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Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the <em>Drosophila melanogaster</em> Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Florida Atlantic University

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&#x4F7F;&#x7528;&#x679C;&#x8747;&#x5DE8;&#x578B;&#x5149;&#x7EA4;&#x7535;&#x8DEF;&#x7684;&#x6BD2;&#x7D20;&#x5728;&#x4F53;&#x5185;&#x7B5B;&#x67E5;&#x7684;&#x65B0;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;

Finding compounds that affect neuronal or muscular function is of great interest as potential therapeutic agents for a variety of neurological disorders. Alternative applications for these compounds include their use as molecular probes as well as insecticides. We have developed a bioassay that requires small amounts of compounds and allows for unbiased screening of biological activity in vivo. For this, we paired administering compounds in a non-invasive manner with simultaneous electrophysiological recordings from a well-characterized neuronal circuit, the Giant Fiber System of Drosophila melanogaster, which mediates the escape response of the fly. The circuit encompasses a variety of neurons with cholinergic, glutamatergic, and electrical synapses as well as neuromuscular junctions. Electrophysiological recordings from this system allow for the detection of compound-related effects against any molecular target on these components. Here, we provide evidence that this novel bioassay works with small molecules such as the cholinergic receptor blocker mecamylamine hydrochloride and the potassium channel blocker tetraethylammonium hydroxide, as well as with venom from Conus brunneus and isolated conopeptides. Conopeptides have been developed into powerful drugs, such as the painkillers Prialtâ„¢ and Xen2174. However, most conopeptides have yet to be characterized, revealing the need for a rapid and straightforward screening method. Our findings show that mecamylamine hydrochloride, as well as the Î±-conotoxin ImI, which is known to be an antagonist of the human Î±7 nicotinic acetylcholine receptor, efficiently disrupted the synaptic transmission of a Drosophila Î±7 nicotinic acetylcholine receptor-dependent pathway in our circuit but did not affect the function of neurons with other types of synapses. This demonstrates that our bioassay is a valid tool for screening for compounds relevant to human health.

A novel approach for in vivo screening of toxins using the Drosophila Giant Fiber circuit.

Trouver des compos&#xE9;s qui affectent la fonction neuronale ou musculaire est d&#x26;#39;un grand int&#xE9;r&#xEA;t que des agents th&#xE9;rapeutiques potentiels pour une vari&#xE9;t&#xE9; de troubles neurologiques. Applications alternatives pour ces compos&#xE9;s comprennent leur utilisation comme sondes mol&#xE9;culaires ainsi que des insecticides. Nous avons d&#xE9;velopp&#xE9; un nouveau test qui n&#xE9;cessite de petites quantit&#xE9;s de compos&#xE9;s et permet pour le d&#xE9;pistage non biais&#xE9; de l&#x26;#39;activit&#xE9; biologique in vivo. Pour cela, nous jumel&#xE9; administration compos&#xE9;s d&#x26;#39;une mani&#xE8;re non-invasive avec des enregistrements &#xE9;lectrophysiologiques simultan&#xE9;es &#xE0; partir d&#x26;#39;un circuit neuronal bien caract&#xE9;ris&#xE9;, le syst&#xE8;me de fibres g&#xE9;ant de Drosophila melanogaster, qui intervient dans la r&#xE9;action de fuite de la mouche. Le circuit comprend une vari&#xE9;t&#xE9; de neurones cholinergiques avec, glutamatergique, et les synapses &#xE9;lectriques ainsi que des jonctions neuromusculaires. Des enregistrements &#xE9;lectrophysiologiques de ce syst&#xE8;me permettent la d&#xE9;tection de compos&#xE9;s li&#xE9;s &#xE0; des effets contre n&#x26;#39;importe quelle cible mol&#xE9;culaire sur ces composants. Ici, nous fournir la preuve que cet essai biologique roman travaille avec de petites mol&#xE9;cules telles que l&#x26;#39;antagoniste des r&#xE9;cepteurs de chlorhydrate de m&#xE9;camylamine cholinergique et l&#x26;#39;hydroxyde de potassium canal bloqueur t&#xE9;tra&#xE9;thylammonium, ainsi qu&#x26;#39;avec le venin de Conus et brunneus conopeptides isol&#xE9;s. Conopeptides ont &#xE9;t&#xE9; d&#xE9;velopp&#xE9;s dans des m&#xE9;dicaments puissants, tels que l&#x26;#39;&#x2122; analg&#xE9;siques Prialt et Xen2174. Cependant, la plupart des conopeptides doivent encore &#xEA;tre caract&#xE9;ris&#xE9;, r&#xE9;v&#xE9;lant la n&#xE9;cessit&#xE9; d&#x26;#39;une m&#xE9;thode de d&#xE9;pistage simple et rapide. Nos r&#xE9;sultats montrent que le chlorhydrate de m&#xE9;camylamine, ainsi que l&#x26;#39;IMI &#x3B1;-conotoxine, qui est connu pour &#xEA;tre un antagoniste du r&#xE9;cepteur de l&#x26;#39;ac&#xE9;tylcholine &#x3B1;7 humaine nicotinique, efficacement perturb&#xE9; la transmission synaptique d&#x26;#39;une drosophile &#x3B1;7 r&#xE9;cepteur de l&#x26;#39;ac&#xE9;tylcholine-d&#xE9;pendante voie nicotinique dans notre circuit, mais n&#x26;#39;a pas d&#x26;#39;incidence sur la fonction des neurones avec d&#x26;#39;autres types de synapses. Cela d&#xE9;montre que notre essai biologique est un outil valable pour le criblage de compos&#xE9;s pertinents pour la sant&#xE9; humaine.

Une nouvelle approche pour le criblage in vivo de toxines en utilisant le circuit Drosophila fibre g&#xE9;ant

Verbindungen, die neuronalen oder muskul&auml;re Funktion beeintr&auml;chtigen zu finden ist von gro&szlig;em Interesse als potenzielle Therapeutika f&uuml;r eine Vielzahl von neurologischen Erkrankungen. Alternative Anwendungen f&uuml;r diese Verbindungen sind ihre Verwendung als molekulare Sonden sowie Insektizide. Wir haben eine Bioassay entwickelt, die kleine Mengen von Verbindungen erfordert und erm&ouml;glicht f&uuml;r die unvoreingenommene Pr&uuml;fung der biologischen Aktivit&auml;t in-vivo. Hierzu gepaart wir Verwalten von Verbindungen in einer nicht-invasive Weise mit gleichzeitiger elektrophysiologische Aufnahmen aus einem gut charakterisierten neuronaler Schaltkreise, die riesigen Fiber System von Drosophila Melanogaster die die Flucht-Reaktion der Fliege vermittelt. Der Rundgang umfasst eine Vielzahl von Neuronen mit cholinergen, Glutamat, sowie elektrische Synapsen und neuromuskul&auml;re Kreuzungen. Elektrophysiologische Aufnahmen von diesem System erm&ouml;glichen die Erkennung von Zinseszinsen Effekte gegen jede molekulares Ziel auf diesen Komponenten. Hier bieten wir Beweise, die diese neuartigen Bioassay arbeitet mit kleinen Molek&uuml;len wie die cholinergische Rezeptor Blocker Mecamylamin Hydrochlorid und Kanal Blocker Tetraethylammonium Kaliumhydroxid sowie mit Venom von Conus Brunneus und isolierten Conopeptide. Conopeptide sind starke Medikamente, wie z. B. die Schmerzmittel Prialt &trade; und Xen2174 entwickelt worden. Allerdings haben die meisten Conopeptide noch charakterisiert werden, offenbart die Notwendigkeit f&uuml;r eine rasche und unkomplizierte screening Methode. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Mecamylamin-Hydrochlorid, sowie die &alpha;-Conotoxin ImI, die als ein Antagonist des menschlichen &alpha;7 nikotinische Acetylcholin-Rezeptors bekannt ist, effizient st&ouml;rten die synaptische &Uuml;bertragung von Drosophila &alpha;7 nikotinische Acetylcholin-Rezeptor-abh&auml;ngigen Weg in unserer Vereinigung aber hatte keine Auswirkungen auf die Funktion der Nervenzellen mit anderen Typen von Synapsen. Dies zeigt, dass unsere Bioassay ein g&uuml;ltiges Werkzeug f&uuml;r Screening f&uuml;r Compounds f&uuml;r die menschliche Gesundheit relevante ist.

Einen neuen Ansatz zur in-vivo Screening der Toxine mit die Taufliege-Giant-Fiber-Schaltung.

Trovare composti che influiscono sulla funzione neuronale o muscolare &egrave; di grande interesse come potenziali agenti terapeutici per una variet&agrave; di disordini neurologici. Applicazioni alternative per questi composti includono il loro uso come sonde molecolari, come pure gli insetticidi. Abbiamo sviluppato un&#39;analisi biologica che richiede piccole quantit&agrave; di composti e permette per lo screening imparziale dell&#39;attivit&agrave; biologica in vivo. Per questo, abbiamo abbinato amministrando composti in maniera non invasiva con registrazioni elettrofisiologiche simultanee da un circuito neuronale ben caratterizzato, il gigante sistema fibra di Drosophila melanogaster, che media la risposta di fuga della Mosca. Il circuito comprende una variet&agrave; di neuroni con colinergico, glutamatergico e sinapsi elettriche cos&igrave; come giunzioni neuromuscolari. Registrazioni elettrofisiologiche da questo sistema permettono il rilevamento di composti correlati effetti contro qualsiasi bersaglio molecolare su questi componenti. Qui, forniamo prove che questo romanzo analisi biologica funziona con piccole molecole come il cloridrato di mecamylamine bloccanti del recettore colinergico e l&#39;idrossido di tetraetilammonio blocco canale potassio, nonch&eacute; con veleno da Conus brunneus e conopeptides isolati. Conopeptides sono stati sviluppati in farmaci potenti, come ad esempio gli antidolorifici Prialt &trade; e Xen2174. Tuttavia, la maggior parte dei conopeptides devono ancora essere caratterizzata, rivelando la necessit&agrave; di un rapido e semplice metodo di screening. I nostri risultati mostrano che cloridrato mecamylamine, come pure il &alpha;-conotossina ImI, che &egrave; noto per essere un antagonista del recettore nicotinico dell&#39;acetilcolina umano &alpha;7, efficacemente interrotta la trasmissione sinaptica di un percorso di dipendente dal recettore nicotinico dell&#39;acetilcolina drosofila &alpha;7 nel nostro circuito ma non influisce sulla funzione dei neuroni con altri tipi di sinapsi. Ci&ograve; dimostra che la nostra analisi biologica &egrave; un valido strumento per lo screening di composti rilevanti per la salute umana.

Un nuovo approccio per lo screening in vivo delle tossine tramite il circuito fibra gigante della drosofila.

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&#xC2E0;&#xACBD; &#xB610;&#xB294; &#xADFC;&#xC721; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC8FC;&#xB294; &#xD654;&#xD569;&#xBB3C;&#xC744; &#xCC3E;&#xB294; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC2E0;&#xACBD; &#xC9C8;&#xD658;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xCE58;&#xB8CC; &#xC694;&#xC6D0;&#xC73C;&#xB85C; &#xD070; &#xAD00;&#xC2EC;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xD654;&#xD569;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB300;&#xCCB4; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8; &#xC0B4;&#xCDA9;&#xC81C;&#xB85C; &#xC11C; &#xBD84;&#xC790; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xB85C; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD654;&#xD569;&#xBB3C;&#xC758; &#xC791;&#xC740; &#xAE08;&#xC561;&#xC744; &#xC694;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0; in vivo &#xC0DD;&#xBB3C; &#xD559;&#xC801; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC758; &#xACF5;&#xD3C9;&#xD55C; &#xC2EC;&#xC0AC;&#xB97C; &#xACE0;&#xB824;&#xD55C; bioassay&#xB97C; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC704;&#xD574;, &#xC6B0;&#xB9AC; well-characterized &#xC2E0;&#xACBD; &#xD68C;&#xB85C;, &#xBE44;&#xD589;&#xC758; &#xD0C8;&#xCD9C; &#xC751;&#xB2F5; &#xC911;&#xC7AC; &#xD558;&#xB294; &#xCD08;&#xD30C;&#xB9AC;&#xC758; &#xAC70; &#xB300; &#xD55C; &#xC12C;&#xC720; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; melanogaster &#xB3D9;&#xC2DC; electrophysiological &#xB179;&#xC74C; &#xBE44;-&#xCE68;&#xB7B5; &#xC801; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xB9AC; &#xD654;&#xD569;&#xBB3C; &#xC30D;. &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC2E0;&#xACBD;&#xC73C;&#xB85C;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xD68C;&#xB85C;, cholinergic glutamatergic &#xBC0F; &#xC804;&#xAE30; &#xC2DC; &#xB0C5; &#xC2A4; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xC2E0;&#xACBD; &#xADFC;&#xC721; &#xD559; &#xC811;&#xD569;. &#xC774; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0;&#xC11C; electrophysiological &#xB179;&#xC74C; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xAD6C;&#xC131; &#xC694;&#xC18C;&#xC5D0; &#xC5B4;&#xB5A4; &#xBD84;&#xC790; &#xD45C;&#xC801;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD654;&#xD569;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC758; &#xAC80;&#xCD9C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD5C8;&#xC6A9;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; cholinergic &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xCC28;&#xB2E8;&#xC81C; mecamylamine &#xC5FC; &#xBC0F; &#xCC44;&#xB110; &#xCC28;&#xB2E8; &#xAD00;&#xB9AC; tetraethylammonium &#xC218;&#xC0B0;&#xD654; &#xCE7C;&#xB968; &#xAC19;&#xC740; &#xC791;&#xC740; &#xBD84;&#xC790; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xB3C5; Conus brunneus &#xBC0F; &#xACA9;&#xB9AC; &#xB41C; conopeptides&#xC5D0;&#xC11C; &#xC791;&#xB3D9; &#xD558;&#xB294;&#xC774; &#xC18C;&#xC124;&#xC740; bioassay &#xC99D;&#xAC70;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5;. Conopeptides Prialt &trade; &#xBC0F; Xen2174 &#xC9C4;&#xD1B5;&#xC81C; &#xB4F1; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xC57D;&#xBB3C;&#xC73C;&#xB85C; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xB300;&#xBD80;&#xBD84;&#xC758; conopeptides&#xB294; &#xC544;&#xC9C1; &#xD2B9;&#xC9D5; &#xC218; &#xBE60;&#xB978;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD544;&#xC694;&#xC131;&#xC744; &#xACF5;&#xAC1C; &#xD558; &#xACE0; &#xAC04;&#xB2E8; &#xC2EC;&#xC0AC; &#xBC29;&#xBC95;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xACB0;&#xACFC; &#xD45C;&#xC2DC;&#xB294; mecamylamine &#xC5FC;&#xC73C;&#xB85C; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4; &#xC778;&#xAC04; &alpha;7 nicotinic &#xC544; &#xC138; &#xD2F8; &#xCF5C;&#xB9B0; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC758; &#xAE38; &#xD56D; &#xC81C;, &alpha;-conotoxin ImI &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; Drosophila &alpha;7 nicotinic &#xC544; &#xC138; &#xD2F8; &#xCF5C;&#xB9B0; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC5D0; &#xC885;&#xC18D;&#xC801;&#xC778; &#xD1B5;&#xB85C; &#xD68C;&#xB85C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2DC; &#xB0C5; &#xC2A4; &#xC804;&#xC1A1; &#xC911;&#xB2E8; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xB2E4;&#xB978; &#xC720;&#xD615;&#xC758; &#xC2DC; &#xB0C5; &#xC2A4;&#xB294; &#xB274;&#xB7F0;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0;&#xB294; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBBF8;&#xCE58;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC558;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; bioassay&#xB294; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xAC74;&#xAC15;&#xC5D0; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xD654;&#xD569;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC80;&#xC5F4;&#xC744; &#xC704;&#xD574; &#xC720;&#xD6A8;&#xD55C; &#xB3C4;&#xAD6C; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xCD08;&#xD30C;&#xB9AC; &#xAC70; &#xB300; &#xD55C; &#xC12C;&#xC720; &#xD68C;&#xB85C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB3C5; &#xC18C;&#xC758; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74; &#xC2EC;&#xC0AC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xC2DD;.

Encontrar compuestos que afectan la funci&#xF3;n neuronal o muscular es de gran inter&#xE9;s como agentes terap&#xE9;uticos potenciales para una variedad de trastornos neurol&#xF3;gicos. Aplicaciones alternativas para estos compuestos incluyen su uso como sondas moleculares, as&#xED; como insecticidas. Hemos desarrollado un bioensayo que requiere peque&#xF1;as cantidades de compuestos y permite la detecci&#xF3;n sesgada de actividad biol&#xF3;gica in vivo. Para esto, la administraci&#xF3;n de compuestos emparejado en una forma no invasiva con simult&#xE1;neas registros electrofisiol&#xF3;gicos de un circuito bien caracterizado neuronal, el sistema de fibra gigante de Drosophila melanogaster, que media la respuesta de escape de la mosca. El circuito abarca una variedad de neuronas con receptores colin&#xE9;rgicos, glutamat&#xE9;rgicos, y las sinapsis el&#xE9;ctricas, as&#xED; como las uniones neuromusculares. Registros electrofisiol&#xF3;gicos de este sistema de permitir la detecci&#xF3;n de relacionados con el compuesto efectos contra cualquier diana molecular en estos componentes. En este sentido, proporcionan evidencia de que este bioensayo novela trabaja con mol&#xE9;culas peque&#xF1;as tales como el bloqueador de receptores colin&#xE9;rgicos hidrocloruro de mecamilamina y el hidr&#xF3;xido de potasio bloqueador de los canales de tetraetilamonio, as&#xED; como con veneno de brunneus Conus y conopeptides aislados. Conopeptides se han convertido en drogas de gran alcance, tales como el &#x2122; analg&#xE9;sicos Prialt y Xen2174. Sin embargo, la mayor&#xED;a de conopeptides a&#xFA;n no se han caracterizado, revelando la necesidad de un m&#xE9;todo de detecci&#xF3;n r&#xE1;pida y sencilla. Nuestros resultados muestran que el hidrocloruro de mecamilamina, as&#xED; como el IMI &#x3B1;-conotoxina, que se sabe que es un antagonista del receptor de la acetilcolina humano &#x3B1;7 nicot&#xED;nico, eficiente interrumpido la transmisi&#xF3;n sin&#xE1;ptica de una Drosophila &#x3B1;7 acetilcolina nicot&#xED;nico receptor dependen de la v&#xED;a en nuestro circuito pero no afecta a la funci&#xF3;n de las neuronas con otros tipos de sinapsis. Esto demuestra que nuestro bioensayo es una herramienta v&#xE1;lida para la detecci&#xF3;n de compuestos de inter&#xE9;s para la salud humana.

Mari D. Heghinian

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