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Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Max Planck Institute of Biophysics

Attempts to treat peanut allergy using traditional methods of allergen desensitization are accompanied by a high risk of anaphylaxis. The aim of this study was to determine if modifications to the IgE-binding epitopes of a major peanut allergen would result in a safer immunotherapeutic agent for the treatment of peanut-allergic patients. IgE-binding epitopes on the Ara h 2 allergen were modified, and modified Ara h 2 (mAra h 2) protein was produced. Wild-type (wAra h 2) and mAra h 2 proteins were analyzed for their ability to interact with T-cells, their ability to bind IgE, and their ability to release mediators from a passively sensitized RBL-2H3 cell line. Multiple T-cell epitopes were identified on the major peanut allergen, Ara h 2. Ara h 2 amino acid regions 11-35, 86-125, and 121-155 contained the majority of peptides that interact with T-cells from most patients. The wAra h 2 and mAra h 2 proteins stimulated proliferation of T-cells from peanut-allergic patients to similar levels. In contrast, the mAra h 2 protein exhibited greatly reduced IgE-binding capacity compared to the wild-type allergen. In addition, the modified allergen released significantly lower amounts of beta-hexosaminidase, a marker for IgE-mediated RBL-2H3 degranulation, compared to the wild-type allergen.

Allergenic characteristics of a modified peanut allergen.

Les tentatives pour traiter l&#39;allergie &agrave; l&#39;arachide en utilisant des m&eacute;thodes traditionnelles de d&eacute;sensibilisation allerg&egrave;ne sont accompagn&eacute;es d&#39;un risque &eacute;lev&eacute; d&#39;anaphylaxie. Le but de cette &eacute;tude &eacute;tait de d&eacute;terminer si les modifications aux &eacute;pitopes IgE-contraignant d&#39;un allerg&egrave;ne d&#39;arachide majeur seraient traduirait par un agent immunoth&eacute;rapeutique plus s&ucirc;r pour le traitement des patients allergiques aux arachides. IgE-liaison &eacute;pitopes sur l&#39;allerg&egrave;ne en Ara h 2 ont &eacute;t&eacute; modifi&eacute;s et mis &agrave; jour le Ara h 2 (mAra h 2) prot&eacute;ine a &eacute;t&eacute; produite. Sauvage (wAra h 2) et mAra h 2 prot&eacute;ines ont &eacute;t&eacute; analys&eacute;s pour leur capacit&eacute; &agrave; interagir avec les T-cellules, leur capacit&eacute; &agrave; lier l&#39;IgE et leur capacit&eacute; &agrave; lib&eacute;rer des m&eacute;diateurs d&#39;une lign&eacute;e de 3 cellules RBL - 2H passivement sensibilis&eacute;es. Plusieurs &eacute;pitopes de cellules T ont &eacute;t&eacute; identifi&eacute;s sur le principal allerg&egrave;ne d&#39;arachide, l&#39;Ara h 2. Ara h 2 r&eacute;gions acides amin&eacute;s 11-35, 86-125 et 121-155 contient la majorit&eacute; des peptides qui interagissent avec les cellules T de la plupart des patients. La wAra h 2 et mAra h 2 prot&eacute;ines stimulent la prolif&eacute;ration des lymphocytes T provenant de patients allergiques &agrave; l&#39;arachide &agrave; des niveaux similaires. En revanche, la prot&eacute;ine de h 2 mAra expos&eacute; tr&egrave;s r&eacute;duite capacit&eacute; de fixation IgE par rapport &agrave; l&#39;allerg&egrave;ne sauvage. En outre, l&#39;allerg&egrave;ne mis &agrave; jour le sort des quantit&eacute;s significativement plus faible de b&ecirc;ta-hexosaminidase, un marqueur de d&eacute;granulation m&eacute;di&eacute;e par les IgE RBL - 2H 3, par rapport &agrave; l&#39;allerg&egrave;ne sauvage.

Allerg&egrave;nes caract&eacute;ristiques d&#39;un allerg&egrave;ne d&#39;arachide modifi&eacute;.

Tentativi di trattare l&#39;allergia alle arachide, utilizzando i metodi tradizionali di desensibilizzazione allergene sono accompagnati da un elevato rischio di anafilassi. Lo scopo di questo studio era di determinare se le modifiche per gli epitopi IgE-associazione di un importante allergene arachide si tradurrebbe in un agente immunotherapeutic pi&ugrave; sicuro per il trattamento di pazienti allergici-arachidi. IgE-leganti epitopi su allergene Ara h 2 sono stati modificati, e modificata Ara h 2 (mAra h 2) della proteina &egrave; stata prodotta. MAra h 2 proteine e wild-type (wAra h 2) sono state analizzate per la loro capacit&agrave; di interagire con le T-cellule, la loro capacit&agrave; di legare le IgE e la loro capacit&agrave; di rilasciare mediatori da una linea di 3 cellule sensibilizzate passivamente RBL - 2H. Pi&ugrave; epitopi T-cellula sono stati identificati sui principali allergeni arachide, Ara h 2. Ara h 2 regioni dell&#39;amminoacido 11-35, 86-125 e 121-155 contenevano la maggior parte dei peptidi che interagiscono con le cellule T dalla maggior parte dei pazienti. WAra h 2 e mAra h 2 proteine stimolata proliferazione delle cellule T da pazienti allergici arachidi a livelli simili. Al contrario, la proteina h 2 mAra esposto capacit&agrave; IgE-leganti notevolmente ridotta rispetto al wild-type allergene. Inoltre, l&#39;allergene modificato rilasciato quantit&agrave; significativamente pi&ugrave; basso di beta-esosaminidasi, un marcatore per degranulazione IgE-mediate RBL - 2H 3, rispetto al wild-type allergene.

Caratteristiche allergeniche di un allergene arachide modificata.

Liaison ionique d&#39;une membrane lipidique est &eacute;tudi&eacute;e par l&#39;application d&#39;un &eacute;change rapide de solution sur une membrane de prise en charge solide. Le d&eacute;placement de charge qui en r&eacute;sulte est analys&eacute; en fonction de l&#39;affinit&eacute; des ions appliqu&eacute;es &agrave; la surface des lipides. Nous trouvons que chaotropes anions et des cations de kosmotropic sont attir&eacute;es vers la membrane ind&eacute;pendante de la composition de la membrane. En particulier, le m&ecirc;me comportement se trouve pour les lipides polaires portant gratuitement, comme monool&eacute;ine. Cette tendance g&eacute;n&eacute;rale est modul&eacute;e par une interaction &eacute;lectrostatique des ions avec les frais terminaux de lipides. Ces r&eacute;sultats ne peuvent pas s&#39;expliquer avec les mod&egrave;les actuels d&#39;interactions ion sp&eacute;cifique.

Anion sp&eacute;cifique et liaison des cations &agrave; membranes lipidiques &eacute;tudi&eacute;es sur une membrane de prise en charge solide.

Associazione di ioni da una membrana lipidica &egrave; studiato dall&#39;applicazione di un cambio di soluzione rapida su una membrana solida supportata. Lo spostamento di carica risultante viene analizzato in termini l&#39;affinit&agrave; degli ioni applicati alla superficie dei lipidi. Troviamo che in agenti caotropici anioni e cationi kosmotropic sono attratti alla membrana indipendente della composizione della membrana. In particolare, lo stesso comportamento &egrave; trovato per lipidi headgroups non cuscinetto alcun costo, come monoolein. Questa tendenza generale &egrave; modulata dalla interazione elettrostatica degli ioni con carica capigruppo dei lipidi. Questi risultati non possono essere spiegati con gli attuali modelli di interazioni di ioni specifici.

Specifiche anione e catione associazione a membrane lipidiche indagato su una membrana solida supportata.

Ion binding to a lipid membrane is studied by application of a rapid solution exchange on a solid supported membrane. The resulting charge displacement is analyzed in terms of the affinity of the applied ions to the lipid surface. We find that chaotropic anions and kosmotropic cations are attracted to the membrane independent of the membrane composition. In particular, the same behavior is found for lipid headgroups bearing no charge, like monoolein. This general trend is modulated by electrostatic interaction of the ions with the lipid headgroup charge. These results cannot be explained with the current models of specific ion interactions.

Specific anion and cation binding to lipid membranes investigated on a solid supported membrane.

Application of solid supported membranes (SSMs) for the functional investigation of ion channels is presented. SSM-based electrophysiology, which has been introduced previously for the investigation of active transport systems, is expanded for the analysis of ion channels. Membranes or liposomes containing ion channels are adsorbed to an SSM and a concentration gradient of a permeant ion is applied. Transient currents representing ion channel transport activity are recorded via capacitive coupling. We demonstrate the application of the technique to liposomes reconstituted with the peptide cation channel gramicidin, vesicles from native tissue containing the nicotinic acetylcholine receptor, and membranes from a recombinant cell line expressing the ionotropic P2X2 receptor. It is shown that stable ion gradients, both inside as well as outside directed, can be applied and currents are recorded with an excellent signal/noise ratio. For the nicotinic acetylcholine receptor and the P2X2 receptor excellent assay quality factors of Z' = 0.55 and Z' = 0.67, respectively, are obtained. This technique opens up new possibilities in cases where conventional electrophysiology fails like the functional characterization of ion channels from intracellular compartments. It also allows for robust fully automatic assays for drug screening.

Measuring ion channels on solid supported membranes.

Application des membranes support&eacute;es solides (SSMs) pour l&#39;&eacute;tude fonctionnelle des canaux ioniques est pr&eacute;sent&eacute;e. &Eacute;lectrophysiologie SSM-bas&eacute;e, qui a &eacute;t&eacute; pr&eacute;sent&eacute; pr&eacute;c&eacute;demment pour l&#39;&eacute;tude des syst&egrave;mes de transport actif, est d&eacute;velopp&eacute; pour l&#39;analyse des canaux ioniques. Membranes ou liposomes contenant des canaux ioniques sont adsorb&eacute;s &agrave; un SSM et un gradient de concentration d&#39;un ion perm&eacute;ant est appliqu&eacute;. Les courants transitoires repr&eacute;sentant l&#39;activit&eacute; de transport des canaux ioniques sont enregistr&eacute;es via un couplage capacitif. Nous d&eacute;montrons l&#39;application de la technique aux liposomes reconstitu&eacute;s avec la gramicidine de canal de cation peptide, v&eacute;sicules de natif tissu contenant le r&eacute;cepteur nicotinique de l&#39;ac&eacute;tylcholine, et ligne de membranes d&#39;une cellule recombinante exprimant le r&eacute;cepteur ionotropic P2X2. Il est d&eacute;montr&eacute; que des gradients d&#39;ion stable, tant &agrave; l&#39;int&eacute;rieur qu&#39;&agrave; l&#39;ext&eacute;rieur r&eacute;alis&eacute;, peut &ecirc;tre appliqu&eacute; et courants sont enregistr&eacute;es avec un rapport signal/bruit excellent. Pour le r&eacute;cepteur nicotinique de l&#39;ac&eacute;tylcholine et les facteurs de qualit&eacute; P2X2 r&eacute;cepteur excellent dosage de Z&#39; = 0,55 et Z&#39; = 0,67, respectivement, sont obtenus. Cette technique ouvre de nouvelles perspectives dans le cas o&ugrave; &eacute;lectrophysiologie conventionnelle n&#39;est pas comme la caract&eacute;risation fonctionnelle des canaux ioniques des compartiments intracellulaires. Il permet &eacute;galement pour des dosages robustes enti&egrave;rement automatiques pour le d&eacute;pistage des drogues.

Mesure des canaux ioniques sur solides membranes support&eacute;es.

Applicazione di membrane supportate solide (SSMs) per l&#39;indagine funzionale dei canali ionici &egrave; presentato. Elettrofisiologia SSM-based, che &egrave; stato introdotto in precedenza per l&#39;indagine dei sistemi di trasporto attivo, viene espanso per l&#39;analisi dei canali ionici. Membrane o liposomi contenenti canali ionici sono assorbiti a un SSM e viene applicato un gradiente di concentrazione di un ione permeant. Le correnti transitorie che rappresentano attivit&agrave; di trasporto del canale ionico sono registrate tramite accoppiamento capacitivo. Dimostreremo l&#39;applicazione della tecnica di liposomi ricostituiti con Gramicidina cazione di canale del peptide, vescicole dal tessuto nativo contenente il recettore nicotinico dell&#39;acetilcolina, e linea di membrane da una cella ricombinante che esprimono i recettori ionotropici P2X2. &Egrave; dimostrato che stabile ione pendenze, sia all&#39;interno che all&#39;esterno diretto, possono essere applicati e le correnti sono registrate con un rapporto segnale/rumore eccellente. Per il recettore nicotinico dell&#39;acetilcolina e i fattori di qualit&agrave; eccellente saggio P2X2 recettore di Z&#39; = 0.55 e Z&#39; = 0.67, rispettivamente, sono ottenuti. Questa tecnica apre nuove possibilit&agrave; nei casi in cui elettrofisiologia convenzionale come la caratterizzazione funzionale dei canali ionici dal compartimento intracellulare. Inoltre permette dosaggi robusti completamente automatici per lo screening di stupefacenti.

Canali ionici misura su solide membrane supportati.

In anaerobically grown bacteria, transport of nitrite is catalyzed by an integral membrane protein of the form ate-nitrite transporter family, NirC, which in Salmonella typhimurium plays a critical role in intracellular virulence. We present a functional characterization of the S. typhimurium nitrite transporter StmNirC in native membrane vesicles as well as purified and reconstituted into proteoliposomes. Using an electrophysiological technique based on solid supported membranes, we show nitrite induced translocation of negative charges into proteoliposomes reconstituted with purified StmNirC. These data demonstrate the electrogenicity of StmNirC and its substrate specificity for nitrite. Monitoring changes in Î”pH on everted membrane vesicles containing overexpressed StmNirC using acridine orange as a pH indicator we demonstrate that StmNirC acts as a secondary active transporter. It promotes low affinity transport of nitrite coupled to H(+) antiport with a pH independent profile in the pH range from 6 to 8. In addition to nitrite also nitrate is transported by StmNirC, but with reduced flux and complete absence of proton antiport activity. Taken together, these data suggest a bispecific anion selectivity of StmNirC with an ion specific transport mode. This may play a role in regulating nitrite transport under physiological conditions.

The nitrite transport protein NirC from Salmonella typhimurium is a nitrite/proton antiporter.

Chez les bact&eacute;ries croissant en ana&eacute;robiose, transport de nitrite est catalys&eacute;e par une prot&eacute;ine int&eacute;grale de membrane de la famille de transporteur forme nitrite mang&eacute;, CIRC, qui, chez Salmonella typhimurium, joue un r&ocirc;le essentiel dans la virulence intracellulaire. Nous pr&eacute;sentons une caract&eacute;risation fonctionnelle du transporteur de la S. typhimurium nitrite StmNirC dans les v&eacute;sicules de membrane native ainsi que purifi&eacute; et reconstitu&eacute;e dans des prot&eacute;oliposomes. En utilisant une technique &eacute;lectrophysiologique issue des membranes support&eacute;es solides, nous montrons nitrite induite par translocation de charges n&eacute;gatives dans des prot&eacute;oliposomes reconstitu&eacute; avec StmNirC purifi&eacute;e. Ces r&eacute;sultats d&eacute;montrent l&#39;electrogenicity de StmNirC et sa sp&eacute;cificit&eacute; de substrat pour le nitrite. Surveiller les changements &Delta;pH sur &eacute;vers&eacute;e v&eacute;sicules contenant surexprim&eacute;e StmNirC utilisant l&#39;acridine orange comme un indicateur de pH, que nous d&eacute;montrons que StmNirC agit comme un transporteur actif secondaire. Il favorise le transport de faible affinit&eacute; de nitrite coupl&eacute; &agrave; l&#39;antiport H(+) avec un profil ind&eacute;pendante du pH dans la gamme de pH de 6 &agrave; 8. En plus de nitrites &eacute;galement nitrate est transport&eacute; par StmNirC, mais avec un flux r&eacute;duit et l&#39;absence totale d&#39;activit&eacute; antiport de proton. Ensemble, ces r&eacute;sultats sugg&egrave;rent une s&eacute;lectivit&eacute; d&#39;anion bisp&eacute;cifiques de StmNirC avec un mode de transport sp&eacute;cifique d&#39;ion. Cela peut jouer un r&ocirc;le dans la r&eacute;gulation des transports de nitrite dans les conditions physiologiques.

La prot&eacute;ine de transport du nitrite NirC de Salmonella typhimurium est un antiport nitrite/proton.

Nei batteri coltivati in anaerobiosi, trasporto di nitriti &egrave; catalizzata da una proteina integrale di membrana della famiglia ha mangiato-nitrito di transporter forma, NirC, che in Salmonella typhimurium gioca un ruolo critico nella virulenza intracellulare. Noi presenti una caratterizzazione funzionale del trasportatore S. typhimurium nitrito StmNirC in vescicole di membrana nativo come purificato e ricostituito in proteoliposomes. Utilizzando una tecnica elettrofisiologica basata su solide membrane supportate, mostriamo nitrito indotta da traslocazione di cariche negative in proteoliposomes ricostituito con StmNirC purificato. Questi dati dimostrano la electrogenicity di StmNirC e la sua specificit&agrave; di substrato per nitrito. Cambiamenti nella &Delta;pH di monitoraggio su estroflesso vescicole di membrana contenente overexpressed StmNirC con arancio di acridina come un indicatore di pH che dimostriamo che StmNirC agisce come un trasportatore attivo secondario. Esso promuove il trasporto bassa affinit&agrave; del nitrito accoppiato a H(+) antiport con un profilo indipendente di pH nell&#39;intervallo di pH da 6 a 8. Oltre ai nitriti anche nitrato &egrave; trasportato da StmNirC, ma con flusso ridotto e completa assenza di attivit&agrave; antiport protone. Presi insieme, questi dati suggeriscono una selettivit&agrave; di anione bispecific di StmNirC con una modalit&agrave; di trasporto specifico dello ione. Questo potrebbe giocare un ruolo nella regolazione trasporto nitrito in condizioni fisiologiche.

Article	Year
Allergenic characteristics of a modified peanut allergen. Molecular nutrition & food research\| PubMed ID: 16189800	2005
Specific anion and cation binding to lipid membranes investigated on a solid supported membrane. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids\| PubMed ID: 17718523	2007
Measuring ion channels on solid supported membranes. Biophysical journal\| PubMed ID: 19580777	2009
The nitrite transport protein NirC from Salmonella typhimurium is a nitrite/proton antiporter. Biochimica et biophysica acta\| PubMed ID: 22349433	2012

Lina Hatahet

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