the-preparation-primary-hematopoietic-cell-cultures-from-murine-bone

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Bio-Rad Laboratories, Inc

&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x7684;&#x5B9A;&#x6027;&#x8367;&#x5149;&#x591A;&#x91CD;&#x5747;&#x8D28;&#x6CD5;&#x5728;&#x4F7F;&#x7528;&#x53CC;&#x6807;&#x8BB0;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x63A2;&#x9488;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x6700;&#x5E38;&#x89C1;&#x8840;&#x8272;&#x7A81;&#x53D8;&#x68C0;&#x6D4B;&#x4E3A;&#x8BBE;&#x8BA1;&#x7684;&#x53D1;&#x5C55;&#x3002;&#x53EF;&#x5728;&#x5355;&#x4E2A;&#x95ED;&#x7BA1;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x662F;&#x5355;&#x4E00;&#x7684;&#x51B7;&#x70ED;&#x5FAA;&#x73AF;&#x534F;&#x8BAE;&#x68C0;&#x6D4B;&#x56DB;&#x4E2A;&#x57FA;&#x56E0;&#x591A;&#x6001;&#x6027;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x8BE5;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x5C06;&#x5927;&#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#x7684;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x94FE;&#x53CD;&#x5E94;&#xFF0C;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x6742;&#x4EA4;&#x4F7F;&#x7528; 5(&#39;) &#x6838;&#x9178;&#x9176;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x683C;&#x5F0F;&#x548C;&#x66F4;&#x9AD8;&#x7684;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x7684;&#x591A;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x68C0;&#x6D4B;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x6240;&#x63D0;&#x4F9B;&#x7684;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x7ED3;&#x5408;&#x8D77;&#x6765;&#x3002;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4; DNA &#x662F;&#x4ECE;&#x5168;&#x8840;&#x6807;&#x672C;&#x4F7F;&#x7528;&#x6807;&#x51C6;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x7F16;&#x5199;&#x7684;&#x3002;&#x540E; DNA &#x6837;&#x54C1;&#x5236;&#x5907;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC; H63D &#x548C; C282Y &#x57FA;&#x56E0;&#x7A81;&#x53D8;&#x7684;&#x8840;&#x8272;&#x75C5;&#x57FA;&#x56E0; (HFE) &#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x533A;&#x57DF;&#x662F; coamplified &#x548C;&#x5B9E;&#x65F6;&#x7531;&#x56DB;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x540C;&#x9057;&#x4F20;&#x7269;&#x8D28;&#x6807;&#x8BB0;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x63A2;&#x9488;&#x68C0;&#x6D4B;&#x5230;&#x3002;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x68C0;&#x6D4B;&#x8BC1;&#x660E;&#x4E86;&#x76F2;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6BD4;&#x8F83;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x5305;&#x62EC; 37 &#x4ECE;&#x5DF2;&#x77E5;&#x7684; HFE &#x57FA;&#x56E0;&#x578B;&#x4E0E;&#x4E2A;&#x4EBA;&#x7684; DNA &#x6837;&#x672C;&#x3002;&#x4ECE;&#x8FD9;&#x9879;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x663E;&#x793A;&#xFF0C;&#x591A;&#x8272;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528; HFE &#x6D4B;&#x5B9A;&#x6BEB;&#x4E0D;&#x542B;&#x7CCA;&#x5730;&#x5F52;&#x7C7B;&#x4E3A; HFE &#x57FA;&#x56E0; C282Y &#x548C; H63D mutations(1) &#x6240;&#x6709;&#x53EF;&#x80FD;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x578B;&#x3002;&#x6B64;&#x6280;&#x672F;&#x5C06;&#x6709;&#x52A9;&#x4E8E;&#x7814;&#x7A76;&#x548C;&#x5206;&#x5B50;&#x8BCA;&#x65AD;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4E14;&#x53EF;&#x4EE5;&#x8F7B;&#x677E;&#x5730;&#x9002;&#x5E94;&#x5176;&#x4ED6;&#x5355;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x591A;&#x6001;&#x6027;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x3002;

&#x8367;&#x5149;&#x591A;&#x8272;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x5747;&#x8D28;&#x6CD5;&#x540C;&#x65F6;&#x5206;&#x6790;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x6700;&#x5E38;&#x89C1;&#x7684;&#x8840;&#x8272;&#x75C5;&#x57FA;&#x56E0;&#x7A81;&#x53D8;&#x3002;

We report the development of a qualitative fluorescent multiplex homogeneous assay designed for the detection of the two most common hemochromatosis mutations using dual-labeled fluorescent probes. The assay is able to detect four allelic variants in a single closed tube using a single thermocycling protocol. The procedure combines the great sensitivity of the polymerase chain reaction, the specificity provided by allele-specific oligonucleotide hybridization using the 5(') nuclease assay format, and the higher throughput of a multicolor fluorescence detection procedure. Genomic DNA was prepared from whole blood specimens using standard procedures. Following DNA sample preparation, two regions of the hemochromatosis gene (HFE) including the H63D and C282Y mutations were coamplified and detected in real-time by four different fluorescently labeled allele-specific oligonucleotide probes. Assay specificity was demonstrated by a blind methods comparison study that included 37 DNA samples from individuals with a known HFE genotype. Results from the study showed that the multicolor multiplex HFE assay unambiguously classified all possible genotypes for the HFE gene C282Y and H63D mutations(1). This technique will be useful for research and molecular diagnostic laboratories and can be easily adapted for the detection of other single nucleotide polymorphisms.

Fluorescent multicolor multiplex homogeneous assay for the simultaneous analysis of the two most common hemochromatosis mutations.

Nous rapportons le d&#xE9;veloppement d&#x26;#39;un dosage qualitatif multiplex fluorescente homog&#xE8;ne con&#xE7;u pour la d&#xE9;tection des deux mutations les plus courantes en utilisant l&#x26;#39;h&#xE9;mochromatose double sondes marqu&#xE9;es fluorescentes. Le dosage est capable de d&#xE9;tecter quatre variantes all&#xE9;liques dans un seul tube ferm&#xE9; &#xE0; l&#x26;#39;aide d&#x26;#39;un protocole de thermocyclage cl&#xE9;. La proc&#xE9;dure combine la grande sensibilit&#xE9; de la r&#xE9;action en cha&#xEE;ne par polym&#xE9;rase, la sp&#xE9;cificit&#xE9; fournies par all&#xE8;le sp&#xE9;cifique hybridation d&#x26;#39;oligonucl&#xE9;otides en utilisant le 5 (&#x26;#39;) format de dosage nucl&#xE9;ase, et l&#x26;#39;augmentation du d&#xE9;bit d&#x26;#39;une proc&#xE9;dure de d&#xE9;tection par fluorescence multicolore. L&#x26;#39;ADN g&#xE9;nomique a &#xE9;t&#xE9; pr&#xE9;par&#xE9; &#xE0; partir d&#x26;#39;&#xE9;chantillons de sang total en utilisant des proc&#xE9;dures standard. Suivante de pr&#xE9;paration des &#xE9;chantillons d&#x26;#39;ADN, deux r&#xE9;gions de g&#xE8;ne de l&#x26;#39;h&#xE9;mochromatose (HFE), y compris les H63D et C282Y ont &#xE9;t&#xE9; coamplified et d&#xE9;tect&#xE9; en temps r&#xE9;el par quatre diff&#xE9;rents marqu&#xE9;s par fluorescence sondes oligonucl&#xE9;otidiques sp&#xE9;cifiques d&#x26;#39;all&#xE8;les. Sp&#xE9;cificit&#xE9; de l&#x26;#39;&#xE9;preuve a &#xE9;t&#xE9; d&#xE9;montr&#xE9;e par une &#xE9;tude comparative des m&#xE9;thodes aveugle qui a port&#xE9; sur 37 &#xE9;chantillons d&#x26;#39;ADN provenant de personnes ayant un g&#xE9;notype HFE connue. Les r&#xE9;sultats de l&#x26;#39;&#xE9;tude a montr&#xE9; que le multiplex multicolore HFE dosage sans ambigu&#xEF;t&#xE9; class&#xE9; tous les g&#xE9;notypes possibles pour les mutation du g&#xE8;ne HFE C282Y et H63D (1). Cette technique sera utile pour la recherche et laboratoires de diagnostic mol&#xE9;culaire et peut &#xEA;tre facilement adapt&#xE9; pour la d&#xE9;tection d&#x26;#39;autres polymorphismes nucl&#xE9;otidiques simples.

Fluorescent Assay Multicolor Multiplex homog&#xE8;ne pour l&#x26;#39;analyse simultan&#xE9;e des deux mutations les plus courantes H&#xE9;mochromatose

Fluoreszierende multicolor Multiplex homogenen Assays f&#xFC;r die simultane Analyse der beiden h&#xE4;ufigsten Mutationen H&#xE4;mochromatose.

Riportiamo lo sviluppo di un fluorescente multiplex omogeneo dosaggio qualitativo progettato per la rilevazione delle due mutazioni emocromatosi pi&ugrave; comuni utilizzando sonde fluorescenti dual-contrassegnate. Il dosaggio &egrave; in grado di rilevare quattro varianti alleliche in un unico tubo chiuso utilizzando un protocollo unico thermocycling. La procedura combina la grande sensibilit&agrave; di reazione a catena della polimerasi, la specificit&agrave; fornita tramite l&#39;ibridazione allele-specific oligonucleotide utilizzando il formato di dosaggio nucleasi 5(&#39;) e la velocit&agrave; superiore di una procedura di rilevazione di fluorescenza multicolore. DNA genomico &egrave; stato preparato da campioni di sangue intero utilizzando le procedure standard. Preparazione del campione di DNA, a seguito di due regioni del gene dell&#39;emocromatosi (HFE) tra cui le mutazioni H63D e C282Y erano coamplified e rilevati tempo reale da quattro differenti fluorescente etichettati sonde del oligonucleotide allele-specifico. Specificit&agrave; del test &egrave; stato dimostrato da uno studio di confronto metodi cieco che comprendeva 37 campioni di DNA da individui con un genotipo HFE noto. Risultati dallo studio ha mostrato che il multicolor dosaggio multiplex HFE classificati inequivocabilmente tutti i genotipi possibili per il gene HFE C282Y e H63D mutations(1). Questa tecnica sar&agrave; utile per la ricerca e laboratori di diagnostiche molecolare e pu&ograve; essere facilmente adattata per la rilevazione di altri polimorfismi a singolo nucleotide.

Fluorescente multicolore multiplex omogeneo test per l&#39;analisi simultanea delle due pi&ugrave; comuni mutazioni emocromatosi.

&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x4E8C;&#x91CD;&#x6A19;&#x8B58;&#x86CD;&#x5149;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;2&#x3064;&#x306E;&#x6700;&#x3082;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306A;&#x30D8;&#x30E2;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5B9A;&#x6027;&#x7684;&#x306A;&#x591A;&#x91CD;&#x86CD;&#x5149;&#x30DB;&#x30E2;&#x30B8;&#x30CB;&#x30A2;&#x30B9;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x5831;&#x544A;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306F;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x71B1;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x9589;&#x3058;&#x305F;&#x30C1;&#x30E5;&#x30FC;&#x30D6;&#x3067;4&#x3064;&#x306E;&#x5BFE;&#x7ACB;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x3092;&#x691C;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x306E;&#x624B;&#x9806;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x9023;&#x9396;&#x53CD;&#x5FDC;&#x3001;5&#xFF08; &#x26;#39;&#xFF09;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x5F62;&#x5F0F;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x5BFE;&#x7ACB;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C0;&#x30A4;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3001;&#x591A;&#x8272;&#x86CD;&#x5149;&#x691C;&#x51FA;&#x6CD5;&#x306E;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x611F;&#x5EA6;&#x3092;&#x517C;&#x306D;&#x5099;&#x3048;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;DNA&#x306F;&#x3001;&#x6A19;&#x6E96;&#x7684;&#x306A;&#x624B;&#x9806;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x5168;&#x8840;&#x691C;&#x4F53;&#x304B;&#x3089;&#x8ABF;&#x88FD;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x4EE5;&#x4E0B;&#x306E;DNA&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x8ABF;&#x88FD;&#x3001;H63D&#x3068;C282Y&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30D8;&#x30E2;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#xFF08;HFE&#xFF09;&#x306E;2&#x3064;&#x306E;&#x9818;&#x57DF;&#x306F;4&#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;&#x3057;&#x305F;&#x30A2;&#x30EC;&#x30EB;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x30EA;&#x30A2;&#x30EB;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x3067;&#x5171;&#x5897;&#x5E45;&#x3068;&#x691C;&#x51FA;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x306F;&#x77E5;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;HFE&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x578B;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x500B;&#x4F53;&#x304B;&#x3089;&#x306E;37&#x306E;DNA&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x76F2;&#x691C;&#x6CD5;&#x306E;&#x6BD4;&#x8F03;&#x7814;&#x7A76;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x591A;&#x8272;&#x591A;&#x91CD;&#x306F;HFE&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x660E;&#x78BA;&#x306B;HFE&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;C282Y&#x3068;H63D&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#xFF08;1&#xFF09;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x578B;&#x3092;&#x5206;&#x985E;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x624B;&#x6CD5;&#x306F;&#x3001;&#x7814;&#x7A76;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5206;&#x5B50;&#x8A3A;&#x65AD;&#x30E9;&#x30DC;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x6709;&#x7528;&#x3067;&#x3042;&#x308D;&#x3046;&#x3068;&#x7C21;&#x5358;&#x306B;&#x4ED6;&#x306E;&#x4E00;&#x5869;&#x57FA;&#x591A;&#x578B;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x9069;&#x5408;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x6700;&#x3082;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306A;&#x30D8;&#x30E2;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x540C;&#x6642;&#x5206;&#x6790;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x591A;&#x8272;&#x591A;&#x91CD;&#x30DB;&#x30E2;&#x30B8;&#x30CB;&#x30A2;&#x30B9;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;

&#xC6B0;&#xB9AC; &#xBCF4;&#xACE0;&#xB294; &#xC9C8;&#xC801; &#xD615;&#xAD11; &#xBA40;&#xD2F0;&#xD50C;&#xB809;&#xC2A4; &#xB3D9;&#xC885; &#xC2DC;&#xD5D8; &#xB4C0;&#xC5BC; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB41C; &#xD615;&#xAD11; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xAC00;&#xC7A5; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC778; hemochromatosis &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xAC80;&#xCD9C;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xB2E8;&#xC77C; thermocycling &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB2E8;&#xC77C; &#xB2EB;&#xD78C;&#xB41C; &#xD29C;&#xBE0C;&#xC5D0; 4 &#xAC1C;&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBCC0;&#xC885;&#xC744; &#xAC10;&#xC9C0;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4;. &#xD504;&#xB85C;&#xC2DC;&#xC800; 5(&#39;) nuclease &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xD615;&#xC2DD;&#xACFC; &#xB2E4; &#xC0C9; &#xD615;&#xAD11; &#xAC80;&#xCD9C; &#xC808;&#xCC28;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB300;&#xB9BD; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xD2B9;&#xC815; oligonucleotide &#xAD50; &#xC7A1;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xB294; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131; &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC5F0;&#xC1C4; &#xBC18;&#xC751;&#xC758; &#xC88B;&#xC740; &#xAC10;&#xB3C4; &#xACB0;&#xD569; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAC8C;&#xB188; DNA&#xB294; &#xD45C;&#xC900; &#xC808;&#xCC28;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC804;&#xCCB4; &#xD608;&#xC561; &#xD45C;&#xBCF8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC900;&#xBE44; &#xD588;&#xB2E4;. DNA &#xC0D8;&#xD50C; &#xC900;&#xBE44;, H63D &#xBC0F; C282Y &#xBCC0;&#xC774; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558; &#xC5EC; hemochromatosis &#xC720;&#xC804;&#xC790; (HFE)&#xC758; &#xB450; &#xC601;&#xC5ED; coamplified&#xB97C; 4 &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04; &#xB2E4;&#xB978; &#xB193;&#xC5EC;&#xC788;&#xB294;&#xC9C0; &#xB77C;&#xB294; &#xB300;&#xB9BD; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xD2B9;&#xC815; oligonucleotide &#xC870;&#xC0AC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xACAC; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4;&#xB41C; HFE &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xD615;&#xC744; &#xAC00;&#xC9C4; &#xAC1C;&#xC778;&#xC5D0;&#xC11C; 37 DNA &#xC0D8;&#xD50C;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xB208; &#xBA3C; &#xBC29;&#xBC95; &#xBE44;&#xAD50; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC785;&#xC99D; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xAC00;&#xC9C0; &#xBE5B;&#xAE54;&#xC758; &#xBA40;&#xD2F0;&#xD50C;&#xB809;&#xC2A4; HFE &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xBA85;&#xD655; &#xD558; &#xAC8C; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; genotypes HFE &#xC720;&#xC804;&#xC790; C282Y &#xBC0F; H63D mutations(1) &#xBD84;&#xB958; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC774; &#xAE30;&#xC220;&#xC740; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xBC0F; &#xBD84;&#xC790; &#xC9C4;&#xB2E8; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB3C4;&#xC6C0;&#xC774; &#xB420; &#xAC83;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xB2E4;&#xB978; &#xD558;&#xB098;&#xC758; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; polymorphisms&#xC758; &#xBC1C;&#xACAC;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xC27D;&#xAC8C; &#xC801;&#xC751; &#xC2DC;&#xD0AC; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4;.

&#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xAC00;&#xC7A5; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC778; hemochromatosis &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xB3D9;&#xC2DC; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xD615;&#xAD11; &#xBE5B;&#xAE54; &#xBA40;&#xD2F0;&#xD50C;&#xB809;&#xC2A4; &#xB3D9;&#xC885; &#xC2DC;&#xD5D8;.

Se presenta el desarrollo de un ensayo cualitativo fluorescente homog&#xE9;nea m&#xFA;ltiplex dise&#xF1;ado para la detecci&#xF3;n de las dos mutaciones m&#xE1;s comunes hemocromatosis utilizando doble etiquetado sondas fluorescentes. El ensayo es capaz de detectar cuatro variantes al&#xE9;licas en un solo tubo cerrado utilizando un protocolo de termociclado clave. El procedimiento combina la gran sensibilidad de la reacci&#xF3;n en cadena de la polimerasa, la especificidad proporcionada por alelo-espec&#xED;ficas de hibridaci&#xF3;n de oligonucle&#xF3;tidos utilizando el 5 (&#x26;#39;) nucleasa formato de ensayo, y el rendimiento m&#xE1;s alto de un procedimiento de detecci&#xF3;n de fluorescencia multicolor. El ADN gen&#xF3;mico se prepar&#xF3; a partir de muestras de sangre entera usando procedimientos est&#xE1;ndar. Despu&#xE9;s de la preparaci&#xF3;n de la muestra de ADN, dos regiones del gen de la hemocromatosis (HFE), incluidas las mutaciones H63D y C282Y se coamplified y se detecta en tiempo real por cuatro diferentes sondas de oligonucle&#xF3;tidos marcados con fluorescencia alelo-espec&#xED;ficas. Especificidad del ensayo fue demostrado por un estudio de comparaci&#xF3;n de m&#xE9;todos ciego que incluy&#xF3; 37 muestras de ADN de los individuos con un conocido el genotipo. Los resultados del estudio mostraron que el m&#xFA;ltiplex multicolor HFE ensayo sin ambig&#xFC;edades clasifican todos los genotipos posibles para las mutaciones del gen HFE C282Y y H63D (1). Esta t&#xE9;cnica ser&#xE1; &#xFA;til para la investigaci&#xF3;n y laboratorios de diagn&#xF3;stico molecular y puede ser f&#xE1;cilmente adaptado para la detecci&#xF3;n de otros polimorfismos de nucle&#xF3;tidos simples.

Fluorescente multicolor ensayo m&#xFA;ltiple homog&#xE9;nea para el an&#xE1;lisis simult&#xE1;neo de las dos mutaciones m&#xE1;s comunes de Hemocromatosis

HFE&#xFF0C;G845A &#x4E24;&#x4E2A;&#x7A81;&#x53D8; &#xFF08;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x66FF;&#x4EE3; C282Y&#xFF09; &#x548C; C187G &#xFF08;H63D&#xFF09; &#x4E0E;&#x9057;&#x4F20;&#x6027;&#x8840;&#x8272;&#x7D20;&#x6C89;&#x7740;&#x75C7;&#x76F8;&#x5173;&#x8054;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F00;&#x53D1;&#x548C;&#x9A8C;&#x8BC1;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B0;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x94FE;&#x63A5;&#x7EBF;&#x6027;&#x6269;&#x589E; (&#x9C8E;&#x8BD5;&#x5242;&#x6CD5;&#x68C0;&#x6D4B;&#xFF09;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E24;&#x4E2A;&#x57FA;&#x56E0;&#x7A81;&#x53D8;&#x68C0;&#x6D4B;&#x3002;

&#x94FE;&#x63A5;&#x7EBF;&#x6027;&#x6269;&#x589E;&#x7684;&#x540C;&#x65F6;&#x5206;&#x6790;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x6700;&#x5E38;&#x89C1;&#x7684;&#x8840;&#x8272;&#x75C5;&#x57FA;&#x56E0;&#x7A81;&#x53D8;&#x3002;

Two mutations in HFE, G845A (amino acid substitution C282Y) and C187G (H63D), are associated with hereditary hemochromatosis. We developed and validated a novel method, linked linear amplification (LLA), for detection of these two mutations.

Linked linear amplification for simultaneous analysis of the two most common hemochromatosis mutations.

Deux mutations dans HFE, G845A (amino C282Y substitution d&#x26;#39;acide) et C187G (H63D), sont associ&#xE9;s &#xE0; l&#x26;#39;h&#xE9;mochromatose h&#xE9;r&#xE9;ditaire. Nous avons d&#xE9;velopp&#xE9; et valid&#xE9; une m&#xE9;thode nouvelle, li&#xE9;e amplification lin&#xE9;aire (LLA), pour la d&#xE9;tection de ces deux mutations.

Li&#xE9; amplification lin&#xE9;aire pour l&#x26;#39;analyse simultan&#xE9;e des deux mutations les plus courantes H&#xE9;mochromatose

Linked lineare Verst&#xE4;rkung f&#xFC;r die gleichzeitige Analyse der beiden h&#xE4;ufigsten Mutationen H&#xE4;mochromatose.

Due mutazioni HFE, G845A (aminoacido sostituzione C282Y) e C187G (H63D), sono associati con emocromatosi ereditaria. Abbiamo sviluppato e validato un metodo romanzo, amplificazione lineare collegati (LLA), per la rilevazione di queste due mutazioni.

Collegato amplificazione lineare per analisi simultanea delle due pi&ugrave; comuni mutazioni emocromatosi.

HFE&#x306E;2&#x3064;&#x306E;&#x5909;&#x7570;G845A&#xFF08;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x7F6E;&#x63DB;C282Y&#xFF09;&#x3068;C187G&#xFF08;H63D&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x907A;&#x4F1D;&#x6027;&#x30D8;&#x30E2;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;2&#x3064;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x691C;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x3001;&#x65B0;&#x898F;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x30AF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7DDA;&#x5F62;&#x5897;&#x5E45;&#xFF08;LLA&#xFF09;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x3001;&#x691C;&#x8A3C;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x6700;&#x3082;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306A;&#x30D8;&#x30E2;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x540C;&#x6642;&#x5206;&#x6790;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30EA;&#x30F3;&#x30AF;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x7DDA;&#x5F62;&#x5897;&#x5E45;

HFE, G845A &#xB450; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; (&#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xB97C; &#xD568;&#xC720;&#xD55C; &#xC0B0; &#xC131; &#xB300;&#xCCB4; C282Y) &#xBC0F; C187G (H63D) &#xC720;&#xC804; hemochromatosis &#xC5F0;&#xAD00; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD558; &#xACE0; &#xC18C;&#xC124; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;, &#xC5F0;&#xACB0; &#xB41C; &#xC120;&#xD615; &#xC99D;&#xD3ED; (LLA) &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB450; &#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xAC80;&#xCD9C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC720;&#xD6A8;&#xC131;&#xC744; &#xAC80;&#xC0AC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xAC00;&#xC7A5; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC778; hemochromatosis &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xB3D9;&#xC2DC; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB41C; &#xC120;&#xD615; &#xC99D;&#xD3ED;.

Dos mutaciones en HFE, G845A (C282Y sustituci&#xF3;n de amino&#xE1;cidos) y C187G (H63D), se asocian con la hemocromatosis hereditaria. Hemos desarrollado y validado un m&#xE9;todo novedoso, relacionado amplificaci&#xF3;n lineal (LLA), para la detecci&#xF3;n de estas dos mutaciones.

Amplificaci&#xF3;n vinculado lineal para el an&#xE1;lisis simult&#xE1;neo de las dos mutaciones m&#xE1;s comunes de Hemocromatosis

&#x5305;&#x542B;&#x9501;&#x5B9A;&#x7684;&#x6838;&#x9178; (&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;) &#x7684;&#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x63A2;&#x9488;&#x6742;&#x4EA4;&#x4E92;&#x8865;&#x7684;&#x5355;&#x94FE;&#x76EE;&#x6807; DNA &#x5E8F;&#x5217;&#x4E0E;&#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178; DNA &#x63A2;&#x9488;&#x76F8;&#x6BD4;&#x589E;&#x52A0;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x3002;&#x4F1A;&#x56E0;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x6B8B;&#x7559;&#x7EB3;&#x5165;&#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x5E8F;&#x5217;&#xFF0C;&#x800C;&#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x7684;&#x7194;&#x5316;&#x6E29;&#x5EA6;&#x6025;&#x5267;&#x589E;&#x5927;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x6210;&#x529F;&#x5730;&#x4F7F;&#x7528;&#x8F83;&#x77ED;&#x7684;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x63A2;&#x6D4B;&#x5668;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x57FA;&#x56E0;&#x5206;&#x578B;&#x68C0;&#x6D4B;&#x4E2D;&#x7684;&#x5DE5;&#x5177;&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x6587;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x63A2;&#x9488;&#x5B9E;&#x65F6;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x94FE;&#x53CD;&#x5E94;&#x4F7F;&#x7528; 5&#39;-&#x6838;&#x9178;&#x9176;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x4E2D;&#x5305;&#x542B;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x6B8B;&#x7559;&#x5B9A;&#x6027;&#x8367;&#x5149;&#x591A;&#x91CD;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x5355;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x591A;&#x6001;&#x6027; (SNPs) &#x7684;&#x53D1;&#x5C55;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F00;&#x53D1;&#x4E86;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x4E2D;&#x7684;&#x7B49;&#x4F4D;&#x57FA;&#x56E0;&#x6B67;&#x89C6;&#x7684;&#x5316;&#x9A8C;&#x663E;&#x793A;&#x6539;&#x8FDB;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x63A2;&#x9488;&#x7684;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x3002;&#x56DB;&#x8272; 5&#39;-&#x6838;&#x9178;&#x6CD5;&#x6240;&#x6D89;&#x53CA;&#x7684;&#x6700;&#x5E38;&#x89C1;&#x7684;&#x9057;&#x4F20;&#x56E0;&#x7D20;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5355;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x591A;&#x6001;&#x6027;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x8840;&#x6813;&#x7684;&#x5371;&#x9669;&#x3001; &#x56E0;&#x5B50; V &#x83B1;&#x987F;&#x548C;&#x51DD;&#x8840;&#x9176;&#x539F; G20210A &#x4E2D;&#x7684;&#x9996;&#x6B21;&#x5E94;&#x7528;&#x3002;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x4E2A;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x662F;&#x4E24;&#x8272;&#x6CD5;&#x5728;&#x5BC6;&#x7801;&#x5B50;&#x7684; &beta; &#x57FA;&#x56E0;&#xFF0C;&#x8D1F;&#x8D23;&#x9570;&#x72B6;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D2B;&#x8840; 6 A-T tranversion &#x5177;&#x4F53;&#x68C0;&#x6D4B;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x5F15;&#x7528;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x5728;&#x8FD9;&#x4E24;&#x79CD;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0B;&#x7684;&#x6027;&#x80FD;&#x8FDB;&#x884C;&#x6BD4;&#x8F83;&#x6765;&#x8BC4;&#x4F30;&#x68C0;&#x6D4B;&#x4E86;&#x8FD9;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5B9E;&#x65F6;&#x57FA;&#x56E0;&#x5206;&#x578B;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0; 100%&#x4E00;&#x81F4;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5C06;&#x6709;&#x52A9;&#x4E8E;&#x7814;&#x7A76;&#x548C;&#x5206;&#x5B50;&#x8BCA;&#x65AD;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x63D0;&#x4F9B;&#x7684;&#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178; DNA &#x63A2;&#x9488;&#x7684;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x4E0D;&#x8DB3;&#x4EE5;&#x533A;&#x5206;&#x4E24;&#x4E2A;&#x76F8;&#x5DEE;&#x53EA;&#x6709;&#x4E00;&#x4E2A;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x7684; DNA &#x5E8F;&#x5217;&#x7684;&#x60C5;&#x51B5;&#x3002;

&#x5B9E;&#x65F6;&#x57FA;&#x56E0;&#x5206;&#x578B;&#x4E0E;&#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x63A2;&#x9488;&#x5305;&#x542B;&#x9501;&#x5B9A;&#x7684;&#x6838;&#x9178;&#x3002;

Oligonucleotide probes containing locked nucleic acid (LNA) hybridize to complementary single-stranded target DNA sequences with an increased affinity compared to oligonucleotide DNA probes. As a consequence of the incorporation of LNA residues into the oligonucleotide sequence, the melting temperature of the oligonucleotide increases considerably, thus allowing the successful use of shorter LNA probes as allele-specific tools in genotyping assays. In this article, we report the use of probes containing LNA residues for the development of qualitative fluorescent multiplex assays for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in real-time polymerase chain reaction using the 5'-nuclease detection assay. We developed two applications that show the improved specificity of LNA probes in assays for allelic discrimination. The first application is a four-color 5'-nuclease assay for the detection of SNPs for two of the most common genetic factors involved in thrombotic risk, factor V Leiden and prothrombin G20210A. The second application is a two-color assay for the specific detection of the A-to-T tranversion in codon 6 of the beta-globin gene, responsible for sickle cell anemia. Both real-time genotyping assays were evaluated by comparing the performance of our method to that of a reference method and in both cases, we found a 100% concordance. This approach will be useful for research and molecular diagnostic laboratories in situations in which the specificity provided by oligonucleotide DNA probes is insufficient to discriminate between two DNA sequences that differ by only one nucleotide.

Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids.

Sondes oligonucl&#xE9;otidiques contenant verrouill&#xE9; acide nucl&#xE9;ique (LNA) s&#x26;#39;hybrider &#xE0; simple brin compl&#xE9;mentaires des s&#xE9;quences d&#x26;#39;ADN cibles ayant une affinit&#xE9; accrue par rapport &#xE0; des sondes d&#x26;#39;ADN oligonucl&#xE9;otidiques. En cons&#xE9;quence de l&#x26;#39;incorporation de r&#xE9;sidus de LNA dans la s&#xE9;quence de l&#x26;#39;oligonucl&#xE9;otide, la temp&#xE9;rature de fusion de l&#x26;#39;oligonucl&#xE9;otide augmente consid&#xE9;rablement, permettant ainsi l&#x26;#39;utilisation r&#xE9;ussie de sondes plus courtes que LNA all&#xE8;le outils sp&#xE9;cifiques dans les dosages de g&#xE9;notypage. Dans cet article, nous pr&#xE9;sentons l&#x26;#39;utilisation de sondes contenant des r&#xE9;sidus de LNA pour le d&#xE9;veloppement de dosages multiplex qualitatives fluorescents pour la d&#xE9;tection de polymorphismes nucl&#xE9;otidiques simples (SNP) en temps r&#xE9;el la r&#xE9;action en cha&#xEE;ne par polym&#xE9;rase en utilisant le test de d&#xE9;tection 5&#x26;#39;-nucl&#xE9;ase. Nous avons d&#xE9;velopp&#xE9; deux applications qui montrent la meilleure sp&#xE9;cificit&#xE9; des sondes dans des essais de LNA pour la discrimination all&#xE9;lique. La premi&#xE8;re application est un des quatre couleurs 5&#x26;#39;-nucl&#xE9;ase test pour la d&#xE9;tection de SNP pour deux des facteurs les plus communs g&#xE9;n&#xE9;tiques impliqu&#xE9;s dans le risque thrombotique, le facteur V Leiden et G20210A de la prothrombine. La seconde application est un test en deux couleurs pour la d&#xE9;tection sp&#xE9;cifique de la tranversion de A &#xE0; T dans le codon 6 du g&#xE8;ne b&#xEA;ta-globine, responsable de l&#x26;#39;an&#xE9;mie &#xE0; h&#xE9;maties falciformes. Les deux tests de g&#xE9;notypage en temps r&#xE9;el ont &#xE9;t&#xE9; &#xE9;valu&#xE9;es en comparant les performances de notre m&#xE9;thode &#xE0; celle d&#x26;#39;une m&#xE9;thode de r&#xE9;f&#xE9;rence et dans les deux cas, nous avons trouv&#xE9; une concordance de 100%. Cette approche sera utile pour la recherche et laboratoires de diagnostic mol&#xE9;culaire dans les situations o&#xF9; la sp&#xE9;cificit&#xE9; fournies par des sondes d&#x26;#39;ADN oligonucl&#xE9;otidiques est insuffisante pour discriminer entre les deux s&#xE9;quences d&#x26;#39;ADN qui diff&#xE8;rent par un seul nucl&#xE9;otide.

En temps r&#xE9;el de g&#xE9;notypage avec des sondes oligonucl&#xE9;otidiques contenant des acides nucl&#xE9;iques verrouill&#xE9;s

Echtzeit-Genotypisierung mit Oligonukleotid-Sonden mit Locked-Nukleins&#xE4;uren.

Le sonde del oligonucleotide contenente acido nucleico locked (LNA) ibridano alle sequenze del DNA bersaglio singolo filamento complementare con un&#39;affinit&agrave; maggiore rispetto al DNA sonde del oligonucleotide. Come conseguenza l&#39;incorporazione dei residui di LNA nella sequenza del oligonucleotide, la temperatura di fusione del oligonucleotide aumenta notevolmente, permettendo cos&igrave; l&#39;uso riuscito di sonde LNA pi&ugrave; brevi come strumenti di allele-specific in dosaggi di genotipizzazione. In questo articolo, segnaliamo l&#39;uso di sonde contenenti residui LNA per lo sviluppo qualitativo dosaggi multiplex fluorescenti per l&#39;individuazione di polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) in reazione a catena della polimerasi in tempo reale utilizzando la 5&#39;-test di rilevamento della nucleasi. Abbiamo sviluppato due applicazioni che mostrano la migliore specificit&agrave; delle sonde LNA in dosaggi per discriminazione allelica. La prima applicazione &egrave; una quadricromia 5&#39;-saggio di nucleasi per la rilevazione di SNP per due dei pi&ugrave; comuni fattori genetici coinvolti nel rischio trombotico, fattore V di Leiden e protrombina G20210A. La seconda applicazione &egrave; un saggio di due colori per il rilevamento specifico della tranversion A-a-T nel codone 6 del gene della beta-globina, responsabile dell&#39;anemia falciforme. Sia in tempo reale genotyping assays sono stati valutati confrontando le prestazioni del nostro metodo e quella di un metodo di riferimento e in entrambi i casi, abbiamo trovato una concordanza del 100%. Questo approccio sar&agrave; utile per la ricerca e laboratori di diagnostiche molecolare in situazioni in cui la specificit&agrave; fornita dal DNA sonde del oligonucleotide &egrave; insufficiente per discriminare tra due sequenze di DNA che differiscono per un solo nucleotide.

Genotipizzazione in tempo reale con oligonucleotide sonde contenenti acidi nucleici bloccati.

&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6838;&#x9178;&#xFF08;LNA&#xFF09;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306F;&#x3001;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;DNA&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306B;&#x6BD4;&#x3079;&#x3066;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x305F;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3068;&#x76F8;&#x88DC;&#x7684;&#x306A;&#x4E00;&#x672C;&#x9396;&#x6A19;&#x7684;DNA&#x914D;&#x5217;&#x306B;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C0;&#x30A4;&#x30BA;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x914D;&#x5217;&#x306B;LNA&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x8FBC;&#x307F;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x878D;&#x89E3;&#x6E29;&#x5EA6;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x30B8;&#x30A7;&#x30CE;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D4;&#x30F3;&#x30B0;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x5BFE;&#x7ACB;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x306A;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x306E;&#x77ED;&#x3044;LNA&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x306E;&#x6210;&#x529F;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x3001;&#x304B;&#x306A;&#x308A;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x672C;&#x7A3F;&#x3067;&#x306F;&#x3001;5&#x26;#39;-&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x691C;&#x51FA;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x30EA;&#x30A2;&#x30EB;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x9023;&#x9396;&#x53CD;&#x5FDC;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x5358;&#x4E00;&#x5869;&#x57FA;&#x591A;&#x578B;&#xFF08;SNP&#xFF09;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x5B9A;&#x6027;&#x7684;&#x306A;&#x86CD;&#x5149;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30D7;&#x30EC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;LNA&#x6B8B;&#x57FA;&#x3092;&#x542B;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x3092;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x5BFE;&#x7ACB;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5DEE;&#x5225;&#x306E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;LNA&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306E;&#x6539;&#x826F;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3059;2&#x3064;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6700;&#x521D;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x8840;&#x6813;&#x75C7;&#x306E;&#x30EA;&#x30B9;&#x30AF;&#x3001;&#x7B2C;V&#x56E0;&#x5B50;&#x30E9;&#x30A4;&#x30C7;&#x30F3;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30ED;&#x30F3;&#x30D3;&#x30F3;G20210A&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;&#x6700;&#x3082;&#x4E00;&#x822C;&#x7684;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x7684;&#x8981;&#x56E0;&#x306E;&#x3046;&#x3061;2&#x3064;&#x306E;SNP&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;4&#x3064;&#x306E;&#x8272;&#x306E;5&#x26;#39;-&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x756A;&#x76EE;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x938C;&#x72B6;&#x8D64;&#x8840;&#x7403;&#x8CA7;&#x8840;&#x306E;&#x8CAC;&#x4EFB;&#x3B2;-&#x30B0;&#x30ED;&#x30D3;&#x30F3;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x30B3;&#x30C9;&#x30F3;6&#x5BFE;T&#x306E;tranversion&#x306E;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x691C;&#x51FA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;2&#x8272;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x4E21;&#x65B9;&#x3068;&#x3082;&#x30EA;&#x30A2;&#x30EB;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x30B8;&#x30A7;&#x30CE;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D4;&#x30F3;&#x30B0;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306F;&#x3001;&#x57FA;&#x6E96;&#x6CD5;&#x306E;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x63D0;&#x6848;&#x624B;&#x6CD5;&#x306E;&#x6027;&#x80FD;&#x3092;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B9;&#x3067;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;100&#xFF05;&#x306E;&#x4E00;&#x81F4;&#x3092;&#x898B;&#x3064;&#x3051;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306F;&#x3001;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;DNA&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x304C;1&#x3064;&#x3060;&#x3051;&#x306E;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x304C;&#x7570;&#x306A;&#x308B;2&#x3064;&#x306E;DNA&#x914D;&#x5217;&#x3092;&#x533A;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x4E0D;&#x5341;&#x5206;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x72B6;&#x6CC1;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x7814;&#x7A76;&#x3068;&#x5206;&#x5B50;&#x8A3A;&#x65AD;&#x30E9;&#x30DC;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x6709;&#x7528;&#x3067;&#x3042;&#x308D;&#x3046;&#x3002;

&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6838;&#x9178;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30EA;&#x30A2;&#x30EB;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x30B8;&#x30A7;&#x30CE;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D4;&#x30F3;&#x30B0;

&#xC7A0;&#xAE34;&#xB41C; &#xD575; &#xC0B0; (LNA)&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; oligonucleotide &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C; oligonucleotide DNA &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xC99D;&#xAC00; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xBCF4;&#xC644;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; &#xB300;&#xC0C1; DNA &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xB97C; &#xAD50;&#xBC30;. Oligonucleotide &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xB85C; LNA &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC758; &#xC124;&#xB9BD;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC;&#xB85C; oligonucleotide&#xC758; &#xB179;&#xB294; &#xC628;&#xB3C4; &#xC99D;&#xAC00;, &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD788; &#xD558;&#xBBC0;&#xB85C; &#xC720;&#xC804;&#xD615; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB300;&#xB9BD; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xD2B9;&#xC815; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xB85C; &#xC9E7;&#xC740; LNA &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xC758; &#xC131;&#xACF5;&#xC801;&#xC778; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC774; &#xAC00;&#xB2A5; &#xD558;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBB38;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C;&#xB294; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB2E8;&#xC77C; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; polymorphisms (Snp)&#xC758; &#xAC80;&#xCD9C;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xC9C8;&#xC801; &#xD615;&#xAD11; &#xB2E4;&#xC911; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC758; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; LNA &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; 5&#39;-nuclease &#xD0D0;&#xC9C0; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04; &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC5F0;&#xC1C4; &#xBC18;&#xC751;&#xC5D0; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;&#xB97C; &#xBCF4;&#xACE0; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xCC28;&#xBCC4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0; LNA &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC744; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD558;&#xB294; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC744; &#xAC1C;&#xBC1C;. &#xCCAB; &#xBC88;&#xC9F8; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8; thrombotic &#xC704;&#xD5D8;, &#xBE0C; &#xB808;&#xC774; &#xB4E0; &#xBE44;&#xC728;&#xACFC; &#xD504;&#xB85C;&#xD2B8; g20210a&#xC5D0; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xAC00;&#xC7A5; &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC778; &#xC720;&#xC804; &#xC694;&#xC778; &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; Snp&#xC758; &#xAC80;&#xCD9C;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; 4 &#xC0C9; 5&#39;-nuclease &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC774;&#xB2E4;. &#xB450; &#xBC88;&#xC9F8; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8; codon beta globin &#xC720;&#xC804;&#xC790;, &#xB0AB; &#xC138;&#xD3EC; &#xBE48; &#xD608;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCC45;&#xC784;&#xC758; 6&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; A T tranversion&#xC758; &#xD2B9;&#xC815; &#xAC80;&#xC0C9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; 2 &#xCEEC;&#xB7EC; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC774;&#xB2E4;. &#xBAA8;&#xB450; &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04; &#xC720;&#xC804;&#xD615; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC744; &#xCC38;&#xC870; &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xACBD;&#xC6B0; &#xBAA8;&#xB450;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xC131;&#xB2A5; &#xBE44;&#xAD50; &#xD3C9;&#xAC00;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; 100% &#xC77C;&#xCE58;&#xB97C; &#xBC1C;&#xACAC;. &#xC774; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xBC0F; &#xBD84;&#xC790; &#xC9C4;&#xB2E8; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC18C;&#xB294; oligonucleotide DNA &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xB294; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131; &#xD558;&#xB098;&#xC758; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xB2E4;&#xB978; &#xB450; DNA &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xB97C; &#xAD6C;&#xBCC4; &#xD558;&#xAE30;&#xC5D0; &#xCDA9;&#xBD84; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; &#xC0C1;&#xD669;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB3C4;&#xC6C0;&#xC774; &#xB420; &#xAC83;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Oligonucleotide&#xC640; &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04; &#xC720;&#xC804;&#xD615; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C; &#xC7A0;&#xAE34;&#xB41C; &#xD575; &#xC0B0;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Las sondas de oligonucle&#xF3;tidos que contienen &#xE1;cido nucleico cerrado (LNA) hibridar con complementarias de cadena simple secuencias diana de ADN con una afinidad mayor en comparaci&#xF3;n con las sondas de oligonucle&#xF3;tidos de ADN. Como consecuencia de la incorporaci&#xF3;n de residuos LNA en la secuencia de oligonucle&#xF3;tidos, la temperatura de fusi&#xF3;n del oligonucle&#xF3;tido aumenta considerablemente, permitiendo as&#xED; el uso con &#xE9;xito de sondas m&#xE1;s cortas LNA como alelo-espec&#xED;ficas herramientas en ensayos de genotipificaci&#xF3;n. En este art&#xED;culo, nos informe el uso de sondas que contienen residuos de LNA para el desarrollo de ensayos cualitativos m&#xFA;ltiplex fluorescentes para la detecci&#xF3;n de polimorfismos de nucle&#xF3;tido &#xFA;nico (SNPs) en tiempo real de reacci&#xF3;n en cadena de la polimerasa utilizando el ensayo de detecci&#xF3;n de 5 &#x26;#39;nucleasa. Hemos desarrollado dos aplicaciones que muestran la mayor especificidad de las sondas LNA en los ensayos de discriminaci&#xF3;n al&#xE9;lica. La primera aplicaci&#xF3;n es una de cuatro colores 5 &#x26;#39;nucleasa ensayo para la detecci&#xF3;n de SNPs para dos de los factores gen&#xE9;ticos m&#xE1;s comunes que intervienen en el riesgo de trombosis, el factor V Leiden y la protrombina G20210A. La segunda aplicaci&#xF3;n es un ensayo de dos colores para la detecci&#xF3;n espec&#xED;fica de la tranversion A-a-T en el cod&#xF3;n 6 del gen de la beta-globina, responsable de la anemia de c&#xE9;lulas falciformes. Ambos ensayos de genotipificaci&#xF3;n en tiempo real se evaluaron mediante la comparaci&#xF3;n de los resultados de nuestro m&#xE9;todo a la de un m&#xE9;todo de referencia y en ambos casos, se encontr&#xF3; una concordancia del 100%. Este enfoque ser&#xE1; &#xFA;til para la investigaci&#xF3;n y laboratorios de diagn&#xF3;stico molecular en situaciones en las que la especificidad proporcionada por sondas de oligonucle&#xF3;tidos de ADN es insuficiente para discriminar entre dos secuencias de ADN que difieren en s&#xF3;lo un nucle&#xF3;tido.

En tiempo real de Genotipado con sondas de oligonucle&#xF3;tidos que contienen &#xE1;cidos nucleicos bloqueados

&#x6211;&#x4EEC;&#x5F00;&#x53D1;&#x5B9E;&#x65F6;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x56DB;&#x8272;&#x6CD5;&#x540C;&#x65F6;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7684;&#x56E0;&#x5B50; V &#x83B1;&#x987F; &#xFF08;FVL&#xFF09; &#x548C;&#x4E00;&#x4E2A;&#x95ED;&#x7BA1;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x662F;&#x5355;&#x4E00;&#x7684;&#x51B7;&#x70ED;&#x5FAA;&#x73AF;&#x534F;&#x8BAE; (PT) &#x51DD;&#x8840;&#x9176;&#x539F; G20210A &#x7A81;&#x53D8;&#x3002;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x7ED3;&#x5408;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178; (ASO) &#x6742;&#x4EA4;&#x4F7F;&#x7528; 5&#39; &#x6838;&#x9178;&#x9176;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x683C;&#x5F0F;&#x63D0;&#x4F9B;&#x591A;&#x91CD; pcr &#x6280;&#x672F;&#x7684;&#x529B;&#x91CF;&#x3002;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4; DNA &#x662F;&#x4ECE;&#x5168;&#x8840;&#x4E0E;&#x6807;&#x51C6;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x7F16;&#x5199;&#x7684;&#x3002;97 Bp &#x7684;&#x51DD;&#x8840;&#x56E0;&#x5B50; V &#x57FA;&#x56E0;&#x7684; DNA &#x5E8F;&#x5217;&#x662F; co-amplified &#x4E0E; 111 bp &#x4F7F;&#x7528;&#x56DB;&#x4E2A; PCR &#x5F15;&#x7269;&#x7684;&#x51DD;&#x8840;&#x56E0;&#x5B50; II (PT) &#x57FA;&#x56E0;&#x7684; DNA &#x5E8F;&#x5217;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x53CD;&#x5E94;&#x5305;&#x62EC;&#x56DB;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x540C; FVL/PT G20210A &#x57FA;&#x56E0;&#x578B;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7279;&#x5F02;&#x6807;&#x8BB0;&#x9EBB;&#x751F;&#x592A;&#x90CE;&#x63A2;&#x5934;&#x3002;&#x82E5;&#x8981;&#x8BC4;&#x4F30;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x7684;&#x6027;&#x80FD;&#x7279;&#x6027;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x6267;&#x884C;&#x7684;&#x4E24;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x6BD4;&#x8F83;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5206;&#x6790;&#x4E86;&#x4ECE;&#x5DF2;&#x77E5;&#x6709;&#x4EE5;&#x524D;&#x6CCC;&#x5C3F;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x4E0E; PCR &#x7ED3;&#x5408;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x9650;&#x5236;&#x7247;&#x6BB5;&#x957F;&#x5EA6;&#x591A;&#x6001;&#x6027;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7684; FVL/PT G20210A &#x57FA;&#x56E0;&#x578B;&#x7684; 52 &#x4E2A;&#x4EBA;&#x7684; DNA &#x6837;&#x672C;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#x8FD9;&#x4E24;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x751F;&#x6210;&#x7684;&#x7ED3;&#x679C;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684; 100%&#x4E00;&#x81F4;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F97;&#x51FA;&#x7ED3;&#x8BBA;&#x56DB;&#x8272;&#x591A;&#x91CD;&#x68C0;&#x6D4B;&#x662F;&#x5177;&#x4F53;&#x548C;&#x53EF;&#x91CD;&#x73B0;&#x7684; FVL/PT G20210A &#x7A81;&#x53D8;&#xFF0C;&#x68C0;&#x6D4B;&#xFF0C;&#x5B83;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5F88;&#x597D;&#x5730;&#x9002;&#x5E94;&#x5176;&#x4ED6;&#x5355;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x591A;&#x6001;&#x6027;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x3002;

&#x56DB;&#x8272;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528; 5&#39; &#x6838;&#x9178;&#x9176;&#x6CD5;&#x540C;&#x65F6;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7684;&#x56E0;&#x5B50; V &#x83B1;&#x987F;&#x548C;&#x51DD;&#x8840;&#x9176;&#x539F; G20210A &#x7A81;&#x53D8;&#x3002;

We developed a real-time multiplex four-color assay for the simultaneous detection of the factor V Leiden (FVL) and prothrombin (PT) G20210A mutations in one closed tube using a single thermocycling protocol. The assay combines the power of multiplex PCR with the specificity provided by allele-specific oligonucleotide (ASO) hybridization using the 5' nuclease assay format. Human genomic DNA is prepared from whole blood with standard procedures. A 97-bp DNA sequence of the coagulation factor V gene is co-amplified with a 111-bp DNA sequence of the coagulation factor II (PT) gene using four PCR primers. In addition, the reactions included four differentially labeled ASO probes for the specific detection of the different FVL/PT G20210A genotypes. To evaluate the assay's performance characteristics, we performed a comparison of two methods. We analyzed DNA samples from 52 individuals with known FVL/PT G20210A genotypes that were previously genotyped with an assay that combined PCR with the use of restriction fragment length polymorphisms. We found a 100% concordance between the results generated by both methodologies. We conclude that the four-color multiplex assay is specific and reproducible for the detection of the FVL/PT G20210A mutations, and it can be easily adapted for the detection of other SNPs.

Four-color multiplex 5' nuclease assay for the simultaneous detection of the factor V Leiden and the prothrombin G20210A mutations.

Nous avons d&#xE9;velopp&#xE9; un multiplex en temps r&#xE9;el &#xE0; quatre couleurs test pour la d&#xE9;tection simultan&#xE9;e du facteur V Leiden (FVL) et la prothrombine (PT) mutations G20210A dans un tube ferm&#xE9; en utilisant un protocole de thermocyclage unique. Le test combine la puissance de PCR multiplex avec la sp&#xE9;cificit&#xE9; fournies par l&#x26;#39;all&#xE8;le oligonucl&#xE9;otide sp&#xE9;cifique (ASO) l&#x26;#39;hybridation utilisant la 5 &#x26;#39;nucl&#xE9;ase format de dosage. L&#x26;#39;ADN g&#xE9;nomique humain est pr&#xE9;par&#xE9; &#xE0; partir du sang total avec les proc&#xE9;dures standard. Une s&#xE9;quence d&#x26;#39;ADN 97 pb du g&#xE8;ne du facteur de coagulation V est co-amplifi&#xE9; avec une s&#xE9;quence d&#x26;#39;ADN 111 pb du facteur de coagulation II (PT) &#xE0; l&#x26;#39;aide du g&#xE8;ne quatre amorces de PCR. En outre, les r&#xE9;actions comprenait quatre sondes marqu&#xE9;es de fa&#xE7;on diff&#xE9;rentielle ASO pour la d&#xE9;tection sp&#xE9;cifique des diff&#xE9;rents g&#xE9;notypes G20210A FVL / PT. Pour &#xE9;valuer les caract&#xE9;ristiques de performance du dosage de, nous avons effectu&#xE9; une comparaison de deux m&#xE9;thodes. Nous avons analys&#xE9; des &#xE9;chantillons d&#x26;#39;ADN de 52 individus ayant connu g&#xE9;notypes G20210A FVL / PT qui ont &#xE9;t&#xE9; pr&#xE9;c&#xE9;demment g&#xE9;notyp&#xE9;s avec un test qui combine PCR avec l&#x26;#39;utilisation de polymorphismes des fragments de restriction. Nous avons trouv&#xE9; une concordance de 100% entre les r&#xE9;sultats g&#xE9;n&#xE9;r&#xE9;s par les deux m&#xE9;thodes. Nous concluons que le dosage multiplex de quatre couleurs est sp&#xE9;cifique et reproductible pour la d&#xE9;tection de la FVL / PT mutations G20210A, et il peut &#xEA;tre facilement adapt&#xE9; pour la d&#xE9;tection de SNP autre.

Quatre-couleur Multiplex 5 &#x26;#39;nucl&#xE9;ase test pour la d&#xE9;tection simultan&#xE9;e du facteur V Leiden et les mutations G20210A de la prothrombine

Vier-Farben-Multiplex-5&#x26;#39;-Nuklease-Assay zum simultanen Nachweis der Faktor V-Leiden und Prothrombin G20210A Mutationen.

Abbiamo sviluppato un&#39;analisi in tempo reale di quadricromia multiplex per la rilevazione simultanea del fattore V Leiden (FVL) e mutazioni G20210A protrombina (PT) in una provetta chiusa utilizzando un protocollo unico thermocycling. Il dosaggio combina la potenza di PCR multiplex con la specificit&agrave; fornita tramite l&#39;ibridazione allele-specific oligonucleotide (ASO) nel formato 5&#39; nucleasi dosaggio. DNA genomic umano &egrave; preparato da sangue intero con le procedure standard. Una sequenza di DNA 97-bp del gene V fattore della coagulazione &egrave; co-amplified con una sequenza di DNA-111-bp del gene della coagulazione fattore II (PT) con quattro iniettori PCR. Inoltre, le reazioni comprendeva quattro differenzialmente etichettate ASO sonde per la rilevazione di specifica dei diversi genotipi G20210A FVL/PT. Per valutare le caratteristiche di prestazioni del dosaggio, abbiamo effettuato un confronto dei due metodi. Abbiamo analizzato i campioni di DNA da 52 individui con genotipi FVL/PT G20210A noti che sono stati precedentemente genotipizzati con un&#39;analisi che combinati PCR con l&#39;uso di polimorfismi di restrizione frammento lunghezza. Abbiamo trovato una 100% di concordanza tra i risultati generati dalle due metodologie. Concludiamo l&#39;analisi multiplex quadricromia &egrave; specifica e riproducibile per la rilevazione delle mutazioni G20210A FVL/PT, che pu&ograve; essere facilmente adattato per la rilevazione di altri SNPs.

Quadricromia multiplex 5&#39; nucleasi test per la rilevazione simultanea del fattore V di Leiden e le mutazioni G20210A protrombina.

&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x71B1;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;1&#x3064;&#x306E;&#x9589;&#x3058;&#x305F;&#x30C1;&#x30E5;&#x30FC;&#x30D6;&#x306E;&#x7B2C;V&#x56E0;&#x5B50;&#x30E9;&#x30A4;&#x30C7;&#x30F3;&#xFF08;FVL&#xFF09;&#x3068;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30ED;&#x30F3;&#x30D3;&#x30F3;&#xFF08;PT&#xFF09;G20210A&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x540C;&#x6642;&#x691C;&#x51FA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30EA;&#x30A2;&#x30EB;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30D7;&#x30EC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;4&#x8272;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306F;&#x3001;5 &#x26;#39;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x5F62;&#x5F0F;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x5BFE;&#x7ACB;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#xFF08;ASO&#xFF09;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C0;&#x30A4;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30D7;&#x30EC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;PCR&#x306E;&#x30D1;&#x30EF;&#x30FC;&#x3092;&#x517C;&#x306D;&#x5099;&#x3048;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;DNA&#x306F;&#x3001;&#x6A19;&#x6E96;&#x7684;&#x306A;&#x624B;&#x9806;&#x3067;&#x5168;&#x8840;&#x304B;&#x3089;&#x8ABF;&#x88FD;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3002;&#x51DD;&#x56FA;&#x7B2C;V&#x56E0;&#x5B50;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;97-bp&#x306E;DNA&#x914D;&#x5217;&#x306F;&#x3001;4&#x3064;&#x306E;PCR&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x51DD;&#x56FA;&#x56E0;&#x5B50;II&#xFF08;PT&#xFF09;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;111-bp&#x306E;DNA&#x914D;&#x5217;&#x3068;&#x5171;&#x5897;&#x5E45;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x52A0;&#x3048;&#x3066;&#x3001;&#x53CD;&#x5FDC;&#x304C;&#x7570;&#x306A;&#x308B;FVL / PT G20210A&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x578B;&#x306E;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x691C;&#x51FA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;4&#x3064;&#x306E;&#x5DEE;&#x52D5;&#x30E9;&#x30D9;&#x30EB;ASO&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x30D1;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30DE;&#x30F3;&#x30B9;&#x7279;&#x6027;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;2&#x3064;&#x200B;&#x200B;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306E;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3092;&#x884C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x4EE5;&#x524D;&#x3001;&#x5236;&#x9650;&#x65AD;&#x7247;&#x9577;&#x591A;&#x578B;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;PCR&#x3092;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x305F;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x578B;&#x3092;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x77E5;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;FVL / PT G20210A&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x578B;&#x306E;52&#x500B;&#x4F53;&#x304B;&#x3089;DNA&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x3092;&#x5206;&#x6790;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x624B;&#x6CD5;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x751F;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7D50;&#x679C;&#x306E;&#x9593;&#x306B;100&#xFF05;&#x306E;&#x4E00;&#x81F4;&#x3092;&#x898B;&#x3064;&#x3051;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;4&#x3064;&#x306E;&#x8272;&#x306E;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30D7;&#x30EC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306F;&#x3001;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x304B;&#x3064;FVL / PT G20210A&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x691C;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x518D;&#x73FE;&#x53EF;&#x80FD;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3068;&#x7D50;&#x8AD6;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x306F;&#x7C21;&#x5358;&#x306B;&#x4ED6;&#x306E;SNP&#x3092;&#x691C;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x9069;&#x5408;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x7B2C;V&#x56E0;&#x5B50;&#x30E9;&#x30A4;&#x30C7;&#x30F3;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30ED;&#x30F3;&#x30D3;&#x30F3;G20210A&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x540C;&#x6642;&#x691C;&#x51FA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;4&#x3064;&#x306E;&#x8272;&#x306E;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30D7;&#x30EC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;5 &#x26;#39;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;

&#xC6B0;&#xB9AC; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xC694;&#xC18C; &#xBE0C; &#xB808;&#xC774; &#xB4E0; (FVL)&#xC758; &#xB3D9;&#xC2DC; &#xAC80;&#xCD9C;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04; &#xBA40;&#xD2F0; &#xD50C;&#xB809;&#xC2A4; 4 &#xC0C9; &#xC2DC;&#xD5D8; &#xBC0F; &#xB2E8;&#xC77C; thermocycling &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xD558;&#xB098;&#xC758; &#xB2EB;&#xD78C;&#xB41C; &#xD29C;&#xBE0C;&#xC5D0; &#xD504;&#xB85C;&#xD2B8; (PT) G20210A &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;. &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; 5&#39; nuclease mrna&#xAC00; &#xAC80;&#xCD9C; &#xB410;&#xB2E4; &#xD615;&#xC2DD;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB300;&#xB9BD; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xD2B9;&#xC815; oligonucleotide (&#xC544;&#xC18C;) &#xAD50; &#xC7A1;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xB294; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC73C;&#xB85C; &#xBA40;&#xD2F0;&#xD50C;&#xB809;&#xC2A4; PCR&#xC758; &#xD30C;&#xC6CC;&#xB97C; &#xACB0;&#xD569; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xAC8C;&#xB188; DNA&#xB294; &#xD45C;&#xC900; &#xC808;&#xCC28;&#xC640; &#xC804;&#xCCB4; &#xD608;&#xC561;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC900;&#xBE44;&#xAC00; &#xB418;&#xC5B4; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC751;&#xACE0; &#xC778;&#xC790; V &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; 97-bp DNA &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xB294; 111 bp DNA &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; 4 PCR &#xB1CC;&#xAD00;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC751;&#xACE0; &#xC778;&#xC790; II (PT) &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; co-amplified. &#xB610;&#xD55C;, &#xBC18;&#xC751; &#xB2E4;&#xB978; FVL/PT G20210A genotypes &#xD2B9;&#xC815; &#xAC80;&#xC0C9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; 4 &#xAC1C;&#xC758; &#xCC28;&#xB3D9; &#xB808;&#xC774;&#xBE14;&#xC774; &#xC788;&#xB294; &#xC544;&#xC18C; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C; &#xD3EC;&#xD568;. &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC131;&#xB2A5; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD558; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xBC29;&#xBC95; &#xBE44;&#xAD50;&#xB97C; &#xC218;&#xD589; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xC81C;&#xD55C; &#xC870;&#xAC01; &#xAE38;&#xC774; polymorphisms &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; PCR&#xC744; &#xACB0;&#xD569; &#xD558;&#xB294; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC;&#xC640; genotyped &#xD588;&#xB2E4; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4;&#xB41C; FVL/PT G20210A genotypes &#xAC00;&#xC9C4; 52 &#xAC1C;&#xC778;&#xC5D0;&#xC11C; DNA &#xC0D8;&#xD50C;&#xC744; &#xBD84;&#xC11D; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB450; &#xBC29;&#xBC95;&#xB860;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC0DD;&#xC131; &#xB418;&#xB294; &#xACB0;&#xACFC; &#xC0AC;&#xC774; 100% &#xC77C;&#xCE58;&#xB97C; &#xCC3E;&#xC558;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xACB0;&#xB860; 4 &#xC0C9; &#xBA40;&#xD2F0; &#xD50C;&#xB809;&#xC2A4; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xAD6C;&#xCCB4;&#xC801;&#xC774; &#xACE0; &#xC7AC;&#xD604; FVL/PT G20210A &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xAC80;&#xCD9C;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xB2E4;&#xB978; Snp&#xC758; &#xBC1C;&#xACAC;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xC27D;&#xAC8C; &#xC801;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

4 &#xC0C9; &#xBA40;&#xD2F0; &#xD50C;&#xB809;&#xC2A4; 5&#39; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; nuclease &#xC694;&#xC18C; &#xBE0C; &#xB808;&#xC774; &#xB4E0;&#xC758; &#xB3D9;&#xC2DC; &#xAC80;&#xCD9C; &#xBC0F; &#xD504;&#xB85C;&#xD2B8; G20210A &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;.

Hemos desarrollado un m&#xFA;ltiplex en tiempo real de cuatro colores de ensayo para la detecci&#xF3;n simult&#xE1;nea del factor V Leiden (FVL) y protrombina (TP) mutaciones G20210A en un tubo cerrado mediante un protocolo de termociclado sola. El ensayo combina la potencia de PCR m&#xFA;ltiple con la especificidad proporcionada por alelo-espec&#xED;ficas de oligonucle&#xF3;tidos (ASO) hibridaci&#xF3;n utilizando el 5 &#x26;#39;formato de ensayo nucleasa. ADN gen&#xF3;mico humano se prepara a partir de sangre entera con procedimientos est&#xE1;ndar. Una secuencia de DNA 97-pb del gen del factor de coagulaci&#xF3;n V se co-amplificaci&#xF3;n con una secuencia de DNA 111-bp del factor de coagulaci&#xF3;n II (PT) de genes utilizando cuatro cebadores de PCR. Adem&#xE1;s, las reacciones incluye cuatro sondas marcadas diferencialmente ASO para la detecci&#xF3;n espec&#xED;fica de las diferentes FVL / PT G20210A genotipos. Para evaluar las caracter&#xED;sticas del ensayo de rendimiento, se realiz&#xF3; una comparaci&#xF3;n de dos m&#xE9;todos. Se analizaron muestras de ADN de 52 individuos con conocidos FVL / PT G20210A genotipos que se genotipo previamente con un ensayo de PCR que combinado con el uso de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricci&#xF3;n. Encontramos un 100% de concordancia entre los resultados obtenidos por ambas metodolog&#xED;as. Se concluye que el ensayo m&#xFA;ltiple de cuatro colores es espec&#xED;fico y reproducible para la detecci&#xF3;n de la FVL / mutaciones PT G20210A, y puede ser f&#xE1;cilmente adaptado para la detecci&#xF3;n de otros SNP.

Cuatro colores Multiplex 5 &#x26;#39;nucleasa ensayo para la detecci&#xF3;n simult&#xE1;nea del factor V Leiden y la protrombina G20210A de las mutaciones

&#x591A;&#x91CD;&#x8367;&#x5149;&#x5FAE;&#x73E0;&#x8BFB;&#x51FA;&#x6D4B;&#x5B9A;&#xFF1A; &#x7A81;&#x53D8;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7684;&#x6709;&#x529B;&#x5DE5;&#x5177;&#x3002;

Multiplex assays with fluorescent microbead readout: a powerful tool for mutation detection.

Essais multiplex avec Lecture microbille fluorescente: un outil puissant pour la d&#xE9;tection de mutations

Multiplex-Assays mit fluoreszierenden Mikrok&#xFC;gelchen Auslesung: ein m&#xE4;chtiges Werkzeug zur Detektion von Mutationen.

Multiplex dosaggi con lettura Microperlina fluorescente: un potente strumento per la rilevazione di mutazione.

&#x86CD;&#x5149;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30D3;&#x30FC;&#x30BA;&#x8AAD;&#x307F;&#x51FA;&#x3057;&#x3068;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30D7;&#x30EC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#xFF1A;&#x5909;&#x7570;&#x691C;&#x51FA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x5F37;&#x529B;&#x306A;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;

&#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xD615;&#xAD11; microbead &#xD310;&#xB3C5;&#xC73C;&#xB85C; &#xB2E4;&#xC911;&#xD654;: &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xAC80;&#xCD9C;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xB3C4;&#xAD6C;.

Los ensayos multiplex con microesferas fluorescentes Lectura: Una potente herramienta para la detecci&#xF3;n de mutaciones

&#x5B9A;&#x91CF;&#x9006;&#x8F6C;&#x5F55;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x94FE;&#x53CD;&#x5E94; (qRT PCR) &#x8FDB;&#x884C;&#x5B9E;&#x65F6;&#x662F;&#x6D4B;&#x91CF;&#x751F;&#x7269;&#x6837;&#x54C1;&#x4E2D;&#x7684;&#x4FE1;&#x4F7F;&#x6838;&#x7CD6;&#x6838;&#x9178; (mRNA) &#x6C34;&#x5E73;&#x7684;&#x6709;&#x529B;&#x5DE5;&#x5177;&#x3002;&#x591A;&#x91CD; pcr &#x65B9;&#x6CD5;&#x88AB;&#x5B9A;&#x4E49;&#x4E3A;&#x5355;&#x4E2A;&#x53CD;&#x5E94;&#x91DC;&#x4E2D;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x6216;&#x591A;&#x4E2A; DNA (cDNA) &#x76EE;&#x6807;&#x7684;&#x540C;&#x65F6;&#x653E;&#x5927;&#x548C;&#x53EF;&#x80FD;&#x4EC5;&#x4E3A;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x76EE;&#x6807;&#x4F7F;&#x7528;&#x552F;&#x4E00;&#x6807;&#x8BB0;&#x7684;&#x63A2;&#x9488;&#x8FDB;&#x884C;&#x3002;&#x6700;&#x591A;&#x56DB;&#x4E2A;&#x57FA;&#x56E0;&#x53EF;&#x4EE5;&#x68C0;&#x6D4B;&#x5728;&#x591A;&#x91CD; 5&#39; &#x6838;&#x9178;&#x9176;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x65F6;&#x4F7F;&#x7528;&#x9002;&#x5F53;&#x7684;&#x5DE5;&#x5177;&#x548C;&#x6B63;&#x786E;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x7EC4;&#x5408;&#x3002;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x7684;&#x66F4;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x4F18;&#x52BF;&#x4E4B;&#x4E00;&#x5C31;&#x662F;&#x51CF;&#x5C11;&#x7684;&#x6837;&#x672C;&#x7684;&#x8981;&#x6C42;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E00;&#x70B9;&#x5C24;&#x5176;&#x91CD;&#x8981;&#xFF0C;&#x6837;&#x54C1;&#x6750;&#x6599;&#x4E0D;&#x8DB3;&#x65F6;&#x3002;&#x989D;&#x5916;&#x7684;&#x597D;&#x5904;&#x8282;&#x7701;&#x65F6;&#x95F4;&#xFF0C;&#x53CD;&#x5E94;&#x5B89;&#x88C5;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x548C;&#x66F4;&#x4F4E;&#x7684;&#x6210;&#x672C;&#x76F8;&#x6BD4;&#xFF0C;singleplex &#x7684;&#x53CD;&#x5E94;&#x3002;&#x867D;&#x7136;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x6280;&#x672F;&#x76F8;&#x6BD4;&#x5177;&#x6709;&#x4E00;&#x4E9B;&#x4F18;&#x52BF; singleplex qRT PCR&#xFF0C;&#x6709;&#x9650;&#x7684;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x81F3;&#x4ECA;&#x5DF2;&#x663E;&#x793A;&#x5176;&#x53EF;&#x884C;&#x6027;&#x3002;&#x5DF2;&#x62A5;&#x544A;&#x4E86;&#x5173;&#x4E8E;&#x56DB;&#x8272; qRT PCR &#x51E0;&#x4E2A;&#x51FA;&#x7248;&#x7269;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5411;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x77E5;&#x8BC6;&#x6CA1;&#x6709;&#x5DF2;&#x7ECF;&#x5F00;&#x5C55;&#x5DE5;&#x4F5C;&#xFF0C;&#x63A2;&#x8BA8;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x9650;&#x5236;&#x3002;&#x5728;&#x672C;&#x6587;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x56DB;&#x57FA;&#x56E0; qRT-PCR &#x7684;&#x7B2C;&#x4E00;&#x6B21;&#x6DF1;&#x5165;&#x5206;&#x6790;&#x3002;&#x4E3A;&#x4E86;&#x8FBE;&#x5230;&#x66F4;&#x597D;&#x5730;&#x4E86;&#x89E3;&#x6F5C;&#x5728; qRT pcr &#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x5C40;&#x9650;&#x6027;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x4F7F;&#x7528;&#x6765;&#x81EA;&#x56DB;&#x4E2A;&#x4EBA;&#x4F53;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x4F53;&#x5916;&#x8F6C;&#x5F55;&#x7684; RNA&#x3002;&#x4E3A;&#x4E86;&#x6A21;&#x62DF;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x5B9E;&#x9A8C;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F00;&#x53D1;&#x4F53;&#x5916;&#x8F6C;&#x5F55;&#x4E86;&#x5C16;&#x523A;&#x4E0E;&#x690D;&#x7269;&#x603B; RNA &#x7684;&#x6A21;&#x578B;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x6A21;&#x5F0F;&#x4F7F;&#x6211;&#x4EEC;&#x80FD;&#x591F;&#x53D1;&#x5C55;&#x76F8;&#x8FD1;&#x53D8;&#x8FBE; 100 &#x4E07;&#x500D;&#x7684;&#x5DEE;&#x5F02;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x6C34;&#x5E73;&#x7684;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x786E;&#x5B9A;&#x4E86;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5355;&#x4E00;&#x7684;&quot;&#x666E;&#x904D;&#x7684;&quot;&#x53CD;&#x5E94;&#x6761;&#x4EF6;&#xFF0C;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x7684;&#x6A21;&#x677F;&#x6D53;&#x5EA6;&#x542F;&#x7528;&#x6700;&#x591A;&#x56DB;&#x4E2A;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x5B9E;&#x65F6;&#x4F18;&#x5316;&#x653E;&#x5927;&#x3002;&#x8FD9;&#x9879;&#x7814;&#x7A76;&#x8868;&#x660E;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x6280;&#x672F;&#x662F;&#x53EF;&#x884C;&#x7684;&#x529E;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x9002;&#x7528;&#x4E8E;&#x5927;&#x591A;&#x6570; qRT pcr &#x603B; RNA&#xFF0C;&#x72EC;&#x7ACB;&#x5BA1;&#x67E5;&#x6839;&#x636E;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x6C34;&#x5E73;&#x4E0E;&#x6267;&#x884C;&#x3002;

&#x56DB;&#x8272;&#x591A;&#x91CD;&#x9006;&#x8F6C;&#x5F55;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x94FE;&#x53CD;&#x5E94; &mdash; &mdash; &#x514B;&#x670D;&#x5176;&#x5C40;&#x9650;&#x6027;&#x3002;

Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) conducted in real time is a powerful tool for measuring messenger RNA (mRNA) levels in biological samples. Multiplex PCR is defined as the simultaneous amplification of two or more DNA (cDNA) targets in a single reaction vessel and may be carried out only using uniquely labeled probes for each target. Up to four genes can be detected in a multiplex 5' nuclease assay when using the appropriate instrument and the right combination of fluorophores. One of the more important advantages of multiplexing is a reduced sample requirement, which is especially important when sample material is scarce. Additional benefits are saving time on reaction setup and lower cost compared to singleplex reactions. Although multiplexing has several advantages over singleplex qRT-PCR, limited work has been done to show its feasibility. Few publications on four-color multiplex qRT-PCR have been reported, and to our knowledge no work has been done to explore the assay's limitations. In this paper, we report the first in-depth analysis of a four-gene multiplex qRT-PCR. To achieve a better understanding of the potential limitations of the qRT-PCR assay, we used in vitro transcribed RNA derived from four human genes. To emulate gene expression experiments, we developed a model system in which the in vitro transcripts were spiked with plant total RNA. This model allowed us to develop an artificial system closely resembling differential gene expression levels varying up to a million fold. We identified a single "universal" reaction condition that enabled optimal amplification in real time of up to four genes over a wide range of template concentrations. This study shows that multiplexing is a feasible approach applicable to most qRT-PCR assays performed with total RNA, independent of the expression levels of the genes under scrutiny.

Four-color multiplex reverse transcription polymerase chain reaction--overcoming its limitations.

Quantitative de transcription inverse en cha&#xEE;ne par polym&#xE9;rase (qRT-PCR) r&#xE9;alis&#xE9;e en temps r&#xE9;el est un outil puissant pour mesurer l&#x26;#39;ARN messager (ARNm) des niveaux dans des &#xE9;chantillons biologiques. PCR multiplex est d&#xE9;fini comme l&#x26;#39;amplification simultan&#xE9;e de deux ou plus d&#x26;#39;ADN (ADNc) des cibles dans un seul r&#xE9;cipient de r&#xE9;action et peut &#xEA;tre effectu&#xE9;e uniquement au moyen de sondes marqu&#xE9;es de mani&#xE8;re unique pour chaque cible. Jusqu&#x26;#39;&#xE0; quatre g&#xE8;nes peuvent &#xEA;tre d&#xE9;tect&#xE9;s dans un 5 multiplex &#xAB;test nucl&#xE9;ase lors de l&#x26;#39;utilisation de l&#x26;#39;instrument appropri&#xE9; et la bonne combinaison de fluorophores. Un des avantages les plus importants de multiplexage est une exigence r&#xE9;duite de l&#x26;#39;&#xE9;chantillon, qui est particuli&#xE8;rement important lorsque le mat&#xE9;riau de l&#x26;#39;&#xE9;chantillon est rare. Des avantages suppl&#xE9;mentaires sont un gain de temps sur la configuration de r&#xE9;action et &#xE0; moindre co&#xFB;t par rapport aux r&#xE9;actions singleplex. Bien que le multiplexage a plusieurs avantages par rapport singleplex qRT-PCR, de travail limit&#xE9;e qui a &#xE9;t&#xE9; fait pour montrer sa faisabilit&#xE9;. Peu de publications sur quatre couleurs qRT-PCR multiplex ont &#xE9;t&#xE9; signal&#xE9;s, et &#xE0; notre connaissance aucun travail n&#x26;#39;a &#xE9;t&#xE9; fait pour explorer les limites de l&#x26;#39;essai de. Dans cet article, nous rapportons le premier analyse en profondeur d&#x26;#39;un multiplex de quatre g&#xE8;nes qRT-PCR. Pour parvenir &#xE0; une meilleure compr&#xE9;hension des limites potentielles de l&#x26;#39;essai qRT-PCR, nous avons utilis&#xE9; dans l&#x26;#39;ARN transcrit in vitro provenant de quatre g&#xE8;nes humains. Pour &#xE9;muler les exp&#xE9;riences d&#x26;#39;expression des g&#xE8;nes, nous avons d&#xE9;velopp&#xE9; un syst&#xE8;me mod&#xE8;le dans lequel l&#x26;#39;transcrits in vitro ont &#xE9;t&#xE9; dop&#xE9;s avec de l&#x26;#39;ARN totaux de l&#x26;#39;usine. Ce mod&#xE8;le nous a permis de mettre au point un syst&#xE8;me artificiel ressemblant &#xE9;troitement &#xE0; des niveaux diff&#xE9;rents d&#x26;#39;expression de g&#xE8;nes variant jusqu&#x26;#39;&#xE0; un million de fois. Nous avons identifi&#xE9; une seule condition &#x26;quot;universelle&#x26;quot; qui a permis &#xE0; la r&#xE9;action d&#x26;#39;amplification optimale en temps r&#xE9;el d&#x26;#39;un maximum de quatre g&#xE8;nes sur une large gamme de concentrations de la matrice. Cette &#xE9;tude montre que le multiplexage est une approche r&#xE9;alisable applicable &#xE0; la plupart des qRT-PCR r&#xE9;alis&#xE9;es avec l&#x26;#39;ARN total, ind&#xE9;pendamment des niveaux d&#x26;#39;expression des g&#xE8;nes sous la loupe.

Quatre-couleur Reverse Transcription Multiplex en cha&#xEE;ne par polym&#xE9;rase - surmonter ses limitations

Vier-Farben-Multiplex Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion - die &#xDC;berwindung seiner Grenzen.

Trascrizione d&#39;inversione quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) condotta in tempo reale &egrave; un potente strumento per la misurazione dei livelli di RNA messaggero (mRNA) in campioni biologici. Multiplex PCR &egrave; definito come l&#39;amplificazione simultanea di due o pi&ugrave; destinazioni di DNA (cDNA) in un recipiente di reazione singola e pu&ograve; essere effettuata solo utilizzando sonde etichettate in modo univoco per ogni destinazione. Fino a quattro geni possono essere rilevati in un multiplex 5&#39; nucleasi dosaggio quando si utilizza lo strumento adatto e la giusta combinazione di fluorofori. Uno dei vantaggi pi&ugrave; importanti di multiplexing &egrave; un requisito del campione ridotto, che &egrave; particolarmente importante quando il materiale campione scarseggia. Ulteriori vantaggi sono risparmio di tempo sull&#39;installazione di reazione e un costo inferiore rispetto alle reazioni di singleplex. Sebbene multiplexing presenta parecchi vantaggi sopra singleplex qRT-PCR, limitato lavoro &egrave; stato fatto per dimostrare la fattibilit&agrave;. Sono state segnalate alcune pubblicazioni su quadricromia qRT-PCR multiplex, e a nostra conoscenza, nessun lavoro &egrave; stato fatto per esplorare i limiti del dosaggio. In questa carta, segnaliamo la prima analisi approfondita di quattro-gene qRT-PCR multiplex. Per ottenere una migliore comprensione dei potenziali limiti del dosaggio qRT-PCR, abbiamo utilizzato in vitro RNA trascritto derivato da quattro geni umani. Per emulare gli esperimenti di espressione genica, abbiamo sviluppato un sistema di modello in cui le trascrizioni in vitro sono stata diluite con RNA totale impianto. Questo modello ci ha permesso di sviluppare un sistema artificiale molto somiglianti a livelli di espressione genica differenziale variabile piega fino a 1 milione. Abbiamo identificato una condizione singola reazione &quot;universale&quot; che ha permesso di amplificazione ottimale in tempo reale dei quattro geni sopra una vasta gamma di concentrazioni di modello. Questo studio dimostra che la multiplazione &egrave; un approccio fattibile applicabile alla maggior parte dei dosaggi di qRT-PCR eseguite con RNA totale, indipendente dei livelli di espressione dei geni sotto esame.

Quadricromia trascrizione d&#39;inversione multiplex PCR - superare i suoi limiti.

&#x30EA;&#x30A2;&#x30EB;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x3067;&#x884C;&#x308F;&#x308C;&#x3001;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x9006;&#x8EE2;&#x5199;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x9023;&#x9396;&#x53CD;&#x5FDC;&#xFF08;&#x5B9A;&#x91CF;RT-PCR&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x30E1;&#x30C3;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B8;&#x30E3;&#x30FC;RNA&#xFF08;mRNA&#xFF09;&#x306E;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x7684;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x4E2D;&#x306E;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3092;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x5F37;&#x529B;&#x306A;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30D7;&#x30EC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;PCR&#x306F;&#x3001;2&#x3064;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x305D;&#x308C;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x306E;DNA&#xFF08;cDNA&#xFF09;&#x3092;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x53CD;&#x5FDC;&#x5BB9;&#x5668;&#x5185;&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x540C;&#x6642;&#x5897;&#x5E45;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3060;&#x3051;&#x3067;&#x3001;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3054;&#x3068;&#x306B;&#x4E00;&#x610F;&#x306B;&#x6A19;&#x8B58;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x884C;&#x3046;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3002;&#x9069;&#x5207;&#x306A;&#x6A5F;&#x5668;&#x3068;&#x86CD;&#x5149;&#x4F53;&#x306E;&#x9069;&#x5207;&#x306A;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x5834;&#x5408;&#x306F;&#x3001;&#x6700;&#x5927;4&#x3064;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306B;&#x306F;&#x591A;&#x91CD;&#x5316;5 &#x26;#39;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3067;&#x691C;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x591A;&#x91CD;&#x5316;&#x306E;&#x3088;&#x308A;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x5229;&#x70B9;&#x306E;&#x4E00;&#x3064;&#x306F;&#x3001;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x6750;&#x6599;&#x304C;&#x4E0D;&#x8DB3;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x5834;&#x5408;&#x306B;&#x7279;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x7E2E;&#x5C0F;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x306E;&#x8981;&#x4EF6;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x305D;&#x306E;&#x4ED6;&#x306E;&#x5229;&#x70B9;&#x306F;singleplex&#x53CD;&#x5FDC;&#x306B;&#x6BD4;&#x3079;&#x3066;&#x53CD;&#x5FDC;&#x306E;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x30A2;&#x30C3;&#x30D7;&#x3068;&#x4F4E;&#x30B3;&#x30B9;&#x30C8;&#x3067;&#x6642;&#x9593;&#x3092;&#x7BC0;&#x7D04;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x591A;&#x91CD;&#x5316;&#x304C;singleplex&#x5B9A;&#x91CF;RT-PCR&#x306B;&#x6BD4;&#x3079;&#x3066;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x5229;&#x70B9;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x9650;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x4F5C;&#x696D;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5B9F;&#x73FE;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x884C;&#x308F;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002; 4&#x8272;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30D7;&#x30EC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x5B9A;&#x91CF;RT-PCR&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x520A;&#x884C;&#x7269;&#x304C;&#x5831;&#x544A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x304A;&#x308A;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x77E5;&#x8B58;&#x306B;&#x4F55;&#x306E;&#x4F5C;&#x696D;&#x306F;&#x3001;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x9650;&#x754C;&#x3092;&#x63A2;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x884C;&#x308F;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x672C;&#x7A3F;&#x3067;&#x306F;&#x3001;4&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30D7;&#x30EC;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x5B9A;&#x91CF;RT-PCR&#x306E;&#x6700;&#x521D;&#x306E;&#x8A73;&#x7D30;&#x306A;&#x5206;&#x6790;&#x3092;&#x5831;&#x200B;&#x200B;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5B9A;&#x91CF;RT-PCR&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x9650;&#x754C;&#x306E;&#x3088;&#x308A;&#x826F;&#x3044;&#x7406;&#x89E3;&#x3092;&#x9054;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;4&#x3064;&#x306E;&#x30D2;&#x30C8;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x7531;&#x6765;&#x306E;in vitro&#x8EE2;&#x5199;RNA&#x3067;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x5B9F;&#x9A13;&#x3092;&#x30A8;&#x30DF;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;in vitro&#x8EE2;&#x5199;&#x7523;&#x7269;&#x690D;&#x7269;&#x306E;&#x30C8;&#x30FC;&#x30BF;&#x30EB;RNA&#x3092;&#x30B9;&#x30D1;&#x30A4;&#x30AF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x304C;&#x5BC6;&#x63A5;&#x306B;&#x767E;&#x4E07;&#x500D;&#x307E;&#x3067;&#x3001;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x5DEE;&#x52D5;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x306B;&#x4F3C;&#x305F;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x7684;&#x306A;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30C6;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x306E;&#x5E83;&#x3044;&#x7BC4;&#x56F2;&#x306E;4&#x3064;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x307E;&#x3067;&#x306E;&#x30EA;&#x30A2;&#x30EB;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x3067;&#x306E;&#x6700;&#x9069;&#x306A;&#x5897;&#x5E45;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3057;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E; &#x26;quot;&#x30E6;&#x30CB;&#x30D0;&#x30FC;&#x30B5;&#x30EB;&#x26;quot;&#x306A;&#x53CD;&#x5FDC;&#x6761;&#x4EF6;&#x3092;&#x540C;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x591A;&#x91CD;&#x5316;&#x306F;&#x3001;&#x7CBE;&#x67FB;&#x306E;&#x4E0B;&#x3067;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x306E;&#x72EC;&#x7ACB;&#x3057;&#x305F;&#x30C8;&#x30FC;&#x30BF;&#x30EB;RNA&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x5B9F;&#x884C;&#x3067;&#x6700;&#x3082;&#x5B9A;&#x91CF;RT-PCR&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306B;&#x9069;&#x7528;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

&#x56DB;&#x8272;&#x591A;&#x91CD;&#x9006;&#x8EE2;&#x5199;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x9023;&#x9396;&#x53CD;&#x5FDC; - &#x305D;&#x306E;&#x5236;&#x7D04;&#x3092;&#x514B;&#x670D;&#x3059;&#x308B;

&#xC591;&#xC774; &#xB9CE;&#xC740; &#xBC18;&#xC804; &#xB179;&#xC74C; &#xBC29;&#xC1A1; &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC5F0;&#xC1C4; &#xBC18;&#xC751; (qRT PCR) &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04;&#xC73C;&#xB85C; &#xC2E4;&#xC2DC; &#xC0DD;&#xBB3C;&#xD559; &#xACAC;&#xBCF8;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xBA54;&#xC2E0;&#xC800; RNA (mRNA) &#xB808;&#xBCA8;&#xC744; &#xCE21;&#xC815; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBA40;&#xD2F0;&#xD50C;&#xB809;&#xC2A4; PCR &#xB2E8;&#xC77C; &#xBC18;&#xC751; &#xC6A9;&#xAE30;&#xC5D0; &#xB450; &#xAC1C; &#xC774;&#xC0C1;&#xC758; DNA (cDNA) &#xB300;&#xC0C1;&#xC758; &#xB3D9;&#xC2DC; &#xD655;&#xB300;&#xB85C; &#xC815;&#xC758; &#xD558; &#xACE0;&#xB9CC; &#xC720;&#xC77C; &#xD558; &#xAC8C; &#xB808;&#xC774;&#xBE14;&#xC774; &#xC9C0;&#xC815; &#xB41C; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xAC01; &#xB300;&#xC0C1;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBC16;&#xC73C;&#xB85C; &#xC6B4;&#xBC18;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. 4 &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xAE4C;&#xC9C0; &#xAC10;&#xC9C0;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBA40;&#xD2F0; &#xD50C;&#xB809;&#xC2A4; 5&#39; nuclease &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC;&#xC5D0; &#xC801;&#xC808; &#xD55C; &#xC545;&#xAE30;&#xC640; fluorophores&#xC758; &#xC801;&#xC808; &#xD55C; &#xC870;&#xD569;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xACBD;&#xC6B0;. &#xB2E4;&#xC911;&#xD654;&#xC758; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC774;&#xC810;&#xC758; &#xD55C; &#xAC1C;&#xC740; &#xC0D8;&#xD50C; &#xC790;&#xB8CC;&#xAC00; &#xBD80;&#xC871; &#xD55C; &#xACBD;&#xC6B0; &#xD2B9;&#xD788; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xAC10;&#xC18C; &#xC0D8;&#xD50C; &#xC694;&#xAD6C;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xCD94;&#xAC00; &#xD61C;&#xD0DD; &#xBC18;&#xC751; &#xC124;&#xCE58; &#xBC0F; singleplex &#xBC18;&#xC751;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xC800;&#xB834; &#xD55C; &#xBE44;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xC2DC;&#xAC04;&#xC744; &#xC808;&#xC57D; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBA40;&#xD2F0;&#xD50C;&#xB809;&#xC2F1; singleplex qRT PCR &#xC5EC;&#xB7EC; &#xC774;&#xC810;&#xC774; &#xC788;&#xB2E4;, &#xBE44;&#xB85D; &#xC81C;&#xD55C; &#xB41C; &#xC791;&#xC5C5;&#xC758; &#xD0C0;&#xB2F9;&#xC131;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC644;&#xB8CC; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. 4 &#xC0C9; &#xBA40;&#xD2F0; &#xD50C;&#xB809;&#xC2A4; qRT PCR&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBA87; &#xAC00;&#xC9C0; &#xCD9C;&#xD310;&#xBB3C; &#xBCF4;&#xACE0;&#xAC00; &#xACE0; &#xC9C0;&#xC2DD; &#xC77C; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xD55C;&#xACC4;&#xB97C; &#xD0D0;&#xD5D8; &#xC644;&#xB8CC; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xB17C;&#xBB38;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC; 4 &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBA40;&#xD2F0;&#xD50C;&#xB809;&#xC2A4; qRT-PCR&#xC758; &#xCCAB; &#xBC88;&#xC9F8; &#xC2EC;&#xCE35; &#xBD84;&#xC11D; &#xBCF4;&#xACE0;. QRT PCR &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC;&#xC758; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xD55C;&#xACC4;&#xC758; &#xB354; &#xB098;&#xC740; &#xC774;&#xD574;&#xB97C; &#xB2EC;&#xC131; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; 4 &#xAC1C;&#xC758; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD30C;&#xC0DD; &#xB41C; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCA0;&#xB080;&#xB41C; RNA&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC9C4; &#xC2DD; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC744; &#xD749;&#xB0B4; &#xB0B8;, &#xCCB4; &#xC678; &#xC131;&#xC801; &#xC99D;&#xBA85;&#xC11C; &#xACF5;&#xC7A5; &#xCD1D; RNA&#xC640; &#xD568;&#xAED8; &#xC544;&#xAD70; &#xD588;&#xB2E4; &#xBAA8;&#xB378; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xAC1C;&#xBC1C;. &#xC774; &#xBAA8;&#xB378;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xBA74; &#xBC00;&#xC811; &#xD558; &#xAC8C; &#xB2EE;&#xC740; &#xCC28;&#xB3D9; &#xC9C4; &#xC2DD; &#xC218;&#xC900; &#xCD5C;&#xB300; 100&#xB9CC; &#xBC30; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC778;&#xACF5; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC744; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD15C;&#xD50C;&#xB9BF; &#xB18D;&#xB3C4;&#xC758; &#xB113;&#xC740; &#xBC94;&#xC704;&#xC5D0; &#xAC78;&#xCCD0; &#xCD5C;&#xB300; 4 &#xAC1C;&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04;&#xC73C;&#xB85C; &#xCD5C;&#xC801;&#xC758; &#xC99D;&#xD3ED;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xD558;&#xB098;&#xC758; &quot;&#xBC94;&#xC6A9;&quot; &#xBC18;&#xC751; &#xC870;&#xAC74;&#xC744; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB294; &#xBA40;&#xD2F0;&#xD50C;&#xB809;&#xC2F1; &#xCD1D; RNA, &#xAC10;&#xC2DC; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xD45C;&#xD604; &#xC218;&#xC900;&#xC5D0; &#xAD00;&#xACC4; &#xC5C6;&#xC774; &#xC218;&#xD589; &#xD558;&#xB294; &#xB300;&#xBD80;&#xBD84;&#xC758; qRT PCR &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0; &#xC801;&#xC6A9; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC900;&#xB2E4;.

4 &#xC0C9; &#xBA40;&#xD2F0; &#xD50C;&#xB809;&#xC2A4; &#xBC18;&#xC804; &#xC804;&#xC0AC; &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC5F0;&#xC1C4; &#xBC18;&#xC751;-&#xADF8; &#xD55C;&#xACC4;&#xB97C; &#xADF9;&#xBCF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

La transcripci&#xF3;n reversa cuantitativa reacci&#xF3;n en cadena de la polimerasa (QRT-PCR) llev&#xF3; a cabo en tiempo real es una potente herramienta para medir el ARN mensajero (ARNm) los niveles en muestras biol&#xF3;gicas. Multiplex PCR se define como la amplificaci&#xF3;n simult&#xE1;nea de dos o m&#xE1;s de ADN (ADNc) se centra en un &#xFA;nico recipiente de reacci&#xF3;n y puede ser llevado a cabo solamente utilizando sondas marcadas &#xFA;nica para cada destino. Hasta cuatro genes pueden ser detectados en un 5 m&#xFA;ltiplex &#x26;#39;ensayo nucleasa cuando se utiliza el instrumento adecuado y la correcta combinaci&#xF3;n de fluor&#xF3;foros. Una de las ventajas m&#xE1;s importantes de multiplexaci&#xF3;n es un requisito muestra reducida, lo cual es especialmente importante cuando el material de la muestra es escasa. Los beneficios adicionales se ahorra tiempo en la configuraci&#xF3;n de la reacci&#xF3;n y el menor costo en comparaci&#xF3;n con las reacciones singleplex. A pesar de multiplexaci&#xF3;n tiene varias ventajas sobre singleplex QRT-PCR, un trabajo limitado que se ha hecho para demostrar su viabilidad. Pocas publicaciones en cuatro colores m&#xFA;ltiplex QRT-PCR han sido reportados, y para nuestro conocimiento no se ha trabajado para explorar las limitaciones del ensayo de. En este trabajo, se presenta el primer an&#xE1;lisis en profundidad de un m&#xFA;ltiplex de cuatro genes QRT-PCR. Para lograr una mejor comprensi&#xF3;n de las limitaciones potenciales del ensayo QRT-PCR, se utiliz&#xF3; en el ARN transcrito in vitro derivados de cuatro genes humanos. Para emular los experimentos de expresi&#xF3;n g&#xE9;nica, hemos desarrollado un sistema modelo en el que la transcritos in vitro fueron inoculadas con ARN de plantas totales. Este modelo nos ha permitido desarrollar un sistema artificial que se parece mucho diferenciales niveles de expresi&#xF3;n g&#xE9;nica que var&#xED;an hasta un mill&#xF3;n de veces. Se identific&#xF3; un &#xFA;nico &#x26;quot;universal&#x26;quot; condiciones de reacci&#xF3;n que permiti&#xF3; amplificaci&#xF3;n &#xF3;ptima en tiempo real de hasta cuatro genes en un amplio rango de concentraciones de plantilla. Este estudio muestra que la multiplexaci&#xF3;n es un enfoque factible aplicable a la mayor&#xED;a de QRT-PCR ensayos realizados con el total de ARN, independientemente de los niveles de expresi&#xF3;n de los genes bajo control.

Cuatro colores Multiplex polimerasa con transcripci&#xF3;n inversa Reacci&#xF3;n en cadena - la superaci&#xF3;n de sus limitaciones

&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x662F;&#x6838;&#x9178;&#x4EA4;&#x4ED8;&#x7684;&#x5B9D;&#x8D35;&#x5DE5;&#x5177;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x5B83;&#x53EF;&#x7528;&#x4E8E;&#x591A;&#x79CD;&#x7C7B;&#x578B;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x3002;&#x8BB8;&#x591A;&#x79D1;&#x5B66;&#x5BB6;&#x6B63;&#x5728;&#x8F6C;&#x53D8;&#x8D70;&#x5411;&#x66F4;&#x6709;&#x5173;&#x7684;&#x4F53;&#x5185;&#x7684;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x88AB;&#x8BA4;&#x4E3A;&#x96BE; nt-3 &#x7684;&#x4E3B;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7C7B;&#x578B;&#x7684;&#x4F7F;&#x7528;&#x60C5;&#x51B5;&#x3002;Electroporate &#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7C7B;&#x578B;&#x4E0E;&#x6838;&#x9178;&#x5206;&#x5B50;&#x7684;&#x5229;&#x7387;&#x76F8;&#x5BF9;&#x8F83;&#x9AD8;&#x7684;&#x6548;&#x7387;&#xFF0C;&#x5728;&#x4FDD;&#x6301;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6D3B;&#x6027;&#x7684;&#x540C;&#x65F6;&#xFF0C;&#x9610;&#x660E;&#x57FA;&#x56E0;&#x4EA7;&#x7269;&#x53C2;&#x4E0E;&#x5176;&#x4E2D;&#x7684; pathway(s) &#x81F3;&#x5173;&#x91CD;&#x8981;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x76EE;&#x524D;&#x6570;&#x636E;&#x8868;&#x660E;&#x901A;&#x8FC7;&#x4F18;&#x5316;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x53C2;&#x6570;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x4EE5;&#x9AD8;&#x6548;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x4EA4;&#x4ED8;&#x6838;&#x9178;&#x5206;&#x5B50;&#x3002;&#x5C0F;&#x5B66;&#x548C;&#x56F0;&#x96BE; transfect &#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7C7B;&#x578B;&#x5305;&#x62EC;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x539F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x3001; &#x8110;&#x9759;&#x8109;&#x5185;&#x76AE;&#x7EC6;&#x80DE;&#x3001; Jurkat &#x7EC6;&#x80DE;&#x548C;&#x4E24;&#x4E2A;&#x795E;&#x7ECF;&#x6BCD;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7624;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7CFB; [SK-N-SH (&#x4EBA;&#x7C7B;) &#x548C;&#x795E;&#x7ECF;-2A &#xFF08;&#x9F20;&#x6807;&#xFF09;] &#x4E0E;&#x8D28;&#x7C92; Dna &#x548C; siRNAs &#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x67D3;&#x7ED3;&#x679C;&#x663E;&#x793A;&#x6211;&#x4EEC;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x8868;&#x660E;&#x901A;&#x8FC7;&#x786E;&#x5B9A;&#x9002;&#x5F53;&#x7684;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x6761;&#x4EF6;&#xFF0C;&#x7518;&#x6CB9;&#x78F7;&#x9178;&#x8131;&#x6C22;&#x9176; mRNA &#x88AB;&#x538B;&#x5236;&#x5728; Jurkat &#x7EC6;&#x80DE;&#x76F8;&#x6BD4;&#x4E0E;&#x8D1F;&#x63A7;&#x5236; siRNA electroporations &#x4E3A; 4 h post-transfection&#x3002;&#x5176;&#x4ED6;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x8868;&#x660E;&#x4F18;&#x5316;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x6761;&#x4EF6;&#x4F7F;&#x7528;&#x9057;&#x4F20;&#x7269;&#x8D28;&#x6807;&#x8BB0;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x67D3;&#x63A7;&#x5236; siRNA &#x9020;&#x6210; 75%&#x7684;&#x8F6C;&#x67D3;&#x6548;&#x7387;&#x4E3A;&#x795E;&#x7ECF;-2A&#x3001; &#x4EBA;&#x7C7B;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x539F;&#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;93%&#x548C; 94%&#x4E3A;&#x8110;&#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;&#x5982;&#x6309;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5206;&#x6790;&#x3002;

&#x5728;&#x5C0F;&#x5B66;&#x548C;&#x5176;&#x4ED6;&#x56F0;&#x96BE; transfect &#x7EC6;&#x80DE;&#x7535;&#x7A7F;&#x5B54;&#x6761;&#x4EF6;&#x4F18;&#x5316;&#x3002;

Electroporation is a valuable tool for nucleic acid delivery because it can be used for a wide variety of cell types. Many scientists are shifting toward the use of cell types that are more relevant to in vivo applications, including primary cells, which are considered difficult to transfect. The ability to electroporate these cell types with nucleic acid molecules of interest at a relatively high efficiency while maintaining cell viability is essential for elucidating the pathway(s) in which a gene product is involved. We present data demonstrating that by optimizing electroporation parameters, nucleic acid molecules can be delivered in a highly efficient manner. We display transfection results for primary and difficult-to-transfect cell types including human primary fibroblasts, human umbilical vein endothelial cells, Jurkat cells, and two neuroblastoma cell lines [SK-N-SH (human) and Neuro-2A (mouse)] with plasmid DNAs and siRNAs. Our data demonstrate that by determining proper electroporation conditions, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase mRNA was silenced in Jurkat cells when compared with negative control siRNA electroporations as early as 4 h post-transfection. Other experiments demonstrated that optimized electroporation conditions using a fluorescently labeled transfection control siRNA resulted in 75% transfection efficiency for Neuro-2A, 93% for human primary fibroblasts, and 94% for HUVEC cells, as analyzed by flow cytometry.

Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells.

L&#x26;#39;&#xE9;lectroporation est un outil pr&#xE9;cieux pour la livraison d&#x26;#39;acide nucl&#xE9;ique, car il peut &#xEA;tre utilis&#xE9; pour une grande vari&#xE9;t&#xE9; de types cellulaires. Beaucoup de scientifiques se tournent vers l&#x26;#39;utilisation de types de cellules qui sont plus pertinents pour des applications in vivo, y compris les cellules primaires, qui sont consid&#xE9;r&#xE9;s comme difficiles &#xE0; transfecter. La capacit&#xE9; pour &#xE9;lectroporer ces types de cellules avec des mol&#xE9;cules d&#x26;#39;acide nucl&#xE9;ique d&#x26;#39;int&#xE9;r&#xEA;t avec un rendement relativement &#xE9;lev&#xE9;, tout en maintenant la viabilit&#xE9; des cellules est essentiel pour &#xE9;lucider la voie (s) dans lequel un produit de g&#xE8;ne est impliqu&#xE9;. Nous pr&#xE9;sentons des donn&#xE9;es d&#xE9;montrant que les param&#xE8;tres par &#xE9;lectroporation d&#x26;#39;optimisation, les mol&#xE9;cules d&#x26;#39;acide nucl&#xE9;ique peut &#xEA;tre livr&#xE9; dans une mani&#xE8;re tr&#xE8;s efficace. Nous affichons des r&#xE9;sultats de transfection pour les types de cellules primaires et difficiles &#xE0; transfecter, y compris des fibroblastes primaires, des cellules endoth&#xE9;liales de veine ombilicale, les cellules Jurkat, et deux lign&#xE9;es de cellules de neuroblastome [SK-N-SH (humaine) et Neuro-2A (souris)] avec les ADN plasmidiques et ARNsi. Nos donn&#xE9;es d&#xE9;montrent que par la d&#xE9;termination des conditions d&#x26;#39;&#xE9;lectroporation appropri&#xE9;es, l&#x26;#39;ARNm de la glyc&#xE9;rald&#xE9;hyde phosphate d&#xE9;shydrog&#xE9;nase a &#xE9;t&#xE9; r&#xE9;duit au silence dans les cellules Jurkat en comparaison avec n&#xE9;gatives &#xE9;lectroporations siRNA contr&#xF4;le d&#xE8;s 4 h post-transfection. D&#x26;#39;autres exp&#xE9;riences ont d&#xE9;montr&#xE9; que les conditions d&#x26;#39;&#xE9;lectroporation optimis&#xE9;s &#xE0; l&#x26;#39;aide d&#x26;#39;un siRNA de transfection marqu&#xE9; par fluorescence de contr&#xF4;le conduit &#xE0; l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de transfection de 75% de Neuro-2A, 93% pour les fibroblastes humains primaires, et 94% pour les cellules HUVEC, analys&#xE9; par cytom&#xE9;trie de flux.

Optimisation des conditions d&#x26;#39;&#xE9;lectroporation dans primaire et autres difficiles &#xE0; transfecter des cellules

Elektroporation ist ein wertvolles Werkzeug f&uuml;r Nukleins&auml;ure-Lieferung, da es f&uuml;r eine Vielzahl von Zelltypen verwendet werden kann. Viele Wissenschaftler verlagern sich gegen die Verwendung von Zelltypen, die f&uuml;r in-vivo Anwendungen, einschlie&szlig;lich Prim&auml;rzellen, die schwer zu bioaktiven gelten mehr relevant sind. Die F&auml;higkeit, Electroporate diesen Zelltypen mit Nukleins&auml;ure-Molek&uuml;le des Interesses auf einen relativ hohen Wirkungsgrad unter Beibehaltung der Zellviabilit&auml;t unbedingt elucidating die Pathway(s), an denen ein Genprodukt beteiligt ist. Wir stellen Daten zeigen, dass durch Elektroporation Parameteroptimierung Nukleins&auml;uremolek&uuml;len auf hocheffiziente Weise geliefert werden k&ouml;nnen. Wir zeigen die Transfektion Ergebnisse f&uuml;r Prim&auml;r- und schwierigen bioaktiven Zelltypen, einschlie&szlig;lich menschliche prim&auml;re Fibroblasten, Endothelzellen der menschlichen Nabelschnur Vene, Jurkat Zellen und zwei Neuroblastom-Zelllinien [SK-N-SH (Mensch) und Neuro-2A (Maus)] mit Plasmid DNA und SiRNAs. Unsere Daten zeigen, dass durch richtige Electroporation Bedingungen ermitteln, Glycerinaldehyd-phosphat-Dehydrogenase, die mRNA in Jurkat zum Schweigen gebracht wurde Zellen verglichen mit der Negativkontrolle SiRNA Electroporations so fr&uuml;h wie 4 h Post-transfection. Andere Experimente zeigten, dass 75 % Transfektionseffizienz f&uuml;r Neuro-2A, optimierte Elektroporation-Bedingungen, die mit einem Leuchtstoff beschriftetem Transfektion Steuerelement SiRNA gef&uuml;hrt 93 % f&uuml;r menschliche prim&auml;re Fibroblasten und 94 % bei HUVEC Zellen, wie durch Durchflusszytometrie analysiert.

Optimierung der Elektroporation Bedingungen in Prim&auml;r- und andere schwierige bioaktiven Zellen.

Elettroporazione &egrave; uno strumento prezioso per la consegna dell&#39;acido nucleico, perch&eacute; pu&ograve; essere utilizzato per un&#39;ampia variet&agrave; di tipi di cellule. Molti scienziati si stanno spostando verso l&#39;uso di tipi di cellule che sono pi&ugrave; rilevanti per le applicazioni in vivo, comprese le cellule primarie, che sono considerate difficili a transfect. La capacit&agrave; di electroporate questi tipi di cellule con molecole di acido nucleico di interesse ad una relativamente alta efficienza mantenendo attuabilit&agrave; delle cellule &egrave; essenziale per chiarire le vie biochimiche in cui &egrave; coinvolto un prodotto del gene. Vi presentiamo i dati che dimostrano che, grazie all&#39;ottimizzazione dei parametri di elettroporazione, molecole di acido nucleico possono essere consegnati in un modo altamente efficiente. Visualizziamo i risultati di transfezione per tipi di cellule primarie e difficili a transfect fibroblasti primari umani, cellule endoteliali di vena ombelicale umana, le cellule Jurkat e due linee di neuroblastoma cellule [SK-N-SH (umano) e Neuro-2A (mouse)] con il plasmide DNAs e siRNA. I nostri dati dimostrano che determinando condizioni di elettroporazione corretta, deidrogenasi di fosfato della gliceraldeide che mRNA &egrave; stato messo a tacere in Jurkat cells quando rispetto al controllo negativo siRNA elettroporazioni fin dal post-transfection 4 h. Altri esperimenti dimostrano che condizioni di elettroporazione ottimizzato utilizzando un siRNA controllo transfezione fluorescente contrassegnati nel 75% di efficienza di trasfezione per Neuro-2A, 93% per i fibroblasti umani primari e 94% di cellule HUVEC, come analizzato tramite flusso cytometry.

Ottimizzazione delle condizioni di elettroporazione in primaria e altre cellule difficili a transfect.

&#x305D;&#x308C;&#x306F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x7A2E;&#x985E;&#x306E;&#x591A;&#x7A2E;&#x591A;&#x69D8;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x306E;&#x3067;&#x3001;&#x30A8;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30ED;&#x30DD;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x6838;&#x9178;&#x9001;&#x9054;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8CB4;&#x91CD;&#x306A;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x79D1;&#x5B66;&#x8005;&#x305F;&#x3061;&#x306F;&#x3001;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306F;&#x56F0;&#x96E3;&#x3068;&#x307F;&#x306A;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x751F;&#x4F53;&#x5185;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;&#x3001;&#x3088;&#x308A;&#x95A2;&#x9023;&#x6027;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x578B;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x306B;&#x5411;&#x3051;&#x3066;&#x30B7;&#x30D5;&#x30C8;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x751F;&#x5B58;&#x3092;&#x7DAD;&#x6301;&#x3057;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x3001;&#x6BD4;&#x8F03;&#x7684;&#x9AD8;&#x3044;&#x52B9;&#x7387;&#x3067;&#x76EE;&#x7684;&#x306E;&#x6838;&#x9178;&#x5206;&#x5B50;&#x3068;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x578B;&#x3092;&#x30A8;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30ED;&#x30DD;&#x3059;&#x308B;&#x80FD;&#x529B;&#x306F;&#x3001;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x7523;&#x7269;&#x304C;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;&#x7D4C;&#x8DEF;&#xFF08;s&#xFF09;&#x3092;&#x89E3;&#x660E;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6B20;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30A8;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30ED;&#x30DD;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x30D1;&#x30E9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30BF;&#x3092;&#x6700;&#x9069;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x6838;&#x9178;&#x5206;&#x5B50;&#x306F;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3067;&#x914D;&#x4FE1;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x3092;&#x63D0;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30D2;&#x30C8;&#x521D;&#x4EE3;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x82BD;&#x7D30;&#x80DE;&#x3001;&#x30D2;&#x30C8;&#x81CD;&#x5E2F;&#x9759;&#x8108;&#x5185;&#x76AE;&#x7D30;&#x80DE;&#x3001;Jurkat&#x7D30;&#x80DE;&#x3001;&#x4E8C;&#x3064;&#x306E;&#x795E;&#x7D4C;&#x82BD;&#x7D30;&#x80DE;&#x816B;&#x7D30;&#x80DE;&#x682A;[SK-N-SH&#xFF08;&#x30D2;&#x30C8;&#xFF09;&#x3068;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30ED;-2A&#xFF08;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#xFF09;]&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30EA;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x56F0;&#x96E3;&#x306A;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x7A2E;&#x985E;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3092;&#x8868;&#x793A;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;DNA&#x304A;&#x3088;&#x3073;siRNA&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;4&#x6642;&#x9593;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x5F8C;&#x3001;&#x65E9;&#x3051;&#x308C;&#x3070;&#x30CD;&#x30AC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C8;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;siRNA&#x306E;&#x30A8;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30ED;&#x30DD;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x305F;&#x5834;&#x5408;&#x3001;&#x9069;&#x5207;&#x306A;&#x30A8;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30ED;&#x30DD;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x6761;&#x4EF6;&#x3092;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x30B0;&#x30EA;&#x30BB;&#x30EB;&#x30A2;&#x30EB;&#x30C7;&#x30D2;&#x30C9;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x30C7;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x30B2;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;mRNA&#x306F;&#x3001;Jurkat&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x6C88;&#x9ED9;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4ED6;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;&#x3057;&#x305F;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C8;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;siRNA&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x6700;&#x9069;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30A8;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30ED;&#x30DD;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x6761;&#x4EF6;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5206;&#x6790;&#x3057;&#x305F;HUVEC&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;75&#xFF05;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x795E;&#x7D4C;-2A&#x306E;&#x52B9;&#x7387;&#x3001;&#x30D2;&#x30C8;&#x521D;&#x4EE3;&#x7DDA;&#x7DAD;&#x82BD;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;93&#xFF05;&#x3001;94&#xFF05;&#x3092;&#x3082;&#x305F;&#x3089;&#x3057;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30EA;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x305D;&#x306E;&#x4ED6;&#x306E;&#x56F0;&#x96E3;&#x306A;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x306E;&#x30A8;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30ED;&#x30DD;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x6761;&#x4EF6;&#x306E;&#x6700;&#x9069;&#x5316;

Electroporation &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC140; &#xD615;&#xC2DD;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xAE30; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xD575; &#xC0B0; &#xC804;&#xB2EC; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xC720;&#xC6A9;&#xD55C; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB9CE;&#xC740; &#xACFC;&#xD559;&#xC790; &#xB4E4;&#xC740; &#xB354; &#xC5B4;&#xB824;&#xC6B4; transfect&#xC73C;&#xB85C; &#xAC04;&#xC8FC; &#xB418;&#xB294; 1 &#xCC28; &#xC140;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558; &#xC5EC; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC720;&#xD615;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC744; &#xD5A5;&#xD574; &#xC774;&#xB3D9; &#xD558;&#xB294;. Electroporate &#xC218; &#xC788;&#xAC8C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC0DD;&#xC874; &#xB2A5;&#xB825;&#xC744; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558;&#xBA74;&#xC11C; &#xC0C1;&#xB300;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB192;&#xC740; &#xD6A8;&#xC728;&#xC5D0; &#xAD00;&#xC2EC;&#xC758; &#xD575; &#xC0B0; &#xBD84;&#xC790;&#xC640; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC140; &#xD615;&#xC2DD;&#xC758; elucidating &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC81C;&#xD488; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; pathway(s)&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB294; electroporation &#xB9E4;&#xAC1C; &#xBCC0;&#xC218;&#xB97C; &#xCD5C;&#xC801;&#xD654; &#xD558; &#xC5EC; &#xD575; &#xC0B0; &#xBD84;&#xC790; &#xC804;&#xB2EC; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC8FC;&#xB294; &#xC120;&#xBB3C;&#xC774;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xAE30;&#xBCF8; &#xAC8C;&#xC7AC;, &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xD0EF; &#xC904; &#xC815; &#xB9E5; &#xB0B4; &#xD53C; &#xC138;&#xD3EC;, Jurkat &#xC138;&#xD3EC; &#xB450; &#xC2E0;&#xACBD; &#xC138;&#xD3EC; &#xB77C;&#xC778; [SK-N-SH (&#xC778;&#xAC04;)&#xC640; &#xC2E0;&#xACBD;-2A (&#xB9C8;&#xC6B0;&#xC2A4;)] &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC; Dnas&#xC640; siRNAs &#xB4F1; &#xAE30;&#xBCF8; &#xBC0F; transfect &#xC5B4;&#xB824;&#xC6B4; &#xC140; &#xD615;&#xC2DD;&#xC758; transfection &#xACB0;&#xACFC; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xC801;&#xC808; &#xD55C; electroporation &#xC870;&#xAC74;&#xC744; &#xACB0;&#xC815; &#xD558; &#xC5EC; &#xBE60;&#xB974;&#xBA74; 4 h post-transfection &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xC81C;&#xC5B4; siRNA electroporations&#xC640; &#xBE44;&#xAD50; &#xD588;&#xC744; &#xB54C; glyceraldehyde &#xC778;&#xC0B0; &#xC5FC; dehydrogenase Mrna&#xB294; Jurkat&#xC5D0; &#xC785; &#xB9C9; &#xC74C;&#xC744; &#xC140;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E4;&#xB978; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC2DC;&#xC5F0; &#xB193;&#xC5EC;&#xC788;&#xB294;&#xC9C0; &#xB808;&#xC774;&#xBE14;&#xC774; &#xC788;&#xB294; transfection &#xC81C;&#xC5B4; Sirna&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xCD5C;&#xC801;&#xD654; &#xB41C; electroporation &#xC870;&#xAC74;&#xC744; transfection &#xD6A8;&#xC728; 75%&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2E0;&#xACBD; 2a&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; cytometry &#xBD84;&#xC11D;&#xC73C;&#xB85C; HUVEC cells 94%&#xC640; 93% &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xAE30;&#xBCF8; &#xAC8C;&#xC7AC;.

&#xC8FC; &#xD30C;&#xC77C; &#xADF8;&#xB8F9; &#xBC0F; &#xB2E4;&#xB978; &#xC5B4;&#xB824;&#xC6B4; transfect &#xC140;&#xC5D0;&#xC11C; electroporation &#xC870;&#xAC74; &#xCD5C;&#xC801;&#xD654;.

La electroporaci&#xF3;n es una herramienta valiosa para la entrega de &#xE1;cido nucleico, ya que puede ser usado para una amplia variedad de tipos de c&#xE9;lulas. Muchos cient&#xED;ficos se est&#xE1;n desplazando hacia el uso de tipos de c&#xE9;lulas que son m&#xE1;s relevantes para las aplicaciones in vivo, incluyendo las c&#xE9;lulas primarias, que se consideran dif&#xED;ciles de transfectar. La capacidad de estos tipos de c&#xE9;lulas electroporate con mol&#xE9;culas de &#xE1;cidos nucleicos de inter&#xE9;s en una eficiencia relativamente alta mientras que mantiene la viabilidad celular es esencial para dilucidar la v&#xED;a (s) en que est&#xE1; implicado un producto g&#xE9;nico. Se presentan datos que demuestran que la optimizaci&#xF3;n de los par&#xE1;metros de electroporaci&#xF3;n, las mol&#xE9;culas de &#xE1;cido nucleico puede ser entregado de una manera altamente eficiente. Mostramos los resultados de la transfecci&#xF3;n de los tipos de c&#xE9;lulas primarias y dif&#xED;ciles de transfectar, incluyendo fibroblastos humanos primarios, las c&#xE9;lulas endoteliales de vena umbilical, las c&#xE9;lulas Jurkat, y dos l&#xED;neas celulares de neuroblastoma [SK-N-SH (humano) y Neuro-2A (rat&#xF3;n)] con el ADN de pl&#xE1;smido y siRNAs. Nuestros datos demuestran que mediante la determinaci&#xF3;n de las condiciones adecuadas de electroporaci&#xF3;n, el fosfato de gliceraldeh&#xED;do deshidrogenasa mRNA fue silenciado en c&#xE9;lulas Jurkat en comparaci&#xF3;n con los negativos electroporaciones control de siRNA tan pronto como 4 horas despu&#xE9;s de la transfecci&#xF3;n. Otros experimentos demostraron que las condiciones optimizadas de electroporaci&#xF3;n utilizando un ARNsi transfecci&#xF3;n de control marcada con fluorescencia result&#xF3; en la eficiencia de la transfecci&#xF3;n 75% de Neuro-2A, 93% para los fibroblastos humanos primarios, y 94% para las c&#xE9;lulas HUVEC, como se analizaron por citometr&#xED;a de flujo.

Article	Year
Fluorescent multicolor multiplex homogeneous assay for the simultaneous analysis of the two most common hemochromatosis mutations. Analytical biochemistry\| PubMed ID: 12137778	2002
Linked linear amplification for simultaneous analysis of the two most common hemochromatosis mutations. Clinical chemistry\| PubMed ID: 12816900	2003
Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids. Analytical biochemistry\| PubMed ID: 14654057	2004
Four-color multiplex 5' nuclease assay for the simultaneous detection of the factor V Leiden and the prothrombin G20210A mutations. Molecular and cellular probes\| PubMed ID: 15135449	2004
Multiplex assays with fluorescent microbead readout: a powerful tool for mutation detection. Clinical chemistry\| PubMed ID: 15502076	2004
Four-color multiplex reverse transcription polymerase chain reaction--overcoming its limitations. Analytical biochemistry\| PubMed ID: 16039598	2005
Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. Journal of biomolecular techniques : JBT\| PubMed ID: 19183796	2008

Luis Ugozzoli

Biography

JoVE Journal Publications

Other Publications