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Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Johannes Gutenberg-University Mainz, Germany

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&#x8054;&#x7CFB;&#x4EBA;&#x5E03;&#x70B9;&#x86CB;&#x767D;&#x82AF;&#x7247;&#x52A0;&#x4E0A;&#x56FE;&#x6587;&#x573A;&#x4E2D;&#x7684;&#x6807;&#x51C6;&#x4EF6;&#x86CB;&#x767D;&#x8BB8;&#x53EF;&#x8BC1; ERBB &#x53D7;&#x4F53;&#x4FE1;&#x53F7;&#x65F6;&#x95F4;&#x5206;&#x8FA8;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x3002;

Protein microarrays allow highly accurate comparison and quantification of numerous biological samples in parallel while requiring only little material. This qualifies protein arrays for systems biology and clinical research where only limited sample material is available, but a precise readout is required. With the introduction of signal normalization steps to monitor the drop size of manually contact-spotted RP protein arrays, the usefulness of normalizer proteins to ensure a high-throughput but inexpensive protein analysis was demonstrated. This approach was applied for the analysis of signaling through ERBB receptor activated kinases in the breast cancer cell line MCF-7. Activation of ERK1/2 and AKT by ERBB1 (EGFR), ERRB2 (HER2/neu), and ERBB3-4 was monitored in a time-resolved manner. Analysis of pathway activation by stimulation with epidermal growth factor and heregulin, or inhibition by blocking with gefitinib or herceptin allowed a characterization of the distinct signaling properties of the different ERBB receptor subtypes.

Contact spotting of protein microarrays coupled with spike-in of normalizer protein permits time-resolved analysis of ERBB receptor signaling.

Micropuces de prot&eacute;ines permettent une comparaison tr&egrave;s pr&eacute;cise et quantification de nombreux &eacute;chantillons biologiques en parall&egrave;le tout en n&eacute;cessitant peu de mat&eacute;riel. Cela qualifie les alignements de prot&eacute;ine pour la biologie des syst&egrave;mes et de la recherche clinique o&ugrave; seul &eacute;chantillon limit&eacute; de mat&eacute;riel est disponible, mais il faut une lecture pr&eacute;cise. Avec l&#39;introduction d&#39;&eacute;tapes de normalisation du signal pour surveiller la taille de goutte des alignements de prot&eacute;ine RP manuellement contact-teigne, l&#39;utilit&eacute; des prot&eacute;ines normalisateur afin d&#39;assurer un haut d&eacute;bit mais l&#39;analyse des prot&eacute;ines peu co&ucirc;teux a &eacute;t&eacute; d&eacute;montr&eacute;e. Cette approche a &eacute;t&eacute; appliqu&eacute;e pour l&#39;analyse de la signalisation par les kinases du r&eacute;cepteur activ&eacute; ERBB dans la lign&eacute;e de cellules canc&eacute;reuses du sein MCF-7. Activation de ERK1/2 et AKT par ERBB1 (EGFR), ERRB2 (HER2/neu), et ERBB3-4 a &eacute;t&eacute; suivie de mani&egrave;re r&eacute;solue dans le temps. Analyse de l&#39;activation de la voie par la stimulation avec le facteur de croissance &eacute;pidermique et heregulin, ou inhibition en bloquant avec le g&eacute;fitinib ou herceptin permet une caract&eacute;risation des propri&eacute;t&eacute;s signalisation distinctes des diff&eacute;rents sous-types de r&eacute;cepteurs ERBB.

Contact taches de prot&eacute;ines microarrays coupl&eacute;e avec la pointe en mati&egrave;re de prot&eacute;ines normalisateur permet l&#39;analyse temporelle de signalisation de r&eacute;cepteur ERBB.

ProteinMicroarrays erm&ouml;glichen hochgenaue Vergleich und Quantifizierung von zahlreichen biologischen Proben parallel, w&auml;hrend erfordern nur wenig Material. Dies qualifiziert Protein Arrays f&uuml;r Systembiologie und klinische Forschung, wo nur begrenzte Probenmaterial ist verf&uuml;gbar, aber eine genaue Ablesung erforderlich ist. Mit der Einf&uuml;hrung des Signal-Normalisierung-Schritte, die Tropfengr&ouml;&szlig;e von manuell Kontakt-Querzahnmolch RP Protein Arrays zu &uuml;berwachen wurde die N&uuml;tzlichkeit der Normalisierer zu gew&auml;hrleisten einen hohen Durchsatz aber preiswerte Proteinanalytik Proteine nachgewiesen. Dieser Ansatz wurde f&uuml;r die Analyse der Signalisierung &uuml;ber ERBB-Rezeptor aktiviert-Kinasen in der Brust-Krebs-Zelllinie MCF-7 angewendet. Aktivierung von ERK1/2 und AKT von ERBB1 (EGFR), ERRB2 (HER2/Neu), und ERBB3-4 wurde &uuml;berwacht, in gewissem Sinne Zeit aufgel&ouml;st. Analyse der Stoffwechselweg Aktivierung durch Stimulation mit epidermalen Wachstumsfaktor und Heregulin oder Hemmung durch die Blockade mit Gefitinib oder Herceptin erlaubt eine Einstufung der unterschiedlichen Eigenschaften der Signalisierung der ERBB-Rezeptor-Subtypen.

Kontakt Schmierblutungen Protein erlaubt gepaart mit Spitze-in der Normalisierer Protein Microarrays Zeit aufgel&ouml;st Analyse der ERBB-Rezeptor-Signalisierung.

Microarrays della proteina permettono altamente accurato confronto e quantificazione dei numerosi campioni biologici in parallelo mentre che richiedono solo poco materiale. Questa qualifica le schiere della proteina per la biologia dei sistemi e ricerca clinica dove solo materiale campione limitato &egrave; disponibile, ma una lettura precisa &egrave; necessaria. Con l&#39;introduzione di passaggi della normalizzazione segnale per monitorare la dimensione della goccia di matrici di proteina RP manualmente macchiato di contatto, &egrave; stata dimostrata l&#39;utilit&agrave; delle proteine normalizzatore per assicurare un alto rendimento ma analisi della proteina poco costoso. Questo approccio &egrave; stato applicato per l&#39;analisi dei segnali attraverso la chinasi del recettore attivato ERBB nella linea cellulare di cancro al seno MCF-7. Attivazione di ERK1/2 e di AKT da ERBB1 (EGFR), ERRB2 (HER2/neu), ed ERBB3-4 &egrave; stato monitorato in modo time-resolved. Analisi dell&#39;attivazione di pathway di stimolazione con fattore di crescita epidermico e heregulin, o inibizione bloccando con gefitinib o herceptin ha consentito una caratterizzazione delle propriet&agrave; segnalazione distinta dei diversi sottotipi di recettore ERBB.

Contatta spotting della proteina microarrays accoppiato con spike-della proteina normalizer permette analisi time-resolved di segnalazione del ricevitore ERBB.

&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED; &#x30A2;&#x30EC;&#x30A4;&#x9AD8;&#x7CBE;&#x5EA6;&#x306E;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3068;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x591A;&#x6570;&#x751F;&#x4F53;&#x8A66;&#x6599;&#x306E;&#x5C0F;&#x3055;&#x306A;&#x6750;&#x6599;&#x3060;&#x3051;&#x3092;&#x5FC5;&#x8981;&#x3068;&#x3057;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x4E26;&#x5217;&#x306B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x306F;&#x3001;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x30A2;&#x30EC;&#x30A4;&#x306E;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x30FB;&#x81E8;&#x5E8A;&#x7814;&#x7A76;&#x90E8;&#x306E;&#x307F;&#x9650;&#x5B9A;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x6750;&#x6599;&#x304C;&#x5229;&#x7528;&#x53EF;&#x80FD;&#x3067;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x6B63;&#x78BA;&#x306A;&#x8AAD;&#x307F;&#x51FA;&#x3057;&#x304C;&#x5FC5;&#x8981;&#x3067;&#x3059;&#x8CC7;&#x683C;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x624B;&#x52D5;&#x3067;&#x9023;&#x7D61;&#x5148;&#x3092;&#x767A;&#x898B; RP &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x30A2;&#x30EC;&#x30A4;&#x306E;&#x30C9;&#x30ED;&#x30C3;&#x30D7; &#x30B5;&#x30A4;&#x30BA;&#x3092;&#x76E3;&#x8996;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x4FE1;&#x53F7;&#x306E;&#x6B63;&#x898F;&#x5316;&#x624B;&#x9806;&#x306E;&#x5C0E;&#x5165;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x30CE;&#x30FC;&#x30DE;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B6;&#x30FC;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x304C;&#x5B89;&#x4FA1;&#x306A;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x89E3;&#x6790;&#x3001;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x78BA;&#x4FDD;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6709;&#x7528;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;.&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306F; ERBB &#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x4E73;&#x623F;&#x304C;&#x3093;&#x7D30;&#x80DE;&#x30E9;&#x30A4;&#x30F3; MCF-7 &#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x306E;&#x89E3;&#x6790;&#x306B;&#x9069;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;ERK1/2 &#x3068; AKT ERBB1 &#xFF08;EGFR&#xFF09;&#x3001;ERRB2 &#x3067;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316; (HER2/neu) &#x3068; ERBB3 4 &#x6642;&#x9593;&#x5206;&#x89E3;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3067;&#x76E3;&#x8996;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30B2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30C1;&#x30CB;&#x30D6;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30CF;&#x30FC;&#x30BB;&#x30D7;&#x30C1;&#x30F3;&#x3092;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x6291;&#x5236;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x523A;&#x6FC0;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x4E0A;&#x76AE;&#x6210;&#x9577;&#x56E0;&#x5B50;&#x3068; heregulin&#x3001;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x306E;&#x89E3;&#x6790;&#x7570;&#x306A;&#x308B; ERBB &#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30B5;&#x30D6;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x306E;&#x500B;&#x5225;&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0; &#x30D7;&#x30ED;&#x30D1;&#x30C6;&#x30A3;&#x306E;&#x30AD;&#x30E3;&#x30E9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30EA;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x8A31;&#x53EF;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x9023;&#x7D61;&#x5148;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x30B9;&#x30DD;&#x30C3;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0; &#x30B9;&#x30D1;&#x30A4;&#x30AF;&#x3067;&#x30CE;&#x30FC;&#x30DE;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B6;&#x30FC; &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED; &#x30A2;&#x30EC;&#x30A4; ERBB &#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x306E;&#x6642;&#x9593;&#x5206;&#x89E3;&#x89E3;&#x6790;&#x3092;&#x8A31;&#x53EF;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; microarrays &#xC791;&#xC740; &#xC18C;&#xC7AC;&#xB9CC;&#xC744; &#xC694;&#xAD6C; &#xD558;&#xBA74;&#xC11C; &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xC815;&#xD655; &#xD558; &#xAC8C; &#xBE44;&#xAD50; &#xD558; &#xACE0; &#xC218;&#xB9CE;&#xC740; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xD559;&#xC801; &#xC0D8;&#xD50C;&#xC758; &#xC815;&#xB7C9;&#xD654;&#xB97C; &#xD5C8;&#xC6A9; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBC30;&#xC5F4;&#xC744; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xC0DD;&#xBB3C;&#xD559; &#xBC0F; &#xC784;&#xC0C1; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB9CC; &#xC81C;&#xD55C; &#xB41C; &#xC0D8;&#xD50C; &#xC790;&#xB8CC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC815;&#xD655;&#xD55C; &#xD310;&#xB3C5;&#xC740; &#xD544;&#xC694;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC790;&#xACA9;. RP &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBC30;&#xC5F4; &#xC218;&#xB3D9;&#xC73C;&#xB85C; &#xC5F0;&#xB77D;&#xCC98; &#xBC1C;&#xACAC;&#xC758; &#xBC29;&#xC6B8; &#xD06C;&#xAE30;&#xB97C; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD558;&#xB294; &#xC2E0;&#xD638; &#xC815;&#xADDC;&#xD654; &#xB2E8;&#xACC4; &#xB3C4;&#xC785; &#xB418;&#xB3C4;&#xB85D; &#xC800;&#xB834; &#xD55C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBD84;&#xC11D; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; normalizer &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC720;&#xC6A9;&#xC131;&#xC774; &#xC785;&#xC99D; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xC720; &#xBC29; &#xC554; &#xC138;&#xD3EC; &#xB77C;&#xC778; MCF 7&#xC758; ERBB &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; kinases &#xD1B5;&#xD574; &#xC2E0;&#xD638; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC801;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. ERK1/2&#xC640; AKT&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; ERBB1 (EGFR), ERRB2 (HER2/neu) ERBB3 4 &#xC2DC;&#xAC04; &#xD574;&#xACB0; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBD84;&#xC11D; &#xD45C; &#xD53C; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790;&#xC640; heregulin, &#xC790;&#xADF9;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD1B5;&#xB85C; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB610;&#xB294; gefitinib &#xB610;&#xB294; herceptin&#xC744; &#xCC28;&#xB2E8; &#xD558; &#xC5EC; &#xAE08;&#xC9C0;&#xC758; &#xB2E4;&#xB978; ERBB &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xD558;&#xC704;&#xC758; &#xB69C;&#xB837;&#xD55C; &#xC2E0;&#xD638; &#xC18D;&#xC131; &#xD2B9;&#xC131; &#xD5C8;&#xC6A9;.

&#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC2A4;&#xD3EC;&#xD305; &#xC5F0;&#xB77D;&#xCC98; microarrays normalizer &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC2A4;&#xD30C;&#xC774;&#xD06C;&#xC5D0; &#xD568;&#xAED8; ERBB &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xC2E0;&#xD638; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2DC;&#xAC04; &#xD574;&#xACB0; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Microarrays de prote&iacute;nas permiten comparaci&oacute;n altamente precisa y cuantificaci&oacute;n de numerosas muestras biol&oacute;gicas en paralelo mientras que requieren solamente poco material. Esto califica matrices de prote&iacute;na para Biolog&iacute;a de sistemas y la investigaci&oacute;n cl&iacute;nica donde s&oacute;lo muestra limitada del material est&aacute; disponible, pero se requiere una lectura precisa. Con la introducci&oacute;n de medidas de normalizaci&oacute;n de se&ntilde;al para controlar el tama&ntilde;o de la gota de matrices de prote&iacute;na RP manualmente contacto con manchas, se demostr&oacute; la utilidad de las prote&iacute;nas normalizador para asegurar un alto rendimiento pero an&aacute;lisis de prote&iacute;na de bajo costo. Este enfoque se aplic&oacute; para el an&aacute;lisis de se&ntilde;alizaci&oacute;n a trav&eacute;s de quinasas de receptor activado ERBB en la l&iacute;nea de c&eacute;lulas de c&aacute;ncer de mama MCF-7. Activaci&oacute;n de ERK1/2 y AKT por ERBB1 (EGFR), ERRB2 (HER2/neu), y ERBB3-4 fue supervisada de manera resuelta en el tiempo. An&aacute;lisis de activaci&oacute;n de la v&iacute;a por estimulaci&oacute;n con factor de crecimiento epid&eacute;rmico y heregulin o inhibici&oacute;n bloqueando con gefitinib o herceptin permiti&oacute; una caracterizaci&oacute;n de las distintas propiedades de se&ntilde;alizaci&oacute;n de los diferentes subtipos de receptores ERBB.

Contacto manchas de prote&iacute;na juntada con espiga de prote&iacute;na normalizador de microarrays permite an&aacute;lisis resuelta en el tiempo de la se&ntilde;alizaci&oacute;n de receptores ERBB.

Mark Laible

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