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<em>piggyBac</em> Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Baylor College of Medicine 

&#x808C;&#x9187; 1,4,5 &#x5185;&#x53D7;&#x4F53; (InsP(3)R) &#x662F;&#x5B88;&#x6052;&#x7684;&#x4E9A;&#x57FA;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x90FD;&#x5305;&#x542B;&#x516D;&#x4E2A;&#x8DE8;&#x819C;&#x533A;&#x57DF; (&#x4EA4;&#x5F80;) &#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x7FA7;&#x57FA;&#x603B;&#x7AD9;&#x9644;&#x8FD1;&#x7684; tetrameric &#x7A0B;&#x5E8F;&#x96C6;&#x3002;&#x53D7;&#x4F53;&#x4E9A;&#x5355;&#x4F4D;&#x7EC4;&#x88C5;&#x6210;&#x56DB;&#x805A;&#x4F53;&#x4F3C;&#x4E4E;&#x662F;&#x4E00;&#x4E2A; multideterminant &#x7684;&#x8FC7;&#x7A0B;&#xFF0C;&#x6D89;&#x53CA;&#x8DE8;&#x8D8A;&#x87BA;&#x65CB;&#x548C;&#x77ED;&#x6E38;&#x79BB;&#x7FA7;&#x57FA;&#x603B;&#x7AD9; &#xFF08;&#x6B8B;&#x7559; 2590&#x5E74; 2749&#x5E74;) &#x819C;&#x6DFB;&#x52A0;&#x5242;&#x8D21;&#x732E;&#x3002;&#x4EE5;&#x524D;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x8868;&#x660E;&#xFF0C;6 &#x4E2A;&#x8DE8;&#x819C;&#x533A;&#x57DF;&#x7684;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x4E9A;&#x5355;&#x4F4D;&#xFF0C;&#x7B2C;&#x4E94;&#x548C;&#x7B2C;&#x516D;&#x5C4A;&#x8DE8;&#x819C;&#x533A;&#x57DF;&#x548C;&#x7FA7;&#x57FA;&#x603B;&#x7AD9;&#x662F;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x96C6;&#x7684;&#x5F3A;&#x51B3;&#x5B9A;&#x56E0;&#x7D20;&#x3002;&#x7B2C;&#x4E94;&#x548C;&#x7B2C;&#x516D;&#x6B21;&#x4EA4;&#x5F80;&#x5305;&#x542B;&#x8BB8;&#x591A; beta &#x5206;&#x652F;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x542B;&#x91CF;&#x53EF;&#x53C2;&#x52A0;&#x901A;&#x8FC7;&#x5047;&#x5B9A;&#x4EAE;&#x6C28;&#x9178;&#x62C9;&#x94FE;&#x56FE;&#x6848;&#x76D8;&#x7ED5;/&#x7EBF;&#x5708;&#x5F62;&#x6210;&#x3002;&#x58A8;&#x897F;&#x54E5; (3) R &#x622A;&#x65AD;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x88AB; COS-1 &#x7EC6;&#x80DE;&#x8868;&#x8FBE;&#x548C;&#x8517;&#x7CD6;&#x5BC6;&#x5EA6;&#x68AF;&#x5EA6;&#x6C89;&#x6DC0;&#x548C;&#x51DD;&#x80F6;&#x8FC7;&#x6EE4;&#x6CD5;&#x4E3A;&#x5176;&#x88C5;&#x914D;&#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x8FDB;&#x884C;&#x5206;&#x6790;&#x3002;&#x5316;&#x5B66;&#x4EA4;&#x8054;&#x4E0E;&#x540C;&#x53CC;&#x5B98;&#x80FD;&#x56E2;&#x805A;&#x8BD5;&#x5242; sDST &#x6216; DMS &#x7684;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x548C;&#x987D;&#x8868;&#x793A;&#x7FA7;&#x57FA;&#x672B;&#x7AEF;&#x542B;&#x6709;&#x53D7;&#x4F53;&#x7247;&#x6BB5;&#x663E;&#x793A;&#x5E8F;&#x5217;&#x5185;&#x7684;&#x7FA7;&#x57FA;&#x603B;&#x7AD9;&#x6388;&#x4E88;&#x4E9A;&#x57FA;&#x4E8C;&#x805A;&#x4F53;&#x7684;&#x5F62;&#x6210;&#x3002;&#x4E00;&#x7CFB;&#x5217;&#x7684; InsP(3) &#x53D7;&#x4F53;&#x7FA7;&#x57FA;&#x672B;&#x7AEF;&#x7247;&#x6BB5;&#x548C;&#x8C37;&#x80F1;&#x7518;&#x80BD; S-&#x8F6C;&#x79FB;&#x9176; (GST) / &#x58A8;&#x897F;&#x54E5; &#xFF08;3&#xFF09; R &#x5D4C;&#x5408;&#x4F53;&#x662F;&#x5728;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x4E2D;&#x8868;&#x8FBE;&#x5728;&#x4F53;&#x5916;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x7528;&#x6765;&#x6F84;&#x6E05;&#x8D1F;&#x8D23;&#x534F;&#x4F1A;&#x7684;&#x7FA7;&#x57FA;&#x603B;&#x7AD9;&#x4E3A;&#x4E8C;&#x805A;&#x4F53;&#x7684;&#x6700;&#x5C0F;&#x5E8F;&#x5217;&#x3002;&#x8FD9;&#x91CC;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x7684;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x6B64;&#x6700;&#x5C0F;&#x5E8F;&#x5217;&#x4E2D;&#x957F;&#x5EA6;&#x7EA6; 30 &#x6B8B;&#x7559;&#x548C;&#x6B8B;&#x7559; 2629&#x5E74;&#x548C; 2654&#x5E74;&#x4E4B;&#x95F4;&#x8FDB;&#x884C;&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#xFF0C;&#x5747;&#x53D7;&#x5230;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x4FDD;&#x80B2;&#x4E4B;&#x95F4;&#x4E09; (3) &#x58A8;&#x897F;&#x54E5; R &#x5F02;&#x6784;&#x4F53; &#xFF08;&#x7EA6; 80%&#x7684;&#x6807;&#x8BC6;&#xFF09; &#x4EE5;&#x53CA;&#x5170;&#x5C3C;&#x78B1;&#x53D7;&#x4F53; &#xFF08;&#x5927;&#x7EA6; 40%&#x7684;&#x6807;&#x8BC6;&#xFF09;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x5B88;&#x6052;&#x7684;&#x5927;&#x4F1A;&#x4E3B;&#x9898;&#x53EF;&#x80FD;&#x5B58;&#x5728;&#x4E24;&#x4E2A;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5185;&#x53D7;&#x4F53;&#x5BB6;&#x5EAD;&#x4E4B;&#x95F4;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x5927;&#x4F1A; InsP(3) &#x53D7;&#x4F53;&#x7684;&#x56DB;&#x805A;&#x4F53;&#x6D89;&#x53CA;&#x901A;&#x8FC7;&#x8DE8;&#x819C;&#x533A;&#x57DF;&#x548C;&#x53EF;&#x80FD;&#x901A;&#x8FC7;&#x7684;&#x4E8C;&#x805A;&#x4F53;&#x4E8C;&#x805A;&#x4F53;&#x5F62;&#x6210;&#x7684;&#x7FA7;&#x57FA;&#x603B;&#x7AD9;&#x6B8B;&#x7559; 2629&#x5E74; 2654&#x5E74;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684; intersubunit &#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

&#x7FA7;&#x57FA;&#x672B;&#x7AEF;&#x5E8F;&#x5217;&#x808C;&#x9187; 1,4,5 &#x5185;&#x53D7;&#x4F53;&#x4E9A;&#x5355;&#x4F4D;&#x5927;&#x4F1A;&#x7684;&#x5173;&#x952E;&#x3002;

The inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (InsP(3)R) is a tetrameric assembly of conserved subunits that each contains six transmembrane regions (TMRs) localized near the carboxyl terminus. Receptor subunit assembly into a tetramer appears to be a multideterminant process involving an additive contribution of membrane spanning helices and the short cytosolic carboxyl terminus (residues 2590-2749). Previous studies have shown that of the six membrane-spanning regions in each subunit, the 5th and 6th transmembrane regions, and the carboxyl terminus are strong determinants for assembly. The fifth and sixth TMRs contain numerous beta-branched amino acids that may participate in coiled/coil formation via putative leucine zipper motifs. InsP(3)R truncation mutants were expressed in COS-1 cells and analyzed by sucrose density gradient sedimentation and gel filtration for their ability to assemble. Chemical cross-linking with the homobifunctional reagents sDST or DMS of mammalian and bacterially expressed carboxyl-terminal containing receptor fragments reveals that sequences within the carboxyl terminus confer the formation of subunit dimers. A series of InsP(3) receptor carboxyl-terminal fragments and glutathione S-transferase (GST)/InsP(3)R chimeras were expressed in Escherichia coli and used in an in vitro assay to elucidate the minimal sequence responsible for association of the carboxyl termini into dimers. The results presented here indicate that this minimal sequence is approximately 30 residues in length and is localized between residues 2629 and 2654. These residues are highly conserved between the three InsP(3)R isoforms ( approximately 80% identity) as well as the ryanodine receptor ( approximately 40% identity) and suggest that a conserved assembly motif may exist between the two intracellular receptor families. We propose that assembly of the InsP(3) receptor to a tetramer involves intersubunit interactions mediated through both the membrane-spanning regions and residues 2629-2654 of the carboxyl terminus possibly through the formation of a dimer of dimers.

Carboxyl-terminal sequences critical for inositol 1,4,5-trisphosphate receptor subunit assembly.

Le r&eacute;cepteur d&#39;inositol 1,4,5-trisphosphate (InsP(3)R) est un t&eacute;tram&egrave;re assemblage de sous-unit&eacute;s conserv&eacute;es que chacun contient six r&eacute;gions transmembranaires (TMRs) localis&eacute;es pr&egrave;s de l&#39;extr&eacute;mit&eacute; carboxyle. Assemblage de sous-unit&eacute;s du r&eacute;cepteur dans un t&eacute;tram&egrave;re semble &ecirc;tre un processus multisectoriel impliquant une contribution additive de membrane s&#39;&eacute;tendant sur les h&eacute;lices et l&#39;extr&eacute;mit&eacute; carboxyle cytosolique court (r&eacute;sidus 2590-2749). Des &eacute;tudes ant&eacute;rieures ont montr&eacute; que des six r&eacute;gions transmembranaire dans chaque sous-unit&eacute;, la 5e et 6e r&eacute;gions transmembranaires et l&#39;extr&eacute;mit&eacute; carboxyle sont d&#39;importants d&eacute;terminants pour l&#39;assemblage. Les cinqui&egrave;me et sixi&egrave;me TMRs contiennent nombreux ramifi&eacute;s de b&ecirc;ta-aminoacides qui peuvent participer &agrave; la formation/bobine enroul&eacute;e par motifs de putatif leucine zipper. Mutants de troncation de R l&#39;InsP (3) ont &eacute;t&eacute; exprim&eacute;s dans les cellules COS-1 et analys&eacute;s par saccharose densit&eacute; gradient s&eacute;dimentation et filtration sur gel pour leur capacit&eacute; &agrave; assembler. R&eacute;ticulation chimique avec la sDST r&eacute;actifs homobifunctional ou DMS de mammif&egrave;res et bact&eacute;rien exprim&eacute; carboxyl terminal contenant du r&eacute;cepteur des fragments r&eacute;v&egrave;le que les s&eacute;quences au sein de l&#39;extr&eacute;mit&eacute; carboxyle conf&egrave;rent la formation de dim&egrave;res de la sous-unit&eacute;. Une s&eacute;rie de fragments de carboxyle-terminale du r&eacute;cepteur InsP(3) et glutathion S-transf&eacute;rase (GST) / R l&#39;InsP (3) chim&egrave;res &eacute;taient exprim&eacute;s chez Escherichia coli et utilis&eacute;s dans un essai in vitro pour &eacute;lucider la s&eacute;quence minimale responsable de l&#39;association des terminus carboxylique en dim&egrave;res. Les r&eacute;sultats pr&eacute;sent&eacute;s ici montrent que cette s&eacute;quence minimale est d&#39;environ 30 r&eacute;sidus de longueur et est localis&eacute;e entre les r&eacute;sidus 2629 et 2654. Ces r&eacute;sidus sont hautement conserv&eacute;es entre les trois isoformes de l&#39;InsP (3) R (environ 80 % d&#39;identit&eacute;) ainsi que le r&eacute;cepteur de la ryanodine (environ 40 % d&#39;identit&eacute;) et sugg&egrave;rent qu&#39;un motif conserv&eacute; Assembl&eacute;e pouvant exister entre les deux familles de r&eacute;cepteurs intracellulaires. Nous proposons qu&#39;assembly du r&eacute;cepteur d&#39;un t&eacute;tram&egrave;re InsP(3) implique des interactions entre m&eacute;di&eacute;e par le transmembranaire r&eacute;gions et r&eacute;sidus 2629-2654 du terminus carboxylique &eacute;ventuellement par le biais de la formation d&#39;un dim&egrave;re de dim&egrave;res.

Carboxyl&eacute;e s&eacute;quences critiques pour l&#39;assemblage de sous-unit&eacute;s inositol 1,4,5-trisphosphate du r&eacute;cepteur.

Der Inosit 1,4,5-Trisphosphate Rezeptor (InsP(3)R) ist eine tetramere Assembly konservierten Untereinheiten, dass sechs transmembrane Regionen (TMRs beinhaltet) in der N&auml;he das Carboxyl-Terminus lokalisiert. Rezeptor Untereinheit Assembly in einem Tetramer scheint ein multideterminant Prozess, der einen Additiven Beitrag der Membran spanning Helices und das kurze Zytosolische Karboxyl-Terminus (R&uuml;ckst&auml;nde 2590-2749). Fr&uuml;here Studien haben der sechs Membran-spanning Regionen gezeigt, dass in jeder Untereinheit der 5. und 6. Transmembran-Regionen und das Carboxyl-Terminus sind starke Determinanten f&uuml;r Assembly. Die f&uuml;nfte und sechste TMRs enthalten zahlreiche Beta-Verzweigte Aminos&auml;uren, die an aufgerollte/Spule Gr&uuml;ndung &uuml;ber vermeintliche Leucin Rei&szlig;verschluss Motive beteiligen kann. InsP (3) R Abschneiden Mutanten wurden in COS-1 Zellen ausgedr&uuml;ckt und analysiert von Saccharose Dichte Gradienten Sedimentation und Gel Filtration f&uuml;r ihre F&auml;higkeit zu montieren. Chemische Vernetzung mit dem Homobifunctional Reagenzien sDST oder DMS von S&auml;ugetier- und bakteriell ausgedr&uuml;ckt Karboxyl--Terminal enthaltenden Rezeptor Fragmente zeigt, dass die Sequenzen in das Carboxyl-Terminus die Bildung der Untereinheit Dimere &uuml;bertragen. Eine Reihe von InsP(3) Rezeptor Karboxyl--Terminal Fragmente und Glutathion S-Transferase (GST) / InsP (3) R Chim&auml;ren wurden in Escherichia coli ausgedr&uuml;ckt und in einer in vitro Tests verwendet, um die minimale Sequenz verantwortlich f&uuml;r die Zuordnung der Karboxyl-Endstationen in Dimere zu erhellen. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass diese minimale Sequenz ungef&auml;hr 30 R&uuml;ckst&auml;nde in der L&auml;nge ist und zwischen R&uuml;ckst&auml;nde 2629 und 2654 lokalisiert ist. Diese R&uuml;ckst&auml;nde sind stark zwischen den drei InsP (3) R-Isoformen (ca. 80 % Identit&auml;t) sowie des Ryanodin-Rezeptors (ca. 40 % Identit&auml;t) konserviert und schlagen vor, da&szlig; ein Motiv konservierten Montage zwischen die beiden Familien der intrazellul&auml;ren Rezeptor vorhanden sind. Wir schlagen vor, die Montage des InsP(3)-Rezeptors zu einem Tetramer intersubunit Interaktionen, vermittelt durch die Membran-spanning Regionen und R&uuml;ckst&auml;nde 2629-2654 &uuml;ber die Karboxyl-Terminus m&ouml;glicherweise durch die Bildung von einem Dimer Dimere beinhaltet.

Karboxyl--Terminal-Sequenzen f&uuml;r Inosit 1,4,5-Trisphosphate Rezeptor Untereinheit Versammlung von entscheidender Bedeutung.

Recettore inositolo 1.4.5-trifosfato (InsP(3)R) &egrave; un assembly tetramerica di subunit&agrave; conservate che ognuno contiene sei regioni transmembrane (TMRs) localizzate vicino al terminus carbossilico. Assemblaggio di subunit&agrave; del recettore in un tetramero sembra essere un processo multideterminant che comportano un contributo additivo della membrana spanning eliche e il capolinea della breve carbossilico citosolico (residui 2590-2749). Studi precedenti che delle sei regioni che attraversa membrana hanno dimostrato in ogni subunit&agrave;, 5 &deg; e 6 regioni transmembrane e il terminus carbossilico sono forti fattori determinanti per l&#39;assemblaggio. Il quinto e il sesto TMRs contengono numerosi gli aminoacidi ramificati beta possono partecipare alla formazione a spirale/bobina tramite motivi chiusura lampo della leucina putativo. InsP (3) R troncamento mutanti sono stati espressi in cellule COS-1 e analizzati da saccarosio densit&agrave; gradiente sedimentazione e gel filtrazione per la loro capacit&agrave; di assemblare. Chimica di reticolazione con il homobifunctional sDST reagenti o DMS di mammiferi e batterico espressa carbossi-terminale contenente recettore frammenti rivela che sequenze all&#39;interno del terminus carbossilico conferiscono la formazione di dimeri di subunit&agrave;. Una serie di frammenti di carbossi-terminale del recettore InsP(3) e glutatione S-transferasi (GST) / R InsP (3) chimere erano espresse in Escherichia coli e utilizzate in un test in vitro per delucidare la sequenza minima responsabile dell&#39;associazione di termini carbossilico in dimeri. I risultati presentati qui indicano che questa sequenza minima &egrave; di circa 30 residui di lunghezza ed &egrave; localizzata tra residui 2629 e 2654. Questi residui sono altamente conservati tra le tre isoforme di InsP (3) R (circa 80% identit&agrave;) cos&igrave; come il recettore rianodinico (circa 40% identit&agrave;) e suggeriscono che un motivo conservato assieme possa esistere tra le due famiglie di recettori intracellulari. Proponiamo che Assemblea del recettore InsP(3) a un tetramero coinvolge interazioni intersubunit mediate attraverso la membrana che attraversa regioni sia residui 2629-2654 del terminus carbossilico possibilmente attraverso la formazione di un dimero di dimeri.

Carbossi-terminale sequenze critiche per l&#39;assemblaggio di subunit&agrave; inositolo 1.4.5-trifosfato del recettore.

&#xFF08;InsP(3)R) &#x5404;&#x30AB;&#x30EB;&#x30DC;&#x30AD;&#x30B7;&#x30EB;&#x57FA;&#x672B;&#x7AEF;&#x8FD1;&#x304F;&#x306B;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BA; 6 &#x819C;&#x8CAB;&#x901A;&#x9818;&#x57DF; (TMRs) &#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x4FDD;&#x5B58;&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E; 4 &#x91CF;&#x4F53;&#x7D44;&#x7ACB;&#x3067;&#x3059;&#x3002; &#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB; 1,4,5 &#x30C8;&#x30EA;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x96C6;&#x5408; 4 &#x91CF;&#x4F53;&#x306B;&#x306F;&#x3001;multideterminant &#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306A;&#x6DFB;&#x52A0;&#x7269;&#x306E;&#x8CA2;&#x732E;&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3068;&#x77ED;&#x3044;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30BE;&#x30EB; &#x30AB;&#x30EB;&#x30DC;&#x30AD;&#x30B7;&#x30EB;&#x57FA;&#x5074; &#xFF08;2590&#x5E74; 2749&#x5E74;&#x6B8B;&#x57FA;&#xFF09; &#x306B;&#x307E;&#x305F;&#x304C;&#x308B;&#x819C;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x304C;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4EE5;&#x524D;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x516D;&#x3064;&#x306E;&#x819C;&#x8CAB;&#x901A;&#x9818;&#x57DF;&#x306E;&#x5404;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3067; 5 &#x65E5;&#x3068; 6 &#x65E5;&#x306E;&#x819C;&#x8CAB;&#x901A;&#x9818;&#x57DF;&#x3068;&#x30AB;&#x30EB;&#x30DC;&#x30AD;&#x30B7;&#x30EB;&#x57FA;&#x5074;&#x5F37;&#x3044;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x8981;&#x56E0;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;5 &#x756A;&#x76EE;&#x3068; 6 &#x756A;&#x76EE;&#x306E; TMRs &#x63A8;&#x5B9A;&#x30ED;&#x30A4;&#x30B7;&#x30F3; &#x30B8;&#x30C3;&#x30D1;&#x30FC; &#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x30B3;&#x30A4;&#x30EB;&#x30C9; &#x30B3;&#x30A4;&#x30EB;&#x5F62;&#x6210;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x591A;&#x6570;&#x30D9;&#x30FC;&#x30BF;&#x5206;&#x5C90;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x3092;&#x542B;&#x307F;&#x307E;&#x3059;&#x3002;InsP (3) R &#x5207;&#x308A;&#x6368;&#x3066;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306F;&#x3001;COS 1 &#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x767A;&#x73FE;&#x3057;&#x3001;&#x30B7;&#x30E7;&#x7CD6;&#x5BC6;&#x5EA6;&#x52FE;&#x914D;&#x6C88;&#x964D;&#x3068;&#x30B2;&#x30EB;&#x308D;&#x904E;&#x80FD;&#x529B;&#x3092;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EB;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5206;&#x6790;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5316;&#x5B66; homobifunctional &#x8A66;&#x85AC; sDST &#x307E;&#x305F;&#x306F; DMS &#x306E;&#x54FA;&#x4E73;&#x985E;&#x3068;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x67B6;&#x6A4B;&#x30AB;&#x30EB;&#x30DC;&#x30AD;&#x30B7;&#x30EB;&#x672B;&#x7AEF;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30D5;&#x30E9;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8; &#x30EA;&#x30D3;&#x30FC;&#x30EB; &#x30AB;&#x30EB;&#x30DC;&#x30AD;&#x30B7;&#x30EB;&#x57FA;&#x5074;&#x5185;&#x306E;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E; 2 &#x91CF;&#x4F53;&#x5F62;&#x6210;&#x5354;&#x8B70;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x8868;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x4E00;&#x9023;&#x306E; InsP(3) &#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x30AB;&#x30EB;&#x30DC;&#x30AD;&#x30B7;&#x30EB;&#x672B;&#x7AEF;&#x65AD;&#x7247;&#x3068;&#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3; s-&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; (GST)/InsP (3) R &#x30AD;&#x30E1;&#x30E9;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x3067;&#x767A;&#x73FE;&#x3055;&#x308C;&#x3001;in vitro &#x8A66;&#x9A13;&#x3067;&#x6700;&#x5C0F;&#x9650;&#x306E;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9; &#x30C0;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x306B;&#x30AB;&#x30EB;&#x30DC;&#x30AD;&#x30B7;&#x30EB;&#x57FA;&#x30C6;&#x30EB;&#x30DF;&#x30CB;&#x306E;&#x5354;&#x4F1A;&#x306E;&#x8CAC;&#x4EFB;&#x3092;&#x89E3;&#x660E;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x306B;&#x63D0;&#x793A;&#x7D50;&#x679C;&#x304B;&#x3089;&#x3053;&#x306E;&#x6700;&#x5C0F;&#x9650;&#x306E;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306F;&#x9577;&#x3055;&#x7D04; 30 &#x6B8B;&#x57FA;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x6B8B;&#x7559; 2629&#x5E74;&#x3068; 2654&#x5E74;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BA;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306F;&#x30EA;&#x30A2;&#x30CE;&#x30B8;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53; &#xFF08;&#x7D04; 40 &#xFF05; &#x306E;&#x30A2;&#x30A4;&#x30C7;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A3;&#x30C6;&#x30A3;&#xFF09; &#x3060;&#x3051;&#x3067;&#x306A;&#x304F;&#x306E; 3 &#x3064;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D4; (3) R &#x30A2;&#x30A4;&#x30BD; &#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0; (&#x7D04; 80% &#x30A2;&#x30A4;&#x30C7;&#x30F3;&#x30C6;&#x30A3;&#x30C6;&#x30A3;) &#x9593;&#x306E;&#x4FDD;&#x5B58;&#x6027;&#x304C;&#x9AD8;&#x3044;&#x3068;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA; &#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x4E21;&#x5BB6;&#x306E;&#x9593;&#x5B58;&#x5728;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x304A;&#x52E7;&#x3081;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x63D0;&#x6848;&#x3059;&#x308B; 4 &#x91CF;&#x4F53;&#x3078;&#x306E; InsP(3) &#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x819C;&#x8CAB;&#x901A;&#x9818;&#x57DF;&#x3068;&#x6B8B; 2629&#x5E74;-2654&#x5E74;&#x57FA;&#x3001;&#x30AB;&#x30EB;&#x30DC;&#x30AD;&#x30B7;&#x30EB;&#x57FA;&#x91CF;&#x4F53;&#x306E;&#x5F62;&#x6210;&#x3092;&#x304A;&#x305D;&#x3089;&#x304F;&#x7D4C;&#x7531;&#x3092;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B; intersubunit &#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x4F34;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30AB;&#x30EB;&#x30DC;&#x30AD;&#x30B7;&#x30EB;&#x57FA;&#x672B;&#x7AEF;&#x914D;&#x5217;&#x30A4;&#x30CE;&#x30B7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30EB; 1,4,5 &#x30C8;&#x30EA;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x96C6;&#x5408;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

Inositol 1,4,5 trisphosphate &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; (Insp(3)r)&#xB294; &#xAC01;&#xAC01; carboxyl &#xC885;&#xC810; &#xADFC;&#xCC98; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; 6 &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; &#xC601;&#xC5ED; (TMRs)&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xBCF4;&#xC874;&#xB41C; subunits&#xC758; tetrameric &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xB97C; tetramer&#xB85C; multideterminant &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4; &#xD3EC;&#xD568; &#xBC0F; &#xC9E7;&#xC740; cytosolic carboxyl &#xC885;&#xC810; (&#xC794;&#xB958;&#xBB3C; 2590-2749) &#xB9C9;&#xC758; &#xCCA8;&#xAC00;&#xC81C; &#xAE30;&#xC5EC;&#xC640; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xAC83; &#xAC19;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xC804; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB294; 6 &#xB9C9;&#xC5D0; &#xAC78;&#xCE5C; &#xC9C0;&#xC5ED; &#xAC01; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC5D0; 5&#xC640; 6 &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; &#xC601;&#xC5ED; &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; carboxyl &#xC885;&#xCC29;&#xC5ED;&#xC740; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xACB0;&#xC815; &#xC694;&#xC778;. &#xB2E4;&#xC12F; &#xBC88;&#xC9F8; &#xBC0F; &#xC5EC;&#xC12F; &#xBC88;&#xC9F8; TMRs &#xD3EC;&#xD568; &#xC218;&#xB9CE;&#xC740; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xCE21; &#xC1C4; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0;&#xC744; &#xC0C1; &#xC2E0; &#xC9C0;&#xD37C; &#xBAA8;&#xD2F0;&#xBE0C;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xCF54;&#xC77C;/&#xCF54;&#xC77C; &#xD615;&#xC131;&#xC5D0; &#xCC38;&#xC5EC;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. InsP (3) R &#xC798;&#xB9BC; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; COS 1 &#xC140;&#xC5D0; &#xD45C;&#xD604; &#xB418;&#xC5C8;&#xACE0; &#xC5EC; &#xC790;&#xB2F9; &#xBC00;&#xB3C4; &#xADF8;&#xB77C;&#xB370;&#xC774;&#xC158; &#xCE68;&#xC804; &#xBC0F; &#xC824;&#xACFC; &#xC870;&#xB9BD; &#xD558;&#xB294; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBD84;&#xC11D;. &#xD3EC;&#xC720;&#xB958;&#xC640; bacterially homobifunctional &#xC2DC; &#xC57D; sDST &#xB610;&#xB294; &#xB514; &#xC5E0;&#xC5D0; &#xC2A4; &#xC0C1;&#xD638; &#xD654;&#xD559; carboxyl-&#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xC870;&#xAC01;&#xC774; &#xBC1D;&#xD600;&#xB97C; carboxyl &#xC885;&#xC810;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; &#xC774;&#xD569;&#xCCB4;&#xC758; &#xD615;&#xC131;&#xC744; &#xBD80;&#xC5EC;&#xB97C; &#xD45C;&#xBA85; &#xD588;&#xB2E4;. InsP(3) &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; carboxyl &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xC870;&#xAC01;&#xACFC; glutathione S-&#xC804;&#xC774; (GST) &#xC2DC;&#xB9AC;&#xC988; / InsP (3) R &#xD0A4;&#xBA54;&#xB77C; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0;&#xC5D0; &#xD45C;&#xD604; &#xB418;&#xC5C8;&#xACE0; &#xCCB4; &#xC678; &#xC2DC;&#xD5D8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC774;&#xD569;&#xCCB4;&#xC5D0; carboxyl &#xD14C;&#xB974;&#xBBF8;&#xB2C8;&#xC758; &#xD611;&#xD68C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCC45;&#xC784; &#xCD5C;&#xC18C;&#xD55C;&#xC758; &#xC21C;&#xC11C;&#xB97C; &#xBA85;&#xB8CC; &#xD558; &#xAC8C; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0; &#xC81C;&#xC2DC; &#xB41C; &#xACB0;&#xACFC;&#xC774; &#xCD5C;&#xC18C;&#xD55C;&#xC758; &#xC21C;&#xC11C;&#xB294; &#xAE38;&#xC774;&#xAC00; &#xC57D; 30 &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; 2629 &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; 2654 &#xC0AC;&#xC774; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; ryanodine &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; (&#xC57D; 40% &#xC815;&#xCCB4;&#xC131;) &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; 3 InsP (3) R isoforms (&#xC57D; 80% &#xC815;&#xCCB4;&#xC131;) &#xAC04;&#xC5D0; &#xACE0;&#xB3C4;&#xB85C; &#xBCF4;&#xC874; &#xD558; &#xACE0; &#xBCF4;&#xC874;&#xB41C; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC; &#xBAA8;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xB450; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xAC00;&#xC871; &#xC0AC;&#xC774; &#xC874;&#xC7AC;&#xD560; &#xC218;&#xB294; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xB294; tetramer&#xC5D0; InsP(3) &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC758; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xAC78;&#xCE5C; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xC640; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; 2629-2654 &#xC774;&#xD569;&#xCCB4; dimer &#xD615;&#xC131;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC544;&#xB9C8;&#xB3C4; carboxyl &#xC885;&#xC810;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC911;&#xC7AC; intersubunit &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xC81C;&#xC548; &#xD55C;&#xB2E4;.

Carboxyl &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; inositol 1,4,5 trisphosphate &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C;.

El receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (InsP(3)R) es una Asamblea tetram&eacute;rica de subunidades conservados que cada una contiene seis regiones transmembrana (TMRs) localizadas cerca de la terminal de carboxilo. Asamblea de la subunidad del receptor en un tetr&aacute;mero parece ser un proceso multideterminant que implica una contribuci&oacute;n aditiva de membrana h&eacute;lices y la terminal de carboxilo citos&oacute;lica corto (residuos 2590-2749). Estudios previos han demostrado que de las seis regiones que atraviesan la membrana en cada subunidad, la Quinta y sexta regiones transmembrana y la terminal carboxilo son determinantes fuertes para el montaje. Los quinto y sexto TMRs contienen numerosas ramas beta amino&aacute;cidos que pueden participar en la formaci&oacute;n en espiral/bobina por motivos de cremallera de leucina putativos. InsP (3) R truncamiento mutantes fueron expresadas en las c&eacute;lulas COS-1 y analizados por sacarosa densidad gradiente sedimentaci&oacute;n y gel filtraci&oacute;n por su capacidad para montar. Reticulaci&oacute;n qu&iacute;mica con el homobifunctional reactivos sDST o DMS de mam&iacute;feros y bacteriano expres&oacute; carboxilo-terminal contiene receptores fragmentos revela que secuencias dentro de la terminal de carboxilo confieren la formaci&oacute;n de d&iacute;meros de subunidad. Una serie de fragmentos de carboxilo terminal del receptor InsP(3) y glutati&oacute;n S-transferasa (GST) / InsP (3) R quimeras fueron expresados en Escherichia coli y utilizados en un ensayo in vitro para aclarar la secuencia m&iacute;nima responsable de la Asociaci&oacute;n de los t&eacute;rminos de carboxilo en d&iacute;meros. Los resultados aqu&iacute; presentados indican que esta secuencia m&iacute;nima es aproximadamente 30 residuos de longitud y se localiza entre residuos 2629 y 2654. Estos residuos est&aacute;n muy conservados entre las tres isoformas de InsP (3) R (aproximadamente 80% de identidad), as&iacute; como el receptor de rianodina (aproximadamente 40% de identidad) y sugieren que puede existir un motivo de la Asamblea conservado entre las dos familias de receptores intracelulares. Proponemos que el montaje del receptor InsP(3) a un tetr&aacute;mero implica intersubunit interacciones mediadas a trav&eacute;s de la membrana que abarca regiones tanto residuos 2629-2654 del terminal carboxilo posiblemente a trav&eacute;s de la formaci&oacute;n de un d&iacute;mero de d&iacute;meros.

Carboxilo-terminal secuencias cr&iacute;ticas para el montaje de inositol 1,4,5-trifosfato receptor subunidad.

Topi con una mutazione di ipertermia maligna (Y522S) nel recettore rianodinico (RyR1) visualizzare le contratture muscolari, rabdomiolisi e morte in risposta a temperature ambientali elevate. Dimostriamo che questa mutazione RyR1 causa perdita di Ca(2+), che spinge maggiore generazione di specie reattive dell&#39;azoto (RNS). Successive S-nitrosilazione di RyR1 mutante aumenta la sensibilit&agrave; di temperatura per attivazione, producono contratture muscolari all&#39;esposizione a temperature elevate. La mutazione Y522S nell&#39;uomo &egrave; associata con malattia del nucleo centrale. Molti mitocondri nei muscoli di topi Y522S eterozigoti sono gonfi e deformi. Le esposizioni di mutante muscolare diminuita produzione di forza ed aumentato la perossidazione lipidica mitocondriale con l&#39;invecchiamento. Trattamento cronico con N-acetilcisteina protegge contro il danno ossidativo mitocondriale e il declino della generazione di forza. Proponiamo un meccanismo di feed-forward ciclico che aumenta la sensibilit&agrave; di temperatura di attivazione RyR1 e sottende il colpo di calore e morte improvvisa. Il ciclo alla fine produce una miopatia con mitocondri danneggiati.

RyR1 S-nitrosilazione sottende il colpo di calore ambientale e morte improvvisa nei topi knockin Y522S RyR1.

&#xC950; ryanodine &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; (RyR1)&#xC5D0;&#xC11C; &#xC545;&#xC131; &#xACE0; &#xC5F4; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; (Y522S)&#xC640; &#xACE0;&#xC628; &#xD658;&#xACBD;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC751;&#xB2F5; &#xADFC;&#xC721; contractures, rhabdomyolysis, &#xBC0F; &#xC8FD;&#xC74C;&#xC744; &#xD45C;&#xC2DC;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Ryr1&#xC5D0;&#xC774; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC6D0;&#xC778; Ca(2+) &#xB204;&#xC218; &#xC99D;&#xAC00; &#xC138;&#xB300; &#xBC18;&#xC751;&#xC131; &#xC9C8;&#xC18C; &#xC885; (RNS)&#xC758; &#xB4DC;&#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. RyR1 &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xD6C4;&#xC18D; S nitrosylation &#xB192;&#xC740; &#xC628;&#xB3C4;&#xC5D0; &#xB178;&#xCD9C; &#xB418; &#xBA74; &#xADFC;&#xC721; contractures &#xC0DD;&#xC0B0; &#xD65C;&#xC131;&#xD654;&#xB97C; &#xC704;&#xD574; &#xC628;&#xB3C4; &#xAC10;&#xB3C4; &#xC99D;&#xAC00; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Y522S &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC778;&#xAC04;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC911;&#xC559; &#xCF54;&#xC5B4; &#xC9C8;&#xBCD1;&#xC5D0; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. Heterozygous Y522S &#xC950;&#xC758; &#xADFC;&#xC721;&#xC5D0; &#xB9CE;&#xC740; &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC;&#xB9AC; &#xC544; &#xBD80; &#xC5B4; &#xD558; &#xACE0; &#xACB0;&#xD568;&#xC774; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xADFC;&#xC721; &#xD45C;&#xC2DC; &#xAC15;&#xC81C;&#xB85C; &#xC0DD;&#xC0B0;&#xC744; &#xAC10;&#xC18C; &#xD558; &#xACE0; &#xB178;&#xD654;&#xC640; &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC;&#xB9AC; &#xC544; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xACFC;&#xC0B0;&#xD654;&#xB97C; &#xC99D;&#xAC00;. N &#xC9C4; &#xB9CC;&#xC131; &#xCE58;&#xB8CC; &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC; &#xB9AC;&#xC544; &#xC0B0;&#xD654; &#xC190;&#xC0C1; &#xBC0F; &#xAC15;&#xC81C; &#xC0DD;&#xC131; &#xAC10;&#xC18C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBCF4;&#xD638;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; RyR1 &#xD65C;&#xC131;&#xD654;&#xC758; &#xC628;&#xB3C4; &#xAC10;&#xB3C4; &#xC99D;&#xAC00; &#xD558; &#xACE0; &#xC77C;&#xC0AC;&#xBCD1;&#xACFC; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xC758; &#xAE30;&#xCD08;&#xAC00; &#xB418;&#xB294; &#xD53C;&#xB4DC; &#xD3EC;&#xC6CC;&#xB4DC; &#xC21C;&#xD658; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; &#xC81C;&#xC548; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC0AC;&#xC774;&#xD074; &#xACB0;&#xAD6D; &#xC190;&#xC0C1; &#xB41C; &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC;&#xB9AC; &#xC544;&#xC640; myopathy&#xB97C; &#xC0DD;&#xC131;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

RyR1 S nitrosylation &#xAE30;&#xCD08; &#xD658;&#xACBD; &#xC77C;&#xC0AC;&#xBCD1;&#xACFC; Y522S RyR1 knockin &#xC950;&#xC758; &#xAC11;&#xC791;&#xC2A4;&#xB7F0; &#xC8FD;&#xC74C;.

&#x30EA;&#x30A2;&#x30CE;&#x30B8;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53; (RyR1) &#x306E;&#x60AA;&#x6027;&#x9AD8;&#x71B1;&#x75C7;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570; (Y522S) &#x3068;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x7B4B;&#x62D8;&#x7E2E;&#x3001;&#x6A2A;&#x7D0B;&#x7B4B;&#x878D;&#x89E3;&#x3068;&#x6B7B;&#x74B0;&#x5883;&#x6E29;&#x306E;&#x5FDC;&#x7B54;&#x306B;&#x8868;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x3053;&#x306E; RyR1 &#x306E;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x53CD;&#x5FDC;&#x6027;&#x7A92;&#x7D20;&#x7A2E; (RNS) &#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x4E16;&#x4EE3;&#x30C9;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6; &#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0; &#x30EA;&#x30FC;&#x30AF;&#x306E;&#x539F;&#x56E0;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5F8C;&#x7D9A;&#x306E; S &#x30CB;&#x30C8;&#x30ED;&#x30B7;&#x30EB;&#x5909;&#x7570;&#x4F53; RyR1 &#x306E;&#x6E29;&#x5EA6;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x611F;&#x5EA6;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x3001;&#x9AD8;&#x6E29;&#x3078;&#x306E;&#x9732;&#x51FA;&#x306B;&#x7B4B;&#x8089;&#x306E;&#x62D8;&#x7E2E;&#x306E;&#x751F;&#x7523;&#x304C;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E; Y522S &#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x306F;&#x3001;&#x4E2D;&#x592E;&#x306E;&#x30B3;&#x30A2;&#x306E;&#x75C5;&#x6C17;&#x3068;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2; Y522S &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x6B20;&#x640D;&#x30D8;&#x30C6;&#x30ED;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x306E;&#x7B4B;&#x306F;&#x3001;&#x816B;&#x308C;&#x3001;&#x4E0D;&#x683C;&#x597D;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306E;&#x7B4B;&#x8089;&#x304C;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x306F;&#x751F;&#x7523;&#x529B;&#x304C;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x305F;&#x3057;&#x3001;&#x52A0;&#x9F62;&#x306B;&#x4F34;&#x3046;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;&#x306E;&#x8102;&#x8CEA;&#x904E;&#x9178;&#x5316;&#x304C;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6162;&#x6027;&#x51E6;&#x7F6E;&#x306B;&#x3088;&#x308B; N-&#x30A2;&#x30BB;&#x30C1;&#x30EB;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3; &#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;&#x306E;&#x9178;&#x5316;&#x7684;&#x640D;&#x50B7;&#x3068;&#x529B;&#x767A;&#x751F;&#x306E;&#x4E0B;&#x843D;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057;&#x3066;&#x4FDD;&#x8B77;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;RyR1 &#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x6E29;&#x5EA6;&#x611F;&#x53D7;&#x6027;&#x304C;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x3001;&#x71B1;&#x8133;&#x5352;&#x4E2D;&#x3001;&#x7A81;&#x7136;&#x6B7B;&#x306E;&#x6839;&#x5E95;&#x306B;&#x3042;&#x308B;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x30C9; &#x30D5;&#x30A9;&#x30EF;&#x30FC;&#x30C9;&#x7E70;&#x8FD4;&#x3057;&#x6A5F;&#x69CB;&#x3092;&#x63D0;&#x6848;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x306F;&#x6700;&#x7D42;&#x7684;&#x306B;&#x7834;&#x640D;&#x3057;&#x305F;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;&#x306E;&#x30DF;&#x30AA;&#x30D1;&#x30B7;&#x30FC;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

RyR1 S &#x30CB;&#x30C8;&#x30ED;&#x30B7;&#x30EB;&#x74B0;&#x5883;&#x71B1;&#x5C04;&#x75C5;&#x304A;&#x3088;&#x3073; Y522S RyR1 &#x30CE;&#x30C3;&#x30AF;&#x30A4;&#x30F3; &#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x306E;&#x7A81;&#x7136;&#x306E;&#x6B7B;&#x6839;&#x5E95;&#x306B;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x5170;&#x5C3C;&#x78B1;&#x53D7;&#x4F53; (RyR1) &#x4E2D;&#x7684;&#x6076;&#x6027;&#x9AD8;&#x70ED;&#x7A81;&#x53D8; (Y522S) &#x4E0E;&#x5C0F;&#x9F20;&#x5728;&#x73AF;&#x5883;&#x6E29;&#x5EA6;&#x5347;&#x9AD8;&#x7684;&#x54CD;&#x5E94;&#x4E2D;&#x663E;&#x793A;&#x808C;&#x8089;&#x631B;&#x7F29;&#x3001; &#x6A2A;&#x7EB9;&#x808C;&#x6EB6;&#x89E3;&#x75C7;&#x548C;&#x6B7B;&#x4EA1;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BC1;&#x660E;&#x5728; RyR1 &#x8FD9;&#x4E2A;&#x7A81;&#x53D8;&#x5BFC;&#x81F4;&#x7ECF;&#x6CC4;&#x6F0F;&#xFF0C;&#x8FDB;&#x800C;&#x589E;&#x52A0;&#x7684;&#x751F;&#x6210;&#x7684;&#x6D3B;&#x6027;&#x6C2E;&#x7269;&#x79CD; &#xFF08;&#x62A4;&#x58EB;&#xFF09;&#x3002;&#x968F;&#x540E; S nitrosylation RyR1 &#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x589E;&#x52A0;&#x6FC0;&#x6D3B;&#xFF0C;&#x5176;&#x6E29;&#x5EA6;&#x654F;&#x611F;&#x6027;&#x751F;&#x4EA7;&#x65F6;&#x66B4;&#x9732;&#x5728;&#x9AD8;&#x6E29;&#x7684;&#x808C;&#x8089;&#x631B;&#x7F29;&#x3002;&#x5728;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x4E2D;&#x7684; Y522S &#x7A81;&#x53D8;&#x662F;&#x4E0E;&#x4E2D;&#x592E;&#x6838;&#x5FC3;&#x75BE;&#x75C5;&#x76F8;&#x5173;&#x8054;&#x3002;&#x8BB8;&#x591A;&#x7684;&#x6742;&#x5408;&#x6027; Y522S &#x5C0F;&#x9F20;&#x808C;&#x8089;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x4E2D;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x80BF;&#x80C0;&#x548C;&#x7578;&#x5F62;&#x3002;&#x5728;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x808C;&#x8089;&#x663E;&#x793A;&#x6B66;&#x529B;&#x4EA7;&#x91CF;&#x4E0B;&#x964D;&#x548C;&#x589E;&#x52A0;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x8102;&#x8D28;&#x8FC7;&#x6C27;&#x5316;&#x4E0E;&#x8870;&#x8001;&#x3002;N-&#x4E59;&#x9170;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x6CBB;&#x7597;&#x6162;&#x6027;&#x53EF;&#x9632;&#x6B62;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x6C27;&#x5316;&#x635F;&#x4F24;&#x548C;&#x90E8;&#x961F;&#x7EC4;&#x5EFA;&#x7684;&#x8DCC;&#x5E45;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x524D;&#x9988;&#x5FAA;&#x73AF;&#x673A;&#x5236;&#xFF0C;&#x589E;&#x52A0; RyR1 &#x6D3B;&#x5316;&#x7684;&#x6E29;&#x5EA6;&#x654F;&#x611F;&#x6027;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4E14;&#x662F;&#x4E2D;&#x6691;&#x548C;&#x731D;&#x6B7B;&#x7684;&#x57FA;&#x7840;&#x3002;&#x6700;&#x7EC8;&#x7684;&#x5468;&#x671F;&#x4EA7;&#x751F;&#x635F;&#x574F;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x808C;&#x75C5;&#x3002;

RyR1 S nitrosylation &#x662F;&#x57FA;&#x7840;&#x73AF;&#x5883;&#x4E2D;&#x6691;&#x548C; Y522S RyR1 knockin &#x5C0F;&#x9F20;&#x7684;&#x7A81;&#x7136;&#x6B7B;&#x4EA1;&#x3002;

Mice with a malignant hyperthermia mutation (Y522S) in the ryanodine receptor (RyR1) display muscle contractures, rhabdomyolysis, and death in response to elevated environmental temperatures. We demonstrate that this mutation in RyR1 causes Ca(2+) leak, which drives increased generation of reactive nitrogen species (RNS). Subsequent S-nitrosylation of the mutant RyR1 increases its temperature sensitivity for activation, producing muscle contractures upon exposure to elevated temperatures. The Y522S mutation in humans is associated with central core disease. Many mitochondria in the muscle of heterozygous Y522S mice are swollen and misshapen. The mutant muscle displays decreased force production and increased mitochondrial lipid peroxidation with aging. Chronic treatment with N-acetylcysteine protects against mitochondrial oxidative damage and the decline in force generation. We propose a feed-forward cyclic mechanism that increases the temperature sensitivity of RyR1 activation and underlies heat stroke and sudden death. The cycle eventually produces a myopathy with damaged mitochondria.

RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice.

Souris pr&eacute;sentant une mutation de l&#39;hyperthermie maligne (Y522S) dans le r&eacute;cepteur &agrave; la ryanodine (RyR1) affichent les contractures musculaires, rhabdomyolyse et mort en r&eacute;ponse &agrave; des temp&eacute;ratures ambiantes &eacute;lev&eacute;es. Nous d&eacute;montrons que cette mutation &agrave; RyR1 provoque la fuite de Ca(2+), ce qui entra&icirc;ne une production accrue d&#39;esp&egrave;ces r&eacute;actives de l&#39;azote (RNS). S-nitrosylation ult&eacute;rieure du mutant RyR1 augmente sa sensibilit&eacute; &agrave; la temp&eacute;rature pour l&#39;activation, produisant des contractures musculaires lors de l&#39;exposition &agrave; des temp&eacute;ratures &eacute;lev&eacute;es. La mutation de Y522S chez l&#39;homme est associ&eacute;e &agrave; central core disease. Nombreuses mitochondries dans les muscles des souris h&eacute;t&eacute;rozygotes de Y522S sont gonfl&eacute;es et difformes. Les affichages de mutant muscle diminue la production de force et a augment&eacute; la peroxydation des lipides mitochondriale avec le vieillissement. Un traitement chronique avec la N-ac&eacute;tylcyst&eacute;ine prot&egrave;ge contre les l&eacute;sions oxydatives mitochondriales et la baisse de production de force. Nous proposons un m&eacute;canisme cyclique feed-forward qui augmente la sensibilit&eacute; &agrave; la temp&eacute;rature d&#39;activation RyR1 et sous-tend les coups de chaleur et de la mort subite. Le cycle a finalement produit une myopathie avec les mitochondries endommag&eacute;s.

RyR1 S-nitrosylation sous-tend l&#39;environnement coup de chaleur et de la mort subite chez les souris knockin Y522S RyR1.

M&auml;use mit eine maligne Hyperthermie-Mutation (Y522S) in den Ryanodin-Rezeptor (RyR1) zeigen Muskeln Kontrakturen, Rhabdomyolyse und Tod als Reaktion auf erh&ouml;hten &ouml;kologischen Temperaturen. Wir zeigen, dass diese Mutation im RyR1 Ca(2+) Leck, verursacht die erh&ouml;hte Generation von reaktiven Stickstoff-Spezies (RNS) antreibt. Nachfolgende S-Nitrosylation von den Mutanten RyR1 erh&ouml;ht seine Temperaturempfindlichkeit f&uuml;r die Aktivierung Muskel Kontrakturen nach Exposition gegen&uuml;ber hohen Temperaturen produzieren. Die Y522S-Mutation beim Menschen ist central Core Disease zugeordnet. Viele Mitochondrien im Muskel heterozygote Y522S M&auml;use sind geschwollen und ungestalt. Der mutant Muskel-Displays verringerte Kraft Produktion und mitochondriale Lipidperoxidation mit dem &Auml;lterwerden erh&ouml;ht. Chronische Behandlung mit N-Acetylcystein sch&uuml;tzt gegen Mitochondrien oxidative Sch&auml;den und der R&uuml;ckgang der Streitkr&auml;fteaufwuchs. Wir schlagen einen Feed-Forward zyklischen Mechanismus, der erh&ouml;ht die Temperaturempfindlichkeit des RyR1-Aktivierung und zugrunde liegt, Hitzschlag und pl&ouml;tzlicher Tod. Der Zyklus schlie&szlig;lich produziert eine Myopathie mit besch&auml;digten Mitochondrien.

RyR1 S-Nitrosylation zugrunde liegt, &ouml;kologische Hitzschlag und pl&ouml;tzlichen Tod im Y522S RyR1 knockin M&auml;use.

Ratones con una mutaci&oacute;n de la hipertermia maligna (Y522S) en el receptor de rianodina (RyR1) Mostrar contracturas musculares, rabdomi&oacute;lisis y muerte en respuesta a temperaturas ambientales elevadas. Demostramos que esta mutaci&oacute;n en RyR1 causa fuga de CA, que conduce la mayor generaci&oacute;n de especies reactivas del nitr&oacute;geno (RNS). S-nitrosilaci&oacute;n posterior del mutante RyR1 aumenta su sensibilidad de temperatura para la activaci&oacute;n, produciendo las contracciones del m&uacute;sculo con la exposici&oacute;n a temperaturas elevadas. La mutaci&oacute;n de Y522S en los seres humanos se asocia a enfermedad del n&uacute;cleo central. Muchas mitocondrias en el m&uacute;sculo de ratones heterocigotos de Y522S hinchadas y deforme. Las pantallas de m&uacute;sculo mutante redujo la producci&oacute;n de fuerza y aumentaron la peroxidaci&oacute;n lip&iacute;dica mitocondrial con el envejecimiento. Tratamiento cr&oacute;nico con N-acetilciste&iacute;na protege contra el da&ntilde;o oxidativo mitocondrial y la disminuci&oacute;n en la generaci&oacute;n de fuerza. Proponemos un mecanismo feed-forward c&iacute;clico que aumenta la sensibilidad de la temperatura de activaci&oacute;n RyR1 y subyace la insolaci&oacute;n y muerte s&uacute;bita. El ciclo eventualmente produce una Miopat&iacute;a con mitocondrias da&ntilde;adas.

RyR1 S-nitrosilaci&oacute;n subyace a golpe de calor ambiental y muerte s&uacute;bita en ratones knockin Y522S RyR1.

PiggyBac &#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x8868;&#x793A;&#x57FA;&#x56E0;&#x4F20;&#x9012;&#x4E0E;&#x53D1;&#x73B0;&#x3001; &#x6709;&#x524D;&#x9014;&#x7684;&#x975E;&#x75C5;&#x6BD2;&#x5DE5;&#x5177;&#xFF0C;&#x4E5F;&#x53EF;&#x80FD;&#x4E3A;&#x4E34;&#x5E8A;&#x57FA;&#x56E0;&#x6CBB;&#x7597;&#x7684;&#x4EF7;&#x503C;&#x3002;PiggyBac &#x7684;&#x4E3B;&#x8981;&#x4EBA;&#x7C7B; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x8FC7;&#x7EE7;&#x514D;&#x75AB;&#x6CBB;&#x7597;&#x7684;&#x6F5C;&#x5728;&#x5E94;&#x7528;&#x7684;&#x662F;&#x4E00;&#x4E2A;&#x9AD8;&#x6548;&#x7387;&#x7684;&#x7EFC;&#x5408;&#x5411;&#x91CF;&#xFF0C;&#x7A33;&#x5B9A; transfects (&#x7EA6; 40%)&#x3002;&#x82E5;&#x8981;&#x8BC4;&#x4F30;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x9057;&#x4F20;&#x6BD2;&#x6027;&#x7684; piggyBac&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x76F8;&#x6BD4; 228 &#x96C6;&#x6210;&#x7F51;&#x7AD9;&#x4E3B; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x5411;&#x5176;&#x4ED6; 2 &#x4EBA;&#x6E90;&#x6027;&#x7EC6;&#x80DE;&#x682A; &#xFF08;&#x4EBA;&#x80DA;&#x80CE;&#x80BE; 293 &#x548C; HeLa&#xFF09; &#x7684;&#x96C6;&#x6210;&#x548C;&#x968F;&#x673A;&#x6A21;&#x62DF;&#x96C6;&#x6210;&#x5230;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x663E;&#x793A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7C7B;&#x578B;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x660E;&#x663E;&#x5DEE;&#x5F02;&#x3002;PiggyBac &#x4E86;&#x65E0;&#x89C4;&#x96C6;&#x6210;&#x914D;&#x7F6E;&#x6587;&#x4EF6;&#x548C;&#x8F6C;&#x5F55;&#x5355;&#x4F4D; &#xFF08;&#x5927;&#x7EA6; 50%&#x5230; RefSeq &#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x6240;&#x6709;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7C7B;&#x578B;&#xFF09;&#x3001; CpG &#x5C9B; &#xFF08;&#x5728; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684; 18%&#x548C; 8%&#xFF0C;&#x5728;&#x5176;&#x4ED6;&#x4EBA;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#xFF09;&#xFF0C;&#x8F6C;&#x5F55;&#x8D77;&#x59CB;&#x4F4D;&#x70B9;&#x7684;&#x504F;&#x597D; &#xFF08;&lt; 5 kb&#xFF0C;&#x5728;&#x6240;&#x6709;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7C7B;&#x578B;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6709; 16%&#x81F3; 20%&#xFF09;&#x3002;PiggyBac &#x4E5F;&#x9996;&#x9009;&#x8FC5;&#x731B;&#x4F46;&#x4E0D;&#x662F;&#x5728;&#x8D44;&#x6E90;&#x4E30;&#x5BCC;&#x5730;&#x533A;&#x7684;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BC4;&#x4F30;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x6620;&#x5C04;&#x5230;&#x54EA;&#x4E2A; piggyBac &#x96C6;&#x6210;&#x5728;&#x4E00;&#x8D77;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5728;&#x4E3B;&#x4EBA;&#x7C7B; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x76F8;&#x6BD4;&#x5176;&#x4ED6;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7C7B;&#x578B;&#xFF0C;&#x53EF;&#x80FD;&#x662F;&#x7531;&#x4E8E;&#x540C;&#x65F6;&#x6FC0;&#x6D3B; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x5728;&#x79FB;&#x4F4D;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x627E;&#x5230;&#x66F4;&#x79EF;&#x6781;&#x57FA;&#x56E0;&#x7B5B;&#x9009;&#x3002;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#x6BD4;&#x4EC0;&#x4E48;&#x62A5; gammaretroviral &#x548C;&#x4EBA;&#x7C7B; lenitviral &#x5411;&#x91CF;&#xFF0C;piggyBac &#x5DF2;&#x51CF;&#x5C11;&#x96C6;&#x6210;&#x9891;&#x7387;&#x6216; 50 kb &#x7684;&#x5DF2;&#x77E5;&#x539F;&#x764C;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x8F6C;&#x5F55;&#x8D77;&#x59CB;&#x7AD9;&#x70B9;&#x5185;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64; piggyBac &#x975E;&#x75C5;&#x6BD2;&#x57FA;&#x56E0;&#x4F20;&#x9012;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x770B;&#x6765;&#x662F;&#x6709;&#x524D;&#x9014;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x79FB;&#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x5BF9;&#x4E8E;&#x4F7F;&#x7528;&#x4EBA;&#x7C7B; T &#x6DCB;&#x5DF4;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x4E34;&#x5E8A;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x3002;

&#x5728;&#x4E3B;&#x8981;&#x7684;&#x4EBA;&#x7C7B; T &#x7EC6;&#x80DE; PiggyBac &#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x96C6;&#x6210;&#x7684;&#x5168;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x6620;&#x5C04;&#x3002;

The piggyBac transposon system represents a promising nonviral tool for gene delivery and discovery, and may also be of value for clinical gene therapy. PiggyBac is a highly efficient integrating vector that stably transfects (approximately 40%) of primary human T cells for potential adoptive immunotherapy applications. To evaluate the potential genotoxicity of piggyBac, we compared 228 integration sites in primary human T cells to integrations in 2 other human-derived cell lines (HEK293 and HeLa) and randomly simulated integrations into the human genome. Our results revealed distinct differences between cell types. PiggyBac had a nonrandom integration profile and a preference for transcriptional units (approximately 50% into RefSeq genes in all cell types), CpG islands (18% in T cells and 8% in other human cells), and transcriptional start sites (<5 kb, 16% to 20% in all cell types). PiggyBac also preferred TTAA but not AT-rich regions of the human genome. We evaluated the expression of mapped genes into which piggyBac integrated, and found selection of more active genes in primary human T cells compared with other human cell types, possibly due to concomitant T-cell activation during transposition. Importantly, we found that in comparison to what has been reported for gammaretroviral and human lenitviral vectors, piggyBac had decreased integration frequency into or within 50 kb of the transcriptional start sites of known proto-oncogenes. Hence the piggyBac nonviral gene delivery system seems to represent a promising gene transfer system for clinical applications using human T lymphocytes.

Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells.

Le syst&egrave;me de transposon piggyBac repr&eacute;sente un outil prometteur nonviral pour la livraison de g&egrave;ne et de la d&eacute;couverte et peut &ecirc;tre &eacute;galement utile pour la th&eacute;rapie g&eacute;nique clinique. PiggyBac est un vecteur d&#39;int&eacute;gration tr&egrave;s efficace qui stablement transfects (environ 40 %) des cellules humaines primaires de T pour les applications potentielles d&#39;immunoth&eacute;rapie adoptive. Pour &eacute;valuer la g&eacute;notoxicit&eacute; potentielle du piggyBac, nous avons compar&eacute; les 228 sites d&#39;int&eacute;gration dans les cellules T humaines primaires aux int&eacute;grations dans 2 autres lign&eacute;es de cellules d&#39;origine humaine (HEK293 et HeLa) et simul&eacute; au hasard des int&eacute;grations dans le g&eacute;nome humain. Nos r&eacute;sultats ont r&eacute;v&eacute;l&eacute; des diff&eacute;rences entre les types de cellules. PiggyBac avait un profil d&#39;int&eacute;gration non al&eacute;atoire et une pr&eacute;f&eacute;rence pour les unit&eacute;s de transcriptionnelles (environ 50 % dans RefSeq g&egrave;nes dans tous les types de cellules), &icirc;les de CpG (18 % dans les cellules T et 8 % dans les autres cellules humaines) et sites de d&eacute;part transcriptionnel (&lt; 5KO, 16 &agrave; 20 % dans tous les types de cellules). PiggyBac pr&eacute;f&egrave;re aussi TTAA mais pas riche en AT r&eacute;gions du g&eacute;nome humain. Nous avons &eacute;valu&eacute; l&#39;expression des g&egrave;nes cartographi&eacute;s dans lequel piggyBac int&eacute;gr&eacute; et trouv&eacute; la s&eacute;lection de g&egrave;nes plus actifs dans les cellules T humaines primaires par rapport aux autres types de cellules humaines, peut-&ecirc;tre en raison de l&#39;activation des lymphocytes T concomitante au cours de la transposition. Ce qui est important, nous avons trouv&eacute; que par rapport &agrave; ce qui a &eacute;t&eacute; signal&eacute; pour les gammaretroviral et les vecteurs de la lenitviral humaine, piggyBac avait diminu&eacute; &agrave; fr&eacute;quence int&eacute;gration dans ou &agrave; l&#39;int&eacute;rieur de 50KO des sites d&eacute;but transcriptionnelle des proto-oncog&egrave;nes connus. D&#39;o&ugrave; le syst&egrave;me de livraison de g&egrave;ne nonviral piggyBac semble repr&eacute;senter un syst&egrave;me de transfert de g&egrave;ne prometteur pour les applications cliniques utilisant des lymphocytes T humains.

Cartographie de G&eacute;nome-large d&#39;int&eacute;grations transposon PiggyBac dans les cellules T humaines primaires.

El sistema del transpos&oacute;n piggyBac representa una herramienta prometedora nonviral para la entrega de gene y descubrimiento y tambi&eacute;n puede ser &uacute;til para la terapia gen&eacute;tica cl&iacute;nica. PiggyBac es un vector de integraci&oacute;n altamente eficiente que transfects estable (aproximadamente 40%) de las c&eacute;lulas T humanas primarias para posibles aplicaciones de la inmunoterapia adoptiva. Para evaluar la genotoxicidad potencial del piggyBac, compararon 228 p&aacute;ginas de integraci&oacute;n en las c&eacute;lulas T humanas primarias para integraciones en otras 2 l&iacute;neas de c&eacute;lulas humanos (HEK293 y HeLa) y simularon aleatoriamente integraciones en el genoma humano. Nuestros resultados revelaron distintas diferencias entre tipos de c&eacute;lulas. PiggyBac ten&iacute;a un perfil de integraci&oacute;n nonrandom y una preferencia por unidades transcripcionales (aproximadamente 50% en genes RefSeq en todos los tipos celulares), las islas CpG (18% en las c&eacute;lulas T y 8% en otras c&eacute;lulas humanas) y sitios de inicio transcripcional (&lt; 5 kb, 16% al 20% en todos los tipos de c&eacute;lula). PiggyBac tambi&eacute;n prefirieron AAVV pero no ricos en regiones del genoma humano. Evaluamos la expresi&oacute;n de genes asignadas en que piggyBac integrado y encuentra selecci&oacute;n de genes m&aacute;s activos en las c&eacute;lulas T primarias humanas en comparaci&oacute;n con otros tipos de c&eacute;lulas humanas, posiblemente debido a la activaci&oacute;n de c&eacute;lulas T concomitante durante la transposici&oacute;n. Lo importante, hemos encontrado que en comparaci&oacute;n con lo que se ha divulgado para gammaretroviral y lenitviral humana vectores, piggyBac hab&iacute;a disminuido la frecuencia de integraci&oacute;n en o dentro de 50 kb de los sitios de inicio transcripcional de proto-oncogenes conocidos. Por lo tanto el sistema de entrega de gene nonviral piggyBac parece representar un prometedor sistema de transferencia de genes para aplicaciones cl&iacute;nicas con linfocitos T humanos.

Mapeo del genoma de integraciones de transpos&oacute;n PiggyBac en las c&eacute;lulas T humanas primarias.

Das PiggyBac-Transposon-System stellt ein viel versprechendes nonviral Hilfsmittel gen Lieferung und Entdeckung und kann auch der Wert f&uuml;r klinische Gentherapie. PiggyBac ist ein h&ouml;chst effiziente Integration von Vector, der stabil (etwa 40 %) transfects von prim&auml;ren menschlichen T-Zellen f&uuml;r Adoptive Immuntherapie Anwendungsm&ouml;glichkeiten. Um die potenzielle Genotoxizit&auml;t von PiggyBac zu bewerten, wir verglichen 228 Integration-Standorte in prim&auml;ren menschlichen T-Zellen zu Integrationen in 2 andere Menschen abgeleiteten Zelllinien (HEK293 und HeLa) und nach dem Zufallsprinzip simuliert Integrationen des menschlichen Genoms. Unsere Ergebnisse zeigten deutliche Unterschiede zwischen Zelltypen. PiggyBac hatte eine zuf&auml;llige Integration-Profil und eine Vorliebe f&uuml;r transkriptionelle Einheiten (ca. 50 % in RefSeq Gene in alle Zelltypen), CpG Inseln (18 % in den T-Zellen und 8 % in anderen menschlichen Zellen) und transkriptionelle Start-Seiten (&lt; 5 kb, 16 % bis 20 % in alle Zelltypen). PiggyBac bevorzugt auch TTAA aber nicht AT-reiche Regionen des menschlichen Genoms. Wir evaluieren den Ausdruck der zugeordneten Gene in die PiggyBac integriert und Auswahl aktiver Gene in prim&auml;ren menschlichen T-Zellen im Vergleich zu anderen menschlichen Zelltypen, m&ouml;glicherweise aufgrund der damit einhergehenden T-Zell-Aktivierung w&auml;hrend der Umsetzung zu finden. Wichtig ist, fanden wir, dass im Vergleich zu dem, was f&uuml;r Gammaretroviral und menschlichen Lenitviral Vektoren gemeldet wurde, PiggyBac Integration Frequenz oder innerhalb 50 kb der transkriptionelle Start-Seiten des bekannten Proto-oncogenes abgenommen hatte. Daher scheint das PiggyBac nonviral gen-Delivery-System ein vielversprechender gen-Transfer-System f&uuml;r klinische Anwendungen, die mit menschliche T-Lymphozyten darzustellen.

Genomweiten Zuordnung von PiggyBac Transposon Integrationen in prim&auml;ren humanen T-Zellen.

Il sistema del transposon piggyBac rappresenta uno strumento promettente virali per la consegna del gene e la scoperta e pu&ograve; anche essere di valore per la terapia genica clinico. PiggyBac &egrave; un vettore di integrazione altamente efficiente che stabile transfects (40% circa) delle cellule di T umane primarie per le potenziali applicazioni adoptive immunoterapia. Per valutare il potenziale genotossicit&agrave; di piggyBac, abbiamo confrontato 228 siti integrazione primarie cellule T umane a integrazioni in 2 altre linee cellulari umane derivate (HEK293 e HeLa) e casualmente simulata integrazioni nel genoma umano. I nostri risultati hanno rivelato distinte differenze tra tipi di cellule. PiggyBac aveva un profilo di integrazione casuali e una preferenza per unit&agrave; trascrizionale (circa il 50% in geni Medlars in tutti i tipi di cellule), isole di CpG (18% nelle cellule T e 8% in altre cellule umane) e siti di inizio di transcriptional (&lt; 5 kb, 16-20% in tutti i tipi di cellule). PiggyBac preferito anche TTAA ma non AT-ricche regioni del genoma umano. Abbiamo valutato l&#39;espressione di geni mappati nella quale piggyBac integrato e trovato selezione dei geni pi&ugrave; attivi nelle cellule primarie umane T rispetto ad altri tipi di cellule umane, forse a causa della concomitante attivazione delle cellule T durante la trasposizione. Soprattutto, abbiamo trovato che in confronto a ci&ograve; che &egrave; stato segnalato per vettori umano lenitviral e gammaretroviral, piggyBac era diminuita frequenza di integrazione in o entro 50 kb dei siti di inizio di transcriptional di proto-oncogeni noti. Quindi il sistema di consegna del gene virali piggyBac sembra rappresentare un promettente sistema di trasferimento del gene per applicazioni cliniche usando linfociti T umani.

Genome-wide mappatura delle integrazioni transposon PiggyBac nelle cellule T umane primarie.

PiggyBac &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3; &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306F;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30C7;&#x30EA;&#x30D0;&#x30EA;&#x30FC;&#x3068;&#x767A;&#x898B;&#x3001;&#x6709;&#x671B;&#x306A; nonviral &#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3092;&#x8868;&#x3057;&#x3001;&#x81E8;&#x5E8A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x6CBB;&#x7642;&#x306E;&#x5024;&#x306E;&#x5834;&#x5408;&#x3082;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;PiggyBac &#xFF08;&#x7D04; 40 &#xFF05;&#xFF09; &#x3092;&#x5B89;&#x5B9A;&#x3057;&#x3066; transfects &#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x7D71;&#x5408;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x539F;&#x767A; T &#x7D30;&#x80DE;&#x990A;&#x5B50;&#x514D;&#x75AB;&#x7642;&#x6CD5;&#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x3067;&#x3059;&#x3002;PiggyBac &#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x6BD2;&#x6027;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;228 &#x306E;&#x7D71;&#x5408;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8; &#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30B0;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x74B0;&#x5883;&#x3067;&#x4ED6;&#x306E; 2 &#x306E;&#x3072;&#x3068;&#x7531;&#x6765;&#x7D30;&#x80DE;&#x30E9;&#x30A4;&#x30F3; (HEK293 &#x3068; hela &#x7D30;&#x80DE;) &#x306B;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30EA; &#x30D2;&#x30C8; T &#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C0;&#x30E0;&#x306B;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x3078;&#x306E;&#x7D71;&#x5408;&#x3092;&#x30B7;&#x30DF;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x9593;&#x660E;&#x78BA;&#x306A;&#x9055;&#x3044;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;PiggyBac &#x306F;&#x3001;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C0;&#x30E0;&#x3067;&#x7D71;&#x5408;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB;&#x3068;&#x8EE2;&#x5199;&#x5358;&#x4F4D; &#xFF08;RefSeq &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x30BB;&#x30EB;&#x306E;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x306B;&#x7D04; 50 &#xFF05;&#xFF09;&#x3001;CpG &#x5CF6; &#xFF08;T &#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x306F; 18% &#x3068;&#x4ED6;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x306F; 8%&#xFF09; &#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x8EE2;&#x5199;&#x958B;&#x59CB;&#x70B9;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x597D;&#x307F;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x305F; (&lt; 5 &#x30AD;&#x30ED;&#x30D0;&#x30A4;&#x30C8;&#x3001;16 &#xFF5E; 20 &#xFF05; &#x306E;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x30BB;&#x30EB;&#x306E;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;)&#x3002;PiggyBac &#x306F;&#x307E;&#x305F; TTAA &#x304C;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306E;&#x306A;&#x3044;&#x8C4A;&#x5BCC;&#x306A;&#x5730;&#x57DF;&#x3092;&#x597D;&#x3093;&#x3060;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x3001;&#x7D71;&#x5408;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30EA; &#x30D2;&#x30C8; T &#x7D30;&#x80DE;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316; T &#x7D30;&#x80DE;&#x4F75;&#x7528;&#x4E2D;&#x8EE2;&#x4F4D;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x304A;&#x305D;&#x3089;&#x304F;&#x4ED6;&#x306E;&#x30D2;&#x30C8;&#x7D30;&#x80DE;&#x578B;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x3066;&#x3088;&#x308A;&#x7A4D;&#x6975;&#x7684;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x3092;&#x898B;&#x3064;&#x3051;&#x308B;&#x3069;&#x306E; piggyBac &#x306B;&#x30DE;&#x30C3;&#x30D7;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x306F;&#x3001;gammaretroviral &#x3068;&#x4EBA;&#x9593; lenitviral &#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x3092;&#x5831;&#x544A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3082;&#x306E;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x7D71;&#x5408;&#x5468;&#x6CE2;&#x6570;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x65E2;&#x77E5;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30AA;&#x30F3;&#x30B3;&#x30B8;&#x30FC;&#x30F3;&#x306E;&#x8EE2;&#x5199;&#x958B;&#x59CB;&#x70B9;&#x306E; 50 kb &#x4EE5;&#x5185;&#x306B; piggyBac &#x304C;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x767A;&#x898B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x3086;&#x3048; piggyBac nonviral &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30C7;&#x30EA;&#x30D0;&#x30EA;&#x30FC; &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306F;&#x30D2;&#x30C8; T &#x30EA;&#x30F3;&#x30D1;&#x7403;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x81E8;&#x5E8A;&#x5FDC;&#x7528;&#x306E;&#x6709;&#x671B;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x8EE2;&#x9001;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3092;&#x8868;&#x3059;&#x3088;&#x3046;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

PiggyBac &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3; &#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30B0;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x74B0;&#x5883;&#x3067;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30EA; &#x30D2;&#x30C8; T &#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0; &#x30DE;&#x30C3;&#x30D4;&#x30F3;&#x30B0;&#x3002;

PiggyBac transposon &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC804;&#xB2EC; &#xBC0F; &#xAC80;&#xC0C9;, &#xC720;&#xB9DD; nonviral &#xB3C4;&#xAD6C;&#xB97C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xACE0; &#xC784;&#xC0C1; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xCE58;&#xB8CC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC00;&#xCE58;&#xAC00; &#xC788;&#xC744; &#xC218;&#xB3C4; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. PiggyBac &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xC785;&#xC591; immunotherapy &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAE30;&#xBCF8; &#xC778;&#xAC04; T &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xACE0;&#xD6A8;&#xC728; &#xD1B5;&#xD569; &#xBCA1;&#xD130;&#xB97C; &#xC548;&#xC815;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; transfects (&#xC57D; 40%) &#xC774;&#xB2E4;. Piggybac&#xC758; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; genotoxicity&#xB97C; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xB2E4;&#xB978; 2 &#xC778;&#xAC04; &#xD30C;&#xC0DD; &#xC140; &#xB77C;&#xC778; (HEK293 &#xBC0F; &#xD5EC;&#xB7EC;)&#xC5D0;&#xC11C; &#xD1B5;&#xD569;&#xC744; &#xAE30;&#xBCF8; &#xC778;&#xAC04; T &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; 228 &#xD1B5;&#xD569; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xB97C; &#xBE44;&#xAD50; &#xD558; &#xACE0; &#xBB34;&#xC791;&#xC704;&#xB85C; &#xC778;&#xAC04; &#xAC8C;&#xB188;&#xC5D0; &#xD1B5;&#xD569; &#xC2DC;&#xBBAC;&#xB808;&#xC774;&#xC158;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xC140; &#xD615;&#xC2DD; &#xC0AC;&#xC774; &#xB69C;&#xB837;&#xD55C; &#xCC28;&#xC774; &#xBC1D;&#xD614;&#xB2E4;. PiggyBac &#xD588;&#xB2E4; nonrandom &#xD1B5;&#xD569; &#xD504;&#xB85C;&#xD544;&#xACFC; transcriptional &#xB2E8;&#xC704; (&#xBAA8;&#xB4E0; &#xC140; &#xC885;&#xB958;&#xC5D0;&#xC11C; RefSeq &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC5D0; &#xC57D; 50%), CpG &#xC12C; (T &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; 18%, &#xB2E4;&#xB978; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; 8%), &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; transcriptional &#xC2DC;&#xC791; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAE30;&#xBCF8; &#xC124;&#xC815; (&lt; 5kb, &#xBAA8;&#xB4E0; &#xC140; &#xC885;&#xB958;&#xC5D0;&#xC11C; 16% ~ 20%). Piggybac&#xB294; &#xB610;&#xD55C; TTAA &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC778;&#xAC04; &#xAC8C;&#xB188;&#xC758; &#xD558;&#xC9C0;&#xC5D0; &#xD48D;&#xBD80;&#xD55C; &#xC9C0;&#xC5ED; &#xC120;&#xD638;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; piggyBac &#xD1B5;&#xD569;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xC804;&#xC704; &#xC911;&#xC5D0; &#xC218; &#xBC18;&#xD558;&#xB294; T &#xC138;&#xD3EC; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xC778;&#xD574; &#xB2E4;&#xB978; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC138;&#xD3EC; &#xC720;&#xD615;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xAE30;&#xBCF8; &#xC778;&#xAC04; T &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xC801;&#xADF9;&#xC801;&#xC778; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xACAC;&#xC73C;&#xB85C; &#xB9E4;&#xD551;&#xB41C; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xD45C;&#xD604; &#xD3C9;&#xAC00;. &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xAC83;&#xC740;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; gammaretroviral&#xC640; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; lenitviral &#xBCA1;&#xD130;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBCF4;&#xACE0; &#xB41C; &#xBB34;&#xC2A8;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; Piggybac&#xB85C; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4;&#xB41C; proto-oncogenes&#xC758; transcriptional &#xC2DC;&#xC791; &#xC704;&#xCE58;&#xC758; 50 kb &#xC774;&#xB0B4; &#xD1B5;&#xD569; &#xC8FC;&#xD30C;&#xC218; &#xAC10;&#xC18C; &#xD588;&#xB2E4; &#xBC1C;&#xACAC;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; piggyBac nonviral &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC804;&#xB2EC; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xC778;&#xAC04; T &#xC138;&#xD3EC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC784;&#xC0C1; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC720;&#xB9DD; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC804;&#xC1A1; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0BC; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCF4;&#xC778;&#xB2E4;.

PiggyBac transposon &#xD1B5;&#xD569; &#xAE30;&#xBCF8; &#xC778;&#xAC04; T &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xAC8C;&#xB188; &#xB113;&#xC740; &#xB9E4;&#xD551;.

&#x4F53;&#x7EC6;&#x80DE;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x79FB;&#x5DF2;&#x5141;&#x8BB8;&#x901A;&#x8FC7;&#x591A;&#x4E2A;&#x75C5;&#x6BD2;&#x661F;&#x5EA7;&#x4F53;&#x5185;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5047;&#x8BBE;&#xFF0C;&#x9AD8;&#x6548;&#x8D28;&#x7C92;&#x57FA;&#x4E8E; piggyBac &#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x5C06;&#x4F7F;&#x957F;&#x671F;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x57FA;&#x56E0;&#x5728;&#x5C0F;&#x9F20;&#x4F53;&#x5185;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7528;&#x4E8E;&#x591A;&#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x63D0;&#x4F9B;&#x6218;&#x7565;&#x521B;&#x5EFA;&#x56DB;&#x73AF;&#x7D20;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x8868;&#x8FBE;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x4F53;&#x5916;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684;&#x5355;&#x72EC;&#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x7684;&#x8BB0;&#x8005;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x4EE5;&#x53CA;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5355;&#x72EC;&#x7684;&#x53EF;&#x9009;&#x62E9;&#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x6807;&#x8BB0;&#x4E0A;&#x63D0;&#x4F9B;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x57FA;&#x56E0;&#x3002;&#x5BF9;&#x7A33;&#x5B9A;&#x7EC6;&#x80DE;&#x682A;&#x7684;&#x8BC4;&#x4EF7;&#x663E;&#x793A;&#x9009;&#x5B9A;&#x514B;&#x9686; 100%&#x540C;&#x65F6;&#x5C55;&#x51FA;&#x901A;&#x8FC7;&#x4ECE;&#x4E09;&#x4E2A;&#x5355;&#x72EC;&#x7684;&#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x7684;&#x7A33;&#x5B9A;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x8868;&#x8FBE;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4E0B;&#x4E00;&#x6B65;&#x8FDB;&#x884C;&#x6D4B;&#x8BD5;&#xFF0C;&#x53D1;&#x73B0; piggyBac &#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x79FB;&#x5230;&#x809D;&#x810F;&#x6216;&#x80BA;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5B9E;&#x73B0;&#x7A33;&#x5B9A;&#x7684;&#x8BB0;&#x8005;&#x5728;&#x5C0F;&#x9F20;&#x4F53;&#x5185;&#x7684;&#x514D;&#x75AB;&#x6216;&#x514D;&#x75AB;&#x7F3A;&#x9677;&#x52A8;&#x7269;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x3002;PiggyBac &#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x7684;&#x5355;&#x6B21;&#x6CE8;&#x5C04;&#x5C31;&#x80FD;&#x5B9E;&#x73B0;&#x957F;&#x671F;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x5728;&#x809D;&#x810F;&#x4E2D;&#x7684;&#x5C0F;&#x9F20;&#x4F53;&#x5185;&#xFF0C;&#x786E;&#x8BA4;&#x6211;&#x4EEC;&#x5728;&#x57F9;&#x517B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x591A;&#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x6218;&#x7565;&#x3002;&#x8D28;&#x7C92;&#x57FA;&#x4E8E; piggyBac &#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x65E0;&#x9700;&#x4F7F;&#x7528;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8F7D;&#x4F53;&#x4F7F;&#x4F53;&#x5185;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x6CBB;&#x7597;&#x548C;&#x751F;&#x7269;&#x5E94;&#x7528;&#x672C;&#x6784;&#x6216;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x3002;

PiggyBac &#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x57FA;&#x4E8E;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x57FA;&#x56E0;&#x5728;&#x4F53;&#x5185;&#x8868;&#x8FBE;&#x540E;&#x4F53;&#x7EC6;&#x80DE;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x79FB;&#x3002;

Somatic cell gene transfer has permitted inducible gene expression in vivo through coinfection of multiple viruses. We hypothesized that the highly efficient plasmid-based piggyBac transposon system would enable long-term inducible gene expression in mice in vivo. We used a multiple-transposon delivery strategy to create a tetracycline-inducible expression system in vitro in human cells by delivering the two genes on separate transposons for inducible reporter gene expression along with a separate selectable transposon marker. Evaluation of stable cell lines revealed 100% of selected clones exhibited inducible expression via stable expression from three separate transposons simultaneously. We next tested and found that piggyBac-mediated gene transfer to liver or lung could achieve stable reporter gene expression in mice in vivo in either immunocompetent or immune deficient animals. A single injection of piggyBac transposons could achieve long-term inducible gene expression in the livers of mice in vivo, confirming our multiple-transposon strategy used in cultured cells. The plasmid-based piggyBac transposon system enables constitutive or inducible gene expression in vivo for potential therapeutic and biological applications without using viral vectors.

PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer.

Transfert de g&egrave;ne de cellules somatiques a permis l&#39;expression des g&egrave;nes inductibles in vivo par co-infection du virus multiples. Nous avons &eacute;mis l&#39;hypoth&egrave;se que le syst&egrave;me de transposon hautement efficace ax&eacute;e sur le plasmide piggyBac permettrait l&#39;expression des g&egrave;nes inductibles &agrave; long terme chez la souris in vivo. Nous avons utilis&eacute; une strat&eacute;gie multiple-transposon livraison pour cr&eacute;er un syst&egrave;me d&#39;expression inductible par la t&eacute;tracycline in vitro dans les cellules humaines en livrant les deux g&egrave;nes sur transposons distincts pour l&#39;expression du g&egrave;ne rapporteur inductible avec un marqueur de transposon s&eacute;lectionnable distinct. &Eacute;valuation de lign&eacute;es cellulaires stables a r&eacute;v&eacute;l&eacute; 100 % de clones s&eacute;lectionn&eacute;s expos&eacute; expression inductible via expression stable de trois transposons distincts simultan&eacute;ment. Ensuite, nous avons v&eacute;rifi&eacute; et constat&eacute; que transfert de g&egrave;nes piggyBac au foie ou des poumons pouvait atteindre expression du g&egrave;ne rapporteur stable chez les souris in vivo chez les animaux d&eacute;ficients immunitaires ou immunocomp&eacute;tents. Une seule injection de transposons piggyBac pouvait r&eacute;aliser l&#39;expression de g&egrave;ne inductible &agrave; long terme dans le foie de souris in vivo, confirmant notre strat&eacute;gie multiple-transposon utilis&eacute; dans des cellules cultiv&eacute;es. Le syst&egrave;me de transposon ax&eacute;e sur le plasmide piggyBac permet l&#39;expression des g&egrave;nes constitutive ou inductible in vivo pour des applications th&eacute;rapeutiques et biologiques potentielles sans l&#39;utilisation de vecteurs viraux.

PiggyBac l&#39;expression des g&egrave;nes inductibles ax&eacute;e sur le transposon in vivo apr&egrave;s transfert de g&egrave;nes de cellules somatiques.

Somatische Gentransfer erlaubte durch Induktion Genexpression in-vivo durch Coinfection mehrere Viren. Wir die Hypothese, dass das hocheffiziente Plasmid-basierte PiggyBac-Transposon-System langfristig durch Induktion Genexpression bei M&auml;usen in-vivo erm&ouml;glichen w&uuml;rde. Wir verwendeten eine Multiple-Transposon-Lieferung-Strategie ein Tetracyclin-inducible Ausdruck-System in den menschlichen Zellen in-vitro-schaffen, durch die Bereitstellung von zwei Gene auf separaten Transposonen f&uuml;r Induktion Reporter Genexpression zusammen mit einem separaten w&auml;hlbar Transposon-Marker. Auswertung von stabilen Zelllinien ergab, dass 100 % der ausgew&auml;hlten Klone durch Induktion Ausdruck durch den stabilen Ausdruck aus drei separaten Transposonen gleichzeitig ausgestellt. Wir als n&auml;chstes getestet und festgestellt, dass PiggyBac-vermittelte Gentransfer, Leber oder Lunge stabil Reporter Genexpression bei M&auml;usen in-vivo in immunkompetenten oder immun mangelhaft Tiere erreichen konnten. Eine einzige Injektion von PiggyBac Transposonen erreichen konnte langfristig durch Induktion Genexpression in der Leber von M&auml;usen in vivo best&auml;tigen unsere Strategie des Multiple-Transposon in kultivierten Zellen verwendet. Das Plasmid-basierte PiggyBac-Transposon-System erm&ouml;glicht konstitutive oder durch Induktion Genexpression in-vivo f&uuml;r m&ouml;gliche therapeutische und biologische Anwendungen ohne Verwendung von virale Vektoren.

PiggyBac Transposon-basierte durch Induktion Genexpression in-vivo nach somatische Gentransfer.

Trasferimento genico delle cellule somatiche &egrave; consentito inducible gene expression in vivo attraverso coinfezioni di pi&ugrave; virus. Abbiamo ipotizzato che il sistema di Trasposone altamente efficiente basata su plasmide piggyBac consentirebbe a lungo termine espressione inducible gene nel topo in vivo. Abbiamo usato una strategia multipla-trasposone consegna per creare un sistema di espressione inducibile tetraciclina in vitro nelle cellule umane consegnando i due geni su trasposoni separati per l&#39;espressione del gene reporter viscoelastico insieme a un indicatore separato Trasposone selezionabile. Valutazione delle variet&agrave; di cellula stabili ha rivelato il 100% dei cloni selezionati esposto espressione inducibile via espressione stabile da tre distinti trasposoni simultaneamente. Abbiamo quindi testato e trovato che piggyBac-mediata del gene transfer al fegato o polmone potrebbe raggiungere i espressione del gene reporter stabile nel topo in vivo negli animali carenti o immunitarie o immuni. Una singola iniezione di piggyBac trasposoni potrebbe raggiungere a lungo termine espressione inducible gene nel fegato di topo in vivo, che conferma la nostra strategia di multiplo-trasposone utilizzato in cellule in coltura. Il sistema di transposon piggyBac plasmide-based permette espressione genica costitutiva o inducibile in vivo per le potenziali applicazioni terapeutiche e biologiche senza l&#39;utilizzo di vettori virali.

PiggyBac basata su trasposone inducible gene expression in vivo dopo il trasferimento di geni di cellule somatiche.

&#x4F53;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x8EE2;&#x9001;&#x306F;&#x3001;&#x8A98;&#x5F15;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x306E; in vivo &#x8907;&#x6570;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x91CD;&#x611F;&#x67D3;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x8A31;&#x53EF;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x9577;&#x671F;&#x306E;&#x8A98;&#x5F15;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9; in vivo &#x3067;&#x9AD8;&#x52B9;&#x7387;&#x306A;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C3;&#x30C9; &#x30D9;&#x30FC;&#x30B9; piggyBac &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3; &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3092;&#x6709;&#x52B9;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x3060;&#x308D;&#x3046;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x4EEE;&#x5B9A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x8907;&#x6570;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3;&#x914D;&#x4FE1;&#x6226;&#x7565;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x30C6;&#x30C8;&#x30E9;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EA;&#x30F3;&#x8A98;&#x5C0E;&#x767A;&#x73FE;&#x7CFB; in vitro &#x3067;&#x30D2;&#x30C8;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x5225;&#x3005; &#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3;&#x500B;&#x5225;&#x9078;&#x629E;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3; &#x30DE;&#x30FC;&#x30AB;&#x30FC;&#x3068;&#x5171;&#x306B;&#x8A98;&#x5C0E;&#x30EC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x4E0A;&#x306E; 2 &#x3064;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x4F5C;&#x6210;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5B89;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x30BB;&#x30EB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x9078;&#x629E;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30F3;&#x306E; 100 &#xFF05; &#x5B89;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x5F0F; 3 &#x3064;&#x306E;&#x5225;&#x3005; &#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3;&#x304B;&#x3089;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x767A;&#x73FE;&#x8A98;&#x5C0E;&#x3092;&#x540C;&#x6642;&#x306B;&#x5C55;&#x793A;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6B21;&#x306B;&#x3001;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3057;&#x3001;&#x809D;&#x81D3;&#x3084;&#x80BA;&#x3078;&#x306E; piggyBac &#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5C0E;&#x5165;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x514D;&#x75AB;&#x62C5;&#x5F53;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x514D;&#x75AB;&#x6B20;&#x4E4F;&#x52D5;&#x7269;&#x306E;&#x751F;&#x4F53;&#x5185;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x5B89;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x30EC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#x9054;&#x6210;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x767A;&#x898B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;PiggyBac &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3;&#x306E;&#x5358;&#x56DE;&#x6295;&#x4E0E;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x57F9;&#x990A;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x5F53;&#x793E;&#x306E;&#x8907;&#x6570;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3;&#x6226;&#x7565;&#x3092;&#x78BA;&#x8A8D;&#x30A4;&#x30F3;&#x30D3;&#x30DC;&#x3001;&#x809D;&#x81D3;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x9577;&#x671F;&#x8A98;&#x5F15;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#x9054;&#x6210;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9; &#x30D9;&#x30FC;&#x30B9; piggyBac &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3; &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x69CB;&#x6210;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x8A98;&#x5F15;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x306E; in vivo &#x3067;&#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x6CBB;&#x7642;&#x3068;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x7684;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E;&#x30D9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x305B;&#x305A;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

PiggyBac &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x304F;&#x8A98;&#x5C0E;&#x6027;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x304C; in vivo &#x3067;&#x306E;&#x4F53;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x8EE2;&#x9001;&#x5F8C;&#x3002;

&#xCCB4;&#xC138;&#xD3EC; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC804;&#xC1A1;&#xC744; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xC758; coinfection&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604;&#xC744; &#xD5C8;&#xC6A9; &#xD558;&#xACE0;&#xC788;&#xB2E4;. &#xACE0;&#xD6A8;&#xC728; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC; &#xAE30;&#xBC18;&#xC758; piggyBac transposon &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xC0DD;&#xC950; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC7A5;&#xAE30;&#xAC04; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604;&#xC744; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xAC83;&#xC744; &#xAC00;&#xC124;&#xC744; &#xC138;&#xC6E0;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xB2E4;&#xC911; transposon &#xBC30;&#xB2EC; &#xC804;&#xB7B5;&#xC744; &#xB9CC;&#xB4DC;&#xB294; &#xB370; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD56D;&#xC0DD;&#xBB3C;&#xC9C8;&#xC744; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC2DD; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xCCB4; &#xC678; &#xC778;&#xAC04; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xBCC4;&#xB3C4; &#xC120;&#xD0DD; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; transposon &#xD45C;&#xC2DD; &#xD568;&#xAED8; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xB9AC;&#xD3EC;&#xD130; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBCC4;&#xB3C4; transposons&#xC5D0; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB97C; &#xC804;&#xB2EC; &#xD558; &#xC5EC;. &#xC548;&#xC815;&#xC801; &#xC140; &#xB77C;&#xC778;&#xC758; &#xD3C9;&#xAC00; &#xC120;&#xD0DD; &#xB41C; &#xD074;&#xB860;&#xC758; 100% &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0; &#xC138; &#xAC00;&#xC9C0; &#xBCC4;&#xB3C4; transposons&#xC5D0;&#xC11C; &#xC548;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xC2DD; &#xD1B5;&#xD574; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC2DD; &#xC804;&#xC2DC; &#xACF5;&#xAC1C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB2E4;&#xC74C; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB97C; &#xD558; &#xACE0; piggyBac &#xC911;&#xC7AC; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC774;&#xB3D9; &#xAC04; &#xB610;&#xB294; &#xD3D0;&#xB97C; &#xC548;&#xC815; &#xB9AC;&#xD3EC;&#xD130; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604; &#xC0DD;&#xC950; immunocompetent &#xB610;&#xB294; &#xBA74;&#xC5ED; &#xACB0;&#xD54D; &#xB3D9;&#xBB3C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC5BB;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xBC1C;&#xACAC;. PiggyBac transposons&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC8FC;&#xC0AC; &#xC950; in vivo, &#xACBD;&#xC791;&#xB41C; &#xD55C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xB294; &#xB2E4;&#xC911; transposon &#xC804;&#xB7B5; &#xD655;&#xC778; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xAC04;&#xC740;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC7A5;&#xAE30; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604;&#xC744; &#xB2EC;&#xC131;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;&#xC5D0; &#xAE30;&#xCD08;&#xB97C; &#xB454; piggyBac transposon &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; &#xBCA1;&#xD130;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xACE0; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xCE58;&#xB8CC; &#xC801; &#xBC0F; &#xC0DD;&#xBB3C;&#xD559;&#xC801; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xC81C;&#xC815; &#xB610;&#xB294; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

PiggyBac transposon &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C; &#xC720;&#xB3C4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604; vivo &#xCCB4;&#xC138;&#xD3EC; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC774;&#xB3D9; &#xD6C4;.

Transferencia g&eacute;nica de c&eacute;lulas som&aacute;ticas ha permitido la expresi&oacute;n de genes inducibles en vivo a trav&eacute;s de la coinfecci&oacute;n de m&uacute;ltiples virus. Nuestra hip&oacute;tesis es que el sistema del transpos&oacute;n piggyBac eficientes basadas en el pl&aacute;smido permitir&iacute;a a largo plazo genes inducibles en ratones in vivo. Utilizamos una estrategia m&uacute;ltiple-transposon entrega para crear un sistema de expresi&oacute;n inducible por tetraciclina in vitro en c&eacute;lulas humanas mediante la entrega de los dos genes en transposones separados para la expresi&oacute;n del gen reportero inducible junto con un marcador independiente transposon seleccionable. Evaluaci&oacute;n de l&iacute;neas celulares estables revel&oacute; 100% de clones seleccionados exhibi&oacute; expresi&oacute;n inducible mediante la expresi&oacute;n estable de transposones separados tres simult&aacute;neamente. A continuaci&oacute;n probamos y encontr&oacute; que transferencia de genes mediada por piggyBac al h&iacute;gado o al pulm&oacute;n podr&iacute;a alcanzar reportero estable de genes en ratones in vivo en animales deficientes inmunocompetentes o inmunes. Una sola inyecci&oacute;n de transposones piggyBac podr&iacute;a alcanzar a largo plazo expresi&oacute;n inducible gene en los h&iacute;gados de ratones in vivo, confirmando nuestra estrategia m&uacute;ltiple-transposon utilizado en c&eacute;lulas cultivadas. El sistema del transpos&oacute;n piggyBac basadas en pl&aacute;smido permite expresi&oacute;n constitutiva o inducible gene in vivo para posibles aplicaciones terap&eacute;uticas y biol&oacute;gicas sin utilizar vectores virales.

Expresi&oacute;n de genes inducibles basadas en el transpos&oacute;n PiggyBac in vivo despu&eacute;s de la transferencia de genes de c&eacute;lulas som&aacute;ticas.

&#x76F4;&#x63A5;&#x57FA;&#x56E0;&#x4F20;&#x9012;&#x5230;&#x7528;&#x6237;&#x5B9A;&#x4E49;&#x7684;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x7684;&#x80FD;&#x529B;&#x5C06;&#x6781;&#x5927;&#x5730;&#x6539;&#x5584;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x79FB;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x3002;PiggyBac &#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x662F;&#x5404;&#x79CD;&#x5404;&#x6837;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x548C;&#x7EC4;&#x7EC7;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x884C;&#x4E4B;&#x6709;&#x6548;&#x7684;&#x975E;&#x75C5;&#x6BD2;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x79FB;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x878D;&#x5408;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x7279;&#x5B9A;&#x4E8E;&#x7AD9;&#x70B9;&#x7684;&#x5408;&#x6210;&#x950C;&#x6307; DNA &#x7ED3;&#x5408;&#x57DF; (ZFP) piggyBac &#x8F6C; N-&#x5DF4;&#x58EB;&#x603B;&#x7AD9;&#xFF0C;&#x5E76;&#x8BC4;&#x4F30;&#x5B9A;&#x70B9;&#x5728;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x96C6;&#x6210;&#x3002;&#x5D4C;&#x5408; ZFP piggyBac &#x8F6C;&#x8868;&#x73B0;&#x51FA;&#x5F3A;&#x52B2;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x79FB;&#x6D3B;&#x52A8;&#xFF0C;&#x6709;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x5728;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5305;&#x542B;&#x5355;&#x4E2A; ZFP &#x7AD9;&#x70B9;&#x5728;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684; episomal &#x8D28;&#x7C92;&#x76EE;&#x6807;&#x5B9A;&#x70B9;&#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x878D;&#x5165;&#x5185;&#x6E90;&#x6027;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53; ZFP &#x540C;&#x6E90;&#x7F51;&#x7AD9;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BC4;&#x4F30; ZFP piggyBac &#x80FD;&#x591F;&#x76F4;&#x63A5;&#x57FA;&#x56E0;&#x878D;&#x5408;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5728;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53; ZFP &#x76EE;&#x6807;&#x7AD9;&#x70B9;&#xFF0C;&#x4E00;&#x76F4;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x8F83;&#x9AD8;&#x7A0B;&#x5EA6;&#x7684; ZFP piggyBac &#x7F51;&#x7AD9;&#x9488;&#x5BF9;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x6574;&#x5408;&#x65F6;&#x76F8;&#x6BD4;&#xFF0C;&#x672C;&#x673A; piggyBac&#x3002;&#x67D3;&#x8272;&#x8D28;&#x6C89;&#x6DC0; &#xFF08;&#x82AF;&#x7247;&#xFF09; &#x5B9E;&#x9A8C;&#x663E;&#x793A;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x672C;&#x673A; piggyBac &#x5411;&#x6211;&#x4EEC;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x7684;&#x8FC5;&#x731B;&#x542B;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x7684;&#x76EE;&#x6807;&#x652F;&#x6301;&#x878D;&#x5408;&#xFF0C;&#x4F46;&#x4E0D;&#x662F;&#x7F3A;&#x4E4F;&#x4E00;&#x4F53;&#x5316;&#x8FC5;&#x731B;&#x7F3A;&#x7684;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x76EE;&#x6807;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x6DF1;&#x5165;&#x4E86;&#x89E3;&#x4F7F;&#x7528;&#x5D4C;&#x5408;&#x950C;&#x624B;&#x6307; piggyBac &#x8F6C;&#x6765;&#x76F4;&#x63A5;&#x96C6;&#x6210;&#x5230;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7528;&#x6237;&#x5B9A;&#x4E49;&#x7684;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x7684;&#x8981;&#x6C42;&#x3002;

&#x64CD;&#x7EB5; piggyBac &#x8F6C;&#x5EA7;&#x5B50;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x878D;&#x5408;&#x9009;&#x5740;&#x5728;&#x4EBA;&#x4F53;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x3002;

The ability to direct gene delivery to a user-defined chromosomal location would greatly improve gene transfer applications. The piggyBac transposon system is a nonviral gene transfer system proven effective in a variety of cells and tissues, including human cells. We fused a highly site-specific synthetic zinc-finger DNA-binding domain (ZFP) to the N-terminus of the piggyBac transposase and evaluated site-directed genomic integration in human cells. Chimeric ZFP-piggyBac transposase exhibited robust gene transfer activity, targeted binding to a cognate endogenous chromosomal ZFP site in the human genome, and site-directed transposon integration into an episomal plasmid target containing a single ZFP site in human cells. We evaluated the ability of ZFP-piggyBac to direct gene integration into an engineered chromosomal ZFP target site in the human genome and consistently observed a higher degree of ZFP-piggyBac site-directed genomic integration when compared to native piggyBac. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments revealed binding of native piggyBac to our engineered TTAA-containing chromosomal target which supported integration, but not a TTAA-deficient chromosomal target which lacked integration. Our results offer insight into the requirements for using a chimeric zinc finger-piggyBac transposase to direct integration into a user-defined chromosomal location.

Manipulating piggyBac transposon chromosomal integration site selection in human cells.

La capacit&eacute; d&#39;ordonner la livraison de g&egrave;ne &agrave; une localisation chromosomique d&eacute;finie par l&#39;utilisateur am&eacute;liorerait consid&eacute;rablement les applications de transfert de g&egrave;ne. Le transposon piggyBac est un syst&egrave;me de transfert de g&egrave;ne nonviral prouv&eacute; son efficacit&eacute; dans une vari&eacute;t&eacute; de cellules et de tissus, y compris les cellules humaines. Nous fusionn&eacute;s avec un domaine de liaison &agrave; l&#39;ADN synth&eacute;tique tr&egrave;s sp&eacute;cifiques au site de doigt de zinc (ZFP) &agrave; l&#39;extr&eacute;mit&eacute; N de la transposase piggyBac et &eacute;valu&eacute; l&#39;int&eacute;gration g&eacute;nomique dirig&eacute;e dans les cellules humaines. Chim&eacute;rique transposase PDZ-piggyBac une activit&eacute; de transfert g&eacute;nique robuste, cibl&eacute;e liant &agrave; un site ZFP chromosomique endog&egrave;ne analogue dans le g&eacute;nome humain et l&#39;int&eacute;gration du transposon dirig&eacute;e dans une cible d&#39;&eacute;pisomiques plasmide contenant un seul site ZFP dans les cellules humaines. Nous avons &eacute;valu&eacute; la capacit&eacute; des PDZ-piggyBac pour diriger l&#39;int&eacute;gration du g&egrave;ne dans un site de cible ZFP chromosomique machin&eacute; dans le g&eacute;nome humain et constamment observ&eacute; un degr&eacute; plus &eacute;lev&eacute; de PDZ-piggyBac dirig&eacute;e g&eacute;nomique int&eacute;gration par rapport &agrave; piggyBac native. Exp&eacute;riences d&#39;immunopr&eacute;cipitation (puce) de la chromatine a r&eacute;v&eacute;l&eacute; la liaison de piggyBac natif de notre cible chromosomique contenant TTAA machin&eacute; qui appuie l&#39;int&eacute;gration, mais pas une cible chromosomique TTAA d&eacute;ficients qui manquaient d&#39;int&eacute;gration. Nos r&eacute;sultats donnent un aper&ccedil;u aux exigences permettant d&#39;utiliser une transposase de doigt-piggyBac zinc chim&eacute;rique pour int&eacute;gration directe dans un emplacement chromosomique d&eacute;finie par l&#39;utilisateur.

La manipulation des choix des sites piggyBac transposon int&eacute;gration chromosomique dans les cellules humaines.

Die F&auml;higkeit, Gen-Lieferung an eine benutzerdefinierte chromosomalen Position direkt w&uuml;rde gen-Transfer-Anwendungen erheblich verbessern. Das PiggyBac-Transposon-System ist ein nonviral gen-Transfer-System bew&auml;hrt sich in einer Vielzahl von Zellen und Geweben, einschlie&szlig;lich menschliche Zellen. Wir eine sehr standortspezifische synthetisches Zink-Finger DNA-bindenden Dom&auml;ne (ZFP) an der N-Terminus von der PiggyBac-Transposase verschmolzen und Site-verwiesene genomischen Integration in den menschlichen Zellen ausgewertet. Chim&auml;ren ZFP-PiggyBac Transposase ausgestellt robuste Transfer Genaktivit&auml;t, gezielt zu einer verwandten endogene chromosomalen ZFP in das menschliche Genom und Site-verwiesene Transposon-Integration in ein episomale Plasmid-Ziel mit eine einzige ZFP-Website in den menschlichen Zellen binden. Wir evaluiert die F&auml;higkeit der ZFP-PiggyBac, Gen-Integration in ein ver&auml;nderter chromosomalen ZFP-Ziel-Standort im menschlichen Genom zu lenken und konsequent beobachtet ein h&ouml;heres Ma&szlig; an ZFP-PiggyBac Site-verwiesene genomischen Integration im Vergleich zu nativen PiggyBac. Chromatin Immunopr&auml;zipitation (ChIP) Experimente offenbart Bindung von native PiggyBac unser ver&auml;nderter TTAA-haltigen chromosomalen Ziel die Integration unterst&uuml;tzt, aber kein TTAA-defizienten chromosomalen Ziel die Integration fehlte. Unsere Ergebnisse bieten Einblick in die Anforderungen f&uuml;r die Verwendung einer Chim&auml;ren Zink-Finger-PiggyBac-Transposase, um Integration in eine benutzerdefinierte chromosomalen Position zu lenken.

Bearbeiten von PiggyBac Transposon chromosomale Integration Standortwahl in den menschlichen Zellen.

La capacit&agrave; di dirigere la consegna di gene in una posizione cromosomica definita dall&#39;utente migliorerebbe notevolmente le applicazioni di trasferimento del gene. Il sistema di transposon piggyBac &egrave; un sistema di trasferimento del gene virali dimostrato efficacia in una variet&agrave; di cellule e tessuti, tra cui le cellule umane. Abbiamo fuso un dominio DNA-binding site-specific altamente sintetica zinc-finger (ZFP) a N-terminus dell&#39;ha piggyBac e valutati integrazione genomic diretto sito nelle cellule umane. Chimerico ZFP-piggyBac ha esposto robusto trasferimento attivit&agrave; del gene, mirati associazione a un cognate sito ZFP cromosomico endogeno nel genoma umano e di integrazione diretto sito trasposone in un bersaglio plasmide episomal contenente un singolo sito ZFP nelle cellule umane. Abbiamo valutato la possibilit&agrave; di dirigere l&#39;integrazione del gene in un sito di destinazione ZFP cromosomico ingegnerizzato nel genoma umano ZFP-piggyBac e costantemente osservato un maggiore grado di ZFP-piggyBac sito-diretto genomico integrazione rispetto ai nativi piggyBac. Esperimenti (ChIP) di immunoprecipitazione della cromatina rivelarono associazione dei nativi piggyBac al nostro target cromosomiche contenenti TTAA ingegnerizzati che ha sostenuto l&#39;integrazione, ma non una deficit TTAA cromosomica destinazione che mancava di integrazione. I nostri risultati offrono spaccato i requisiti per l&#39;utilizzo di un chimerico zinco dito-piggyBac permettono alla diretta integrazione in una posizione cromosomica definita dall&#39;utente.

Manipolazione di selezione del sito piggyBac trasposone integrazione cromosomica nelle cellule umane.

&#x76F4;&#x63A5;&#x306E;&#x30E6;&#x30FC;&#x30B6;&#x30FC;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x306E;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x3078;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30C7;&#x30EA;&#x30D0;&#x30EA;&#x30FC;&#x80FD;&#x529B;&#x5927;&#x5E45;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x8EE2;&#x9001;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x5411;&#x4E0A;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x3067;&#x3057;&#x3087;&#x3046;&#x3002;PiggyBac &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3; &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306F;&#x3001;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x7D30;&#x80DE;&#x3084;&#x30D2;&#x30C8;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x7D44;&#x7E54;&#x3067;&#x52B9;&#x679C;&#x7684;&#x306A;&#x5B9F;&#x8A3C; nonviral &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x4F1D;&#x9054;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x56FA;&#x6709;&#x306E;&#x5408;&#x6210;&#x30B8;&#x30F3;&#x30AF;&#x30D5;&#x30A3;&#x30F3;&#x30AC;&#x30FC; DNA &#x7D50;&#x5408;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3; (ZFP) piggyBac &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30B6;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E; N &#x672B;&#x7AEF;&#x306B;&#x878D;&#x5408;&#x3057;&#x3001;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x76E3;&#x7763;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x7D71;&#x5408;&#x3072;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x306E;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3002;&#x30AD;&#x30E1;&#x30E9;&#x306E; ZFP piggyBac &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30B6;&#x30FC;&#x30BC;&#x5805;&#x7262;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x8EE2;&#x9001;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D3;&#x30C6;&#x30A3;&#x3092;&#x5BFE;&#x8C61;&#x3068;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x3068;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3;&#x76E3;&#x7763;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x7D71;&#x5408;&#x3092;&#x5358;&#x4E00;&#x306E; ZFP &#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3067;&#x30D2;&#x30C8;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x542B;&#x3080; episomal &#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x540C;&#x7A2E;&#x5185;&#x56E0;&#x6027;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53; ZFP &#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3078;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3001;&#x5C55;&#x793A;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x3001;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53; ZFP &#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8; &#x30FB; &#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306E;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306B;&#x76F4;&#x63A5;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x7D71;&#x5408;&#x3059;&#x308B; ZFP piggyBac &#x306E;&#x80FD;&#x529B;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3057;&#x3001;&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6; piggyBac &#x3092;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3059;&#x308B;&#x3068; ZFP piggyBac &#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x76E3;&#x7763;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x7D71;&#x5408;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x306F;&#x4E00;&#x8CAB;&#x3057;&#x3066;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3002;&#x30AF;&#x30ED;&#x30DE;&#x30C1;&#x30F3;&#x514D;&#x75AB;&#x6C88;&#x964D; (ChIP) &#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x3067;&#x306F;&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306E; piggyBac &#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x7D71;&#x5408;&#x3001;&#x30B5;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3055;&#x308C;&#x305F; TTAA &#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x306E;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3067;&#x3059;&#x304C;&#x7D71;&#x5408;&#x304C;&#x6B20;&#x3051;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3001;TTAA &#x6B20;&#x4E4F;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3057;&#x306A;&#x3044;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x30AD;&#x30E1;&#x30E9;&#x4E9C;&#x925B;&#x30D5;&#x30A3;&#x30F3;&#x30AC;&#x30FC; piggyBac &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30B6;&#x30FC;&#x30BC;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x30E6;&#x30FC;&#x30B6;&#x30FC;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x306E;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x306B;&#x76F4;&#x63A5;&#x7D71;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8981;&#x4EF6;&#x306E;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x3072;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x306E; piggyBac &#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DD;&#x30BE;&#x30F3;&#x306E;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x306E;&#x7D71;&#x5408;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x3092;&#x64CD;&#x4F5C;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xC9C1;&#xC811; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC790; &#xC815;&#xC758; &#xC5FC;&#xC0C9;&#xCCB4; &#xC704;&#xCE58;&#xB97C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC30;&#xB2EC; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC804;&#xC1A1; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC744; &#xD06C;&#xAC8C; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xC2DC;&#xD0AC; &#xAC83; &#xC774;&#xB2E4;. PiggyBac transposon &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC740; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC640; &#xC870;&#xC9C1;, &#xC778;&#xAC04; &#xC138;&#xD3EC;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558; &#xC5EC; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC778; &#xC785;&#xC99D; &#xB41C; nonviral &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC804;&#xC1A1; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xB192;&#xC740; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xBCC4; &#xD569;&#xC131; &#xC544;&#xC5F0; &#xC190;&#xAC00;&#xB77D; DNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; (ZFP) piggyBac transposase&#xC758; N &#xB9D0;&#xB2E8;&#xC5D0; &#xC735;&#xD569; &#xD558; &#xACE0; &#xC778;&#xAC04; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xAC8C;&#xB188; &#xD1B5;&#xD569; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xAC10;&#xB3C5; &#xD3C9;&#xAC00;. Chimeric ZFP piggyBac transposase &#xC804;&#xC2DC; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC804;&#xC1A1; &#xD65C;&#xB3D9; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xC778;&#xAC04; &#xAC8C;&#xB188;&#xACFC; &#xC778;&#xAC04; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; ZFP &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xAC00; &#xC788;&#xB294; episomal &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC; &#xB300;&#xC0C1;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xAC10;&#xB3C5; transposon &#xD1B5;&#xD569; &#xB3D9;&#xC871; &#xB0B4; &#xC5FC;&#xC0C9;&#xCCB4; ZFP &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC778;&#xAC04; &#xAC8C;&#xB188;&#xC5D0; &#xC124;&#xACC4; &#xB41C; &#xC5FC;&#xC0C9;&#xCCB4; ZFP &#xB300;&#xC0C1; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xD1B5;&#xD569; &#xC9C1;&#xC811; ZFP Piggybac&#xC758; &#xB2A5;&#xB825;&#xC744; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD558; &#xACE0; &#xC9C0;&#xC18D;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; ZFP piggyBac &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xAC10;&#xB3C5; &#xAC8C;&#xB188; &#xD1B5;&#xD569;&#xC758; &#xB124;&#xC774;&#xD2F0;&#xBE0C; Piggybac&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xB354; &#xB192;&#xC740; &#xD559;&#xC704;&#xB97C; &#xAD00;&#xCC30; &#xD588;&#xB2E4;. Chromatin immunoprecipitation (&#xCE69;) &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC124;&#xACC4; TTAA &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xC5FC;&#xC0C9;&#xCCB4; &#xBAA9;&#xD45C; &#xD1B5;&#xD569;&#xC744; &#xC9C0;&#xC6D0; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xD558;&#xC9C0; TTAA &#xBD88;&#xCDA9;&#xBD84; &#xD55C; &#xC5FC;&#xC0C9;&#xCCB4; &#xB300;&#xC0C1; &#xD1B5;&#xD569; &#xBD80;&#xC871; &#xD558;&#xB294; &#xB124;&#xC774;&#xD2F0;&#xBE0C; piggyBac &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC744; &#xACF5;&#xAC1C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; chimeric &#xC544;&#xC5F0; &#xC190;&#xAC00;&#xB77D;-piggyBac transposase &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC790; &#xC815;&#xC758; &#xC5FC;&#xC0C9;&#xCCB4; &#xC704;&#xCE58;&#xC5D0; &#xD1B5;&#xD569;&#xC744; &#xC9C1;&#xC811; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xC694;&#xAD6C; &#xC0AC;&#xD56D;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC870;&#xC791; piggyBac transposon &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC5FC;&#xC0C9;&#xCCB4; &#xD1B5;&#xD569; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xB97C; &#xC120;&#xD0DD; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

La capacidad para dirigir la entrega de genes a una localizaci&oacute;n cromos&oacute;mica definidos por el usuario mejorar&iacute;a enormemente solicitudes de transferencia de genes. El sistema del transpos&oacute;n piggyBac es un sistema de transferencia de genes nonviral demostrado ser eficaz en una variedad de c&eacute;lulas y tejidos, incluyendo c&eacute;lulas humanas. Nos fundi&oacute; un dominio de uni&oacute;n al ADN sint&eacute;tico altamente espec&iacute;fica zinc-finger (ZFP) a la N-terminal de la transposasa piggyBac y eval&uacute;an integraci&oacute;n gen&oacute;mica dirigida en c&eacute;lulas humanas. Quim&eacute;rica ZFP-piggyBac transposasa mostraron actividad transferencia Gen robusto, dirigido enlace a un sitio ZFP cromos&oacute;mico end&oacute;geno cognado en el genoma humano y la integraci&oacute;n de transposones dirigida a un objetivo episomal pl&aacute;smido que contiene un &uacute;nico sitio de la ZFP en c&eacute;lulas humanas. Se evalu&oacute; la capacidad de la ZFP-piggyBac para dirigir la integraci&oacute;n del gene en un sitio Ingenier&iacute;a cromos&oacute;mico de destino ZFP en el genoma humano y constantemente hab&iacute;a observado un mayor grado de ZFP-piggyBac dirigida gen&oacute;mica integraci&oacute;n comparados con piggyBac nativa. Experimentos (ChIP) de inmunoprecipitaci&oacute;n de cromatina revelaron atascamiento de piggyBac nativo a nuestro objetivo cromos&oacute;mica ingenier&iacute;a que contienen AAVV que apoy&oacute; la integraci&oacute;n, pero no un objetivo cromos&oacute;mico de AAVV-deficientes que carec&iacute;a de integraci&oacute;n. Nuestros resultados ofrecen informaci&oacute;n sobre los requisitos para usar una quim&eacute;rica cinc dedo-piggyBac transposasa para la integraci&oacute;n directa en una localizaci&oacute;n cromos&oacute;mica definidos por el usuario.

Article	Year
Carboxyl-terminal sequences critical for inositol 1,4,5-trisphosphate receptor subunit assembly. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 12377774	2002
RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell\| PubMed ID: 18394989	2008
Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. Journal of immunotherapy (Hagerstown, Md. : 1997)\| PubMed ID: 19752750	2009
PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy\| PubMed ID: 19809403	2009
Manipulating piggyBac transposon chromosomal integration site selection in human cells. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy\| PubMed ID: 21730970	2011

Daniel L. Galvan

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