raccourcir lors de l&#x26;#39;anaphase A de la mitose. Les natures mol&#xE9;culaires et les identit&#xE9;s des prot&#xE9;ines de couplage qui permettent de tirer d&#xE9;polym&#xE9;risation des microtubules chromosomes aux p&#xF4;les lors de l&#x26;#39;anaphase ont longtemps rest&#xE9; inaccessible. Dans la levure bourgeonnante, le complexe de dix prot&#xE9;ines Dam1 est une critique des microtubules contraignant composante du kin&#xE9;tochore que oligom&#xE9;rise dans un anneau de 50 nm autour d&#x26;#39;un des microtubules in vitro. Ici on montre, avec l&#x26;#39;utilisation d&#x26;#39;un temps r&#xE9;el, &#xE0; deux couleurs dosage microscopie &#xE0; fluorescence, qui se d&#xE9;place le complexe annulaire processively pour plusieurs microm&#xE8;tres &#xE0; l&#x26;#39;extr&#xE9;mit&#xE9; des microtubules d&#xE9;polym&#xE9;risation sans se d&#xE9;tacher de la maille. Analyse au microscope &#xE9;lectronique de la &#xAB;fin des vues&#xBB; a r&#xE9;v&#xE9;l&#xE9; une sym&#xE9;trie de 16 fois des anneaux kin&#xE9;tochore. Ce dispositif hors registre par rapport &#xE0; la sym&#xE9;trie des microtubules 13 fois est compatible avec un m&#xE9;canisme coulissant sur la base de une &#xE9;lectrostatiquement coupl&#xE9; anneau-microtubules interface. Le complexe Dam1 anneau est un dispositif mol&#xE9;culaire qui peut traduire la force g&#xE9;n&#xE9;r&#xE9;e par d&#xE9;polym&#xE9;risation des microtubules dans un mouvement le long du r&#xE9;seau afin de faciliter la s&#xE9;gr&#xE9;gation des chromosomes.

Le Complexe Dam1 Anneau Kinetochore D&#xE9;place Processively sur les extr&#xE9;mit&#xE9;s des microtubules d&#xE9;polym&#xE9;risation

Chromosomen interagieren durch ihre Kinetochores mit Microtubule plus enden, und sie werden getrennt, an die Spindel-Polen, wie das Kinetochor-Mikrotubuli w&auml;hrend A Anaphase der Mitose verk&uuml;rzen. Die molekulare Naturen und Identit&auml;ten der Kopplung von Proteinen, die Microtubule Depolymerisation Chromosomen in Polen w&auml;hrend Anaphase zu ziehen erlauben sind lange schwer fassbaren geblieben. Bei angehenden Hefe ist die zehn-Protein-Dam1 komplexe Microtubule-Bindung wichtiger Bestandteil der Kinetochor, die in einen 50-nm-Ring um eine Microtubule in-vitro-oligomerizes. Hier zeigen wir, mit der Verwendung von ein Echtzeit-, zweifarbigen Fluoreszenz-Mikroskopie-Assay, der Ring komplexe processively f&uuml;r mehrere Mikrometer an den Enden der Mikrotubuli ohne trennen von dem Gitter depolymerizing verschoben. Elektron mikroskopische Analyse der &#39;End-bei Views&#39; ergab eine versechzehnfacht und produziert Symmetrie der Kinetochor Ringe. Diese aus-der-registrieren-Anordnung in Bezug auf die Speicherumgebung Microtubule-Symmetrie steht im Einklang mit einem Schiebe-Mechanismus basiert auf einer elektrostatisch gekoppelte Ring-Microtubule-Schnittstelle. Der Dam1 Ring-Komplex ist eine molekulare Ger&auml;t, das die Kraft von Microtubule Depolymerisation in Bewegung entlang des Gitters Chromosom Trennung zu erleichtern generiert &uuml;bersetzen kann.

Komplexe Dam1 Kinetochor Ring verschiebt processively depolymerizing Microtubule enden.

Cromosomi interagiscono attraverso loro cinetocori con microtubule pi&ugrave; finisce e loro sono segregati i poli mandrino come accorciare i microtubuli del cinetocoro durante l&#39;anafase A della mitosi. La natura molecolare e identit&agrave; di accoppiamento proteine che permettono la depolimerizzazione dei microtubuli tirare i cromosomi ai poli durante l&#39;anafase sono rimasta a lungo inafferrabile. Nel lievito gemmante, il Dam1 di dieci-proteina complessa &egrave; un componente critico del microtubule-associazione del cinetocore che oligomerizes in un anello di 50 nm intorno un microtubulo in vitro. Qui vi mostriamo, con l&#39;uso di un dosaggio di microscopia di fluorescenza in tempo reale, in due colori, che l&#39;anello complesso si muove processively per parecchi micrometri alle estremit&agrave; dei depolymerizing microtubuli senza disconnessione dal reticolo. Analisi microscopica di elettrone di &#39;fine-su viste&#39; ha rivelato una magazzino a 16 posizioni simmetria degli anelli cinetocore. Questa disposizione di out-of-registro per quanto riguarda la simmetria 13-fold microtubuli &egrave; coerenza con un meccanismo di scorrimento basato su un&#39;interfaccia microtubule-anello elettrostaticamente accoppiato. L&#39;anello di Dam1 complex &egrave; un dispositivo molecolare che pu&ograve; tradurre la forza generata dalla depolimerizzazione dei microtubuli in movimento lungo il reticolo per facilitare la segregazione del cromosoma.

L&#39;anello del cinetocore Dam1 complesso si muove processively depolymerizing le estremit&agrave; dei microtubuli.

&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x306F;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x306E;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x7AEF;&#x3068;&#x306E;&#x52D5;&#x539F;&#x4F53;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3057;&#x3001;&#x52D5;&#x539F;&#x4F53;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x306F;&#x7D30;&#x80DE;&#x5206;&#x88C2;&#x306E;&#x5F8C;&#x671F;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x77ED;&#x304F;&#x306A;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306F;&#x7D21;&#x9318;&#x4F53;&#x6975;&#x306B;&#x5206;&#x96E2;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x6027;&#x8CEA;&#x3068;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x306E;&#x8131;&#x91CD;&#x5408;&#x304C;&#x5F8C;&#x671F;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x6975;&#x306B;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x3092;&#x5F15;&#x3063;&#x5F35;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30A2;&#x30A4;&#x30C7;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A3;&#x30C6;&#x30A3;&#x306F;&#x9577;&#x3044;&#x3068;&#x3089;&#x3048;&#x3069;&#x3053;&#x308D;&#x306E;&#x306A;&#x3044;&#x6B8B;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x51FA;&#x82BD;&#x9175;&#x6BCD;&#x3067;&#x306F;&#x3001;10&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;Dam1&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306F;in vitro&#x3067;&#x306E;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x7D04;50 nm&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306B;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x3092;&#x5F62;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x52D5;&#x539F;&#x4F53;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x7D50;&#x5408;&#x30B3;&#x30F3;&#x30DD;&#x30FC;&#x30CD;&#x30F3;&#x30C8;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x304C;&#x683C;&#x5B50;&#x304B;&#x3089;&#x5207;&#x308A;&#x96E2;&#x3055;&#x305A;&#x306B;&#x8131;&#x91CD;&#x5408;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x306E;&#x4E21;&#x7AEF;&#x306B;&#x3042;&#x308B;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30E1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30EB;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;processively&#x79FB;&#x52D5;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x3001;&#x30EA;&#x30A2;&#x30EB;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x3067;&#x3001;2&#x8272;&#x86CD;&#x5149;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3092;&#x5229;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x8868;&#x793A;&#x200B;&#x200B;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002; &#x26;#39;&#x672B;&#x7AEF;&#x306E;&#x30D3;&#x30E5;&#x30FC; &#x26;quot;&#x306E;&#x96FB;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x5206;&#x6790;&#x306F;&#x3001;&#x52D5;&#x539F;&#x4F53;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;16&#x500D;&#x306E;&#x5BFE;&#x79F0;&#x6027;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x3002; 13&#x500D;&#x3001;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x306E;&#x5BFE;&#x79F0;&#x6027;&#x306B;&#x95A2;&#x3057;&#x3066;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30A6;&#x30C8;&#xB7;&#x30AA;&#x30D6;&#xB7;&#x30EC;&#x30B8;&#x30B9;&#x30BF;&#x306E;&#x914D;&#x7F6E;&#x306F;&#x3001;&#x9759;&#x96FB;&#x7D50;&#x5408;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x306E;&#x30A4;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC;&#x30D5;&#x30A7;&#x30A4;&#x30B9;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x30B9;&#x30E9;&#x30A4;&#x30C9;&#x6A5F;&#x69CB;&#x3068;&#x4E00;&#x8CAB;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002; Dam1&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306F;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x306E;&#x5206;&#x96E2;&#x3092;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x683C;&#x5B50;&#x306B;&#x6CBF;&#x3063;&#x305F;&#x52D5;&#x304D;&#x306B;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x306E;&#x8131;&#x91CD;&#x5408;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x751F;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x529B;&#x3092;&#x5909;&#x63DB;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x3001;&#x5206;&#x5B50;&#x30C7;&#x30D0;&#x30A4;&#x30B9;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

Dam1&#x306E;&#x52D5;&#x539F;&#x4F53;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x306F;&#x8131;&#x91CD;&#x5408;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7BA1;&#x4E21;&#x7AEF;&#x306B;Processively&#x79FB;&#x52D5;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xC5FC;&#xC0C9;&#xCCB4; microtubule &#xD50C;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xB05D;&#xC758; kinetochores&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD558; &#xACE0; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC740; &#xC720;&#xC0AC; &#xBD84;&#xC5F4;&#xC758; A anaphase &#xC911; kinetochore microtubules &#xB2E8;&#xCD95;&#xC73C;&#xB85C; &#xC2A4;&#xD540; &#xB4E4; &#xAE30;&#xB465;&#xC5D0; &#xCC28;&#xBCC4; &#xC788;&#xB2E4;. &#xBD84;&#xC790; &#xBCF8;&#xC131; &#xBC0F; id microtubule depolymerization anaphase &#xC911; &#xAE30;&#xB465;&#xC5D0; &#xC5FC;&#xC0C9;&#xCCB4;&#xB97C; &#xB2F9;&#xAE38; &#xC218; &#xC788;&#xB3C4;&#xB85D; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xCEE4;&#xD50C;&#xB9C1;&#xC758; &#xAE34; &#xC560;&#xB9E4; &#xB0A8;&#xC544; &#xC788;&#xB2E4;. &#xC2E0;&#xC9C4; &#xD6A8; &#xBAA8; 10-&#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; Dam1 &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678; microtubule &#xC8FC;&#xC704; 50 nm &#xBC18;&#xC9C0;&#xB85C; oligomerizes kinetochore&#xC758; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; microtubule &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xAD6C;&#xC131; &#xC694;&#xC18C;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xBCF4;&#xAE30;, &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04;, 2 &#xC0C9; &#xD615;&#xAD11; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xBC18;&#xC9C0; processively &#xACA9;&#xC790;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBD84;&#xB9AC; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xACE0; microtubules depolymerizing&#xC758; &#xB05D;&#xC5D0; &#xBA87; &#xB9C8;&#xC774;&#xD06C;&#xB85C;&#xBBF8;&#xD130;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC774;&#xB3D9;. &#39;&#xB05D;&#xC5D0; &#xBCF4;&#xAE30;&#39;&#xC758; &#xC804;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xBD84;&#xC11D; kinetochore &#xBC18;&#xC9C0;&#xC758; 16-fold &#xB300;&#xCE6D;&#xC744; &#xACF5;&#xAC1C; &#xD588;&#xB2E4;. 13-Fold microtubule &#xB300;&#xCE6D;&#xC5D0; &#xB300;&#xD574;&#xC774; &#xB808;&#xC9C0;&#xC2A4;&#xD130; &#xBC16;&#xC73C;&#xB85C; &#xC815;&#xB82C;&#xC740; electrostatically &#xCEE4;&#xD50C;&#xB9C1;&#xB41C; &#xBC18;&#xC9C0; microtubule &#xC778;&#xD130;&#xD398;&#xC774;&#xC2A4; &#xAE30;&#xBC18; &#xC2AC;&#xB77C;&#xC774;&#xB529; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; &#xC77C;&#xCE58; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; Dam1 &#xBC18;&#xC9C0; microtubule depolymerization &#xC5FC;&#xC0C9;&#xCCB4; &#xBD84;&#xB9AC;&#xB97C; &#xCD09;&#xC9C4; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD558;&#xC5EC; &#xACA9;&#xC790;&#xB97C; &#xB530;&#xB77C; &#xC6B4;&#xB3D9;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC0DD;&#xC131; &#xB41C; &#xD798;&#xC744; &#xBC88;&#xC5ED;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xBD84;&#xC790; &#xC7A5;&#xCE58;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; Dam1 kinetochore &#xBC18;&#xC9C0; processively depolymerizing microtubule &#xB05D;&#xC5D0; &#xC774;&#xB3D9; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Los cromosomas interaccionan a trav&#xE9;s de sus cinetocoros a los microt&#xFA;bulos m&#xE1;s extremos y que son segregadas a los polos del huso, como los microt&#xFA;bulos kinetochore acortan durante la anafase A de la mitosis. La naturaleza molecular y la identidad de las prote&#xED;nas de acoplamiento que permiten la despolimerizaci&#xF3;n de los microt&#xFA;bulos para tirar de los cromosomas hacia los polos durante la anafase desde hace mucho tiempo siendo dif&#xED;cil de alcanzar. En la levadura en ciernes, el complejo de diez prote&#xED;nas Dam1 es una cr&#xED;tica de los microt&#xFA;bulos de uni&#xF3;n a los componentes del cinetocoro que oligomerizes en un anillo de 50 nm en torno a un microt&#xFA;bulos in vitro. Aqu&#xED; nos muestran, con el uso de un tiempo real, de dos colores ensayo microscop&#xED;a de fluorescencia, que el complejo de anillo se mueve processively para varias micras en los extremos de los microt&#xFA;bulos depolymerizing sin separarse de la celos&#xED;a. El an&#xE1;lisis por microscop&#xED;a electr&#xF3;nica de &#x26;#39;final de puntos de vista &#x26;quot;revel&#xF3; una simetr&#xED;a de 16 veces de los anillos cinetocoro. Esta disposici&#xF3;n fuera del registro con respecto a la simetr&#xED;a de microt&#xFA;bulos 13-pliegue es consistente con un mecanismo de deslizamiento sobre la base de un anillo unido electrost&#xE1;ticamente-microt&#xFA;bulos interfaz. El complejo anillo Dam1 es un dispositivo molecular que puede traducir la fuerza generada por despolimerizaci&#xF3;n de microt&#xFA;bulos en movimiento a lo largo de la red para facilitar la segregaci&#xF3;n de cromosomas.

Article	Year
High-throughput film-densitometry: an efficient approach to generate large data sets. Journal of structural biology\| PubMed ID: 15629654	2005
Formation of a dynamic kinetochore- microtubule interface through assembly of the Dam1 ring complex. Molecular cell\| PubMed ID: 15664196	2005
The Dam1 kinetochore ring complex moves processively on depolymerizing microtubule ends. Nature\| PubMed ID: 16415853	2006

Agustin Avila-Sakar

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