designing-a-bio-responsive-robot-from-dna-origami

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

Bar Ilan University

Bar-Ilan University

Most globular protein chains, when transferred from high to low denaturant concentrations, collapse instantly before they refold to their native state. The initial compaction of the protein molecule is assumed to have a key effect on the folding pathway, but it is not known whether the earliest structures formed during or instantly after collapse are defined by local or by non-local interactions--that is, by secondary structural elements or by loop closure of long segments of the protein chain. Stable closure of one or several long loops can reduce the chain entropy at a very early stage and can prevent the protein from following non-productive pathways whose number grows exponentially with the length of the protein chain. In Escherichia coli adenylate kinase (AK), about seven long loops define the topology of the native structure. We selected four loop-forming sections of the chain and probed the time course of loop formation during refolding of AK. We labeled the termini of the loop segments with tryptophan and cysteine-5-amidosalicylic acid. This donor-acceptor pair of probes used with fluorescence resonance excitation energy transfer spectroscopy (FRET) is suitable for detecting very short distances and thus is able to distinguish between random and specific compactions. Refolding of AK was initiated by stopped-flow mixing, followed simultaneously by donor and acceptor fluorescence, and analyzed in terms of energy transfer efficiency and distance. In the collapsed state of AK, observed after the 5-ms dead time of the instrument, one of the selected segments shows a native-like separation of its termini; it forms a loop already in the collapsed state. A second segment that includes the first but is longer by 15 residues shows an almost native-like separation of its termini. In contrast, a segment that is shorter but part of the second segment shows a distance separation of its termini as high as a segment that spans almost the whole protein chain. We conclude that a specific network of non-local interactions, the closure of one or several loops, can play an important role in determining the protein folding pathway at its early phases.

Early closure of a long loop in the refolding of adenylate kinase: a possible key role of non-local interactions in the initial folding steps.

Cha&icirc;nes de prot&eacute;ines plus globuleuses, lorsque transf&eacute;r&eacute;s d&#39;&eacute;lev&eacute; &agrave; faibles concentrations d&eacute;naturant, effondrement instantan&eacute;ment avant ils se replier &agrave; leur &eacute;tat naturel. Le compactage initial de la mol&eacute;cule prot&eacute;ique est suppos&eacute; pour avoir un effet d&#39;incrustation sur la voie de pliage, mais on ne sait pas si les premi&egrave;res structures forment pendant ou instantan&eacute;ment apr&egrave;s l&#39;effondrement sont d&eacute;finis par les locaux, ou par des interactions non-locales--c&#39;est-&agrave;-dire, par des &eacute;l&eacute;ments de structure secondaires ou de fermeture de la boucle de longs segments de la cha&icirc;ne prot&eacute;ique. Fermeture stable d&#39;une ou plusieurs boucles longs peut r&eacute;duire l&#39;entropie de la cha&icirc;ne &agrave; un stade tr&egrave;s pr&eacute;coce et peut emp&ecirc;cher la prot&eacute;ine provenant des voies non productifs suivants dont le nombre cro&icirc;t de fa&ccedil;on exponentielle avec la longueur de la cha&icirc;ne prot&eacute;ique. Dans Escherichia coli ad&eacute;nylate kinase (AK), environ sept boucles longues d&eacute;finissent la topologie de la structure native. Nous avons s&eacute;lectionn&eacute; quatre sections formant des boucles de la cha&icirc;ne et sond&eacute; l&#39;&eacute;volution temporelle de formation de la boucle pendant le repliement de l&#39;AK. Nous avons marqu&eacute; les terminus des segments boucle avec le tryptophane et l&#39;acide cyst&eacute;ine-5-amidosalicylic. Ce couple donneur-accepteur des sondes utilis&eacute;es avec la spectroscopie par fluorescence resonance d&#39;excitation &eacute;nergie transfert (FRET) est adapt&eacute; pour la d&eacute;tection de tr&egrave;s courtes distances et est donc capable de distinguer les compactages al&eacute;atoires et sp&eacute;cifiques. Repliement de l&#39;AK a &eacute;t&eacute; initi&eacute; par le m&eacute;lange de flux stopp&eacute;, suivie simultan&eacute;ment par fluorescence donneur et accepteur et analys&eacute; en fonction de la distance et l&#39;efficacit&eacute; de transfert d&#39;&eacute;nergie. Dans l&#39;&Eacute;tat s&#39;est effondr&eacute; de AK, observ&eacute;e apr&egrave;s le temps mort de 5 ms de l&#39;instrument, l&#39;un des segments s&eacute;lectionn&eacute;s montre une s&eacute;paration natif de son termini ; il forme une boucle d&eacute;j&agrave; dans l&#39;&eacute;tat r&eacute;duit. Un deuxi&egrave;me segment qui inclut le premier, mais est plus longue de 15 r&eacute;sidus montre une s&eacute;paration quasi native de son termini. En revanche, un segment qui est plus courte mais une partie du second segment montre une s&eacute;paration de la distance de ses termini jusqu&#39;&agrave; un segment qui s&#39;&eacute;tend sur presque la cha&icirc;ne de prot&eacute;ines enti&egrave;res. Nous concluons qu&#39;un r&eacute;seau sp&eacute;cifique d&#39;interactions non-locales, la fermeture d&#39;une ou plusieurs boucles, peut jouer un r&ocirc;le important dans la d&eacute;termination de la prot&eacute;ine pliage voie &agrave; ses premi&egrave;res phases.

Fermeture anticip&eacute;e d&#39;une longue boucle dans le repliement de l&#39;ad&eacute;nylate kinase : &eacute;tapes d&#39;un r&ocirc;le possible des interactions non-locales dans le pliage initiale.

Catene pi&ugrave; globulare della proteina, quando trasferito da alta a bassa concentrazione di denaturante, crollo istantaneamente prima che essi ripiegare al loro stato nativo. La compattazione iniziale della molecola di proteina &egrave; presupposto per avere un effetto fondamentale sulla via del pieghevole, ma non &egrave; noto se le prime strutture formarono durante o immediatamente dopo il crollo sono definite da locale o da interazioni non-locale - che &egrave;, gli elementi strutturali secondari o dalla chiusura del ciclo dei segmenti della catena della proteina. Chiusura stabile di uno o pi&ugrave; cicli lunghi pu&ograve; ridurre l&#39;entropia di catena in una fase molto precoce e pu&ograve; prevenire la proteina dai seguenti percorsi non-produttive cui numero cresce esponenzialmente con la lunghezza della catena della proteina. In Escherichia coli adenilato chinasi (AK), circa sette cicli lunghi definiscono la topologia della struttura nativa. Abbiamo selezionato quattro sezioni formando anello della catena e sondato il corso del tempo di formazione di loop durante il ripiegamento di AK. Abbiamo etichettato i termini dei segmenti loop con triptofano e cisteina-5-amidosalicylic acido. Questa coppia donatore-accettore di sonde utilizzate con spettroscopia di fluorescenza risonanza eccitazione energy transfer (FRET) &egrave; adatta per la rilevazione di distanze molto brevi e quindi &egrave; in grado di distinguere tra compattazioni casuale e specifici. Ripiegamento di AK &egrave; stato avviato dalla miscela di flusso interrotto, seguita contemporaneamente da donatore e accettore di fluorescenza e analizzati in termini di distanza e l&#39;efficienza di trasferimento di energia. In stato compresso di AK, osservati dopo il 5-ms tempo morto dello strumento, uno dei segmenti selezionati Mostra un nativo-come separazione dei suoi termini; si forma un ciclo gi&agrave; nello stato compresso. Un secondo segmento che comprende il primo, ma &egrave; pi&ugrave; lungo di 15 residui dimostra una separazione quasi nativo dei suoi termini. Al contrario, un segmento che &egrave; pi&ugrave; breve, ma parte del secondo segmento Mostra una separazione di distanza dei suoi termini alti come un segmento che si estende su quasi la catena intera proteina. Possiamo concludere che una specifica rete di interazioni non-locale, la chiusura di uno o pi&ugrave; cicli, pu&ograve; giocare un ruolo importante nel determinare la proteina pieghevole percorso alle sue prime fasi.

Chiusura anticipata di un lungo ciclo di ripiegamento dell&#39;adenilato chinasi: un possibile ruolo chiave delle interazioni non locale nel ripiegamento iniziale i passaggi.

The rate of folding of globular proteins depends on specific local and nonlocal intramolecular interactions. What is the relative role of these two types of interaction at the initiation of refolding? We address this question by application of a "double kinetics" method based on fast initiation of refolding of site specifically labeled protein samples and detection of the transient distributions of selected intramolecular distances by means of fast measurements of time-resolved fluorescence resonance energy transfer. We determined the distribution of the distance between the ends of a 44-chain segment that includes the AMP(bind) domain, by labeling residues 28 and 71, in Escherichia coli adenylate kinase (AK) and the distribution of the distance between residues 18 and 203, which depends on the overall order of the molecule. That distribution shows two-state transition to the native intramolecular distance at the same rate as that of the cooperative refolding transition of the AK molecule. In sharp contrast, the distance distribution between residues 28 and 71 is already native like at the end of the dead-time of the mixing device. This fast formation of native short distance between two widely separated chain sections can be either dependent on fast folding of the AMP(bind) domain or a result of a very effective nonlocal interaction between specific short clusters of hydrophobic residues. Further experiments on studying the kinetics of folding of selected structural elements in the protein will help determination of the driving force of this early folding event.

Fast subdomain folding prior to the global refolding transition of E. coli adenylate kinase: a double kinetics study.

Le taux de repliement des prot&eacute;ines globulaires d&eacute;pend des interactions intramol&eacute;culaires sp&eacute;cifiques les et non locale. Quel est le r&ocirc;le relatif de ces deux types d&#39;interaction &agrave; l&#39;ouverture de repliement ? Nous abordons cette question par l&#39;application d&#39;une m&eacute;thode de &laquo; double kinetics &raquo; bas&eacute;e sur l&#39;initiation rapide de repliement du site sp&eacute;cifiquement &eacute;tiquet&eacute; &eacute;chantillons de prot&eacute;ines et de d&eacute;tection des distributions transitoires des distances intramol&eacute;culaires s&eacute;lectionn&eacute;s au moyen de mesures rapides de transfert d&#39;&eacute;nergie de r&eacute;sonance time-resolved fluorescence. Nous avons d&eacute;termin&eacute; la r&eacute;partition de la distance entre les extr&eacute;mit&eacute;s d&#39;un segment de 44-cha&icirc;ne qui inclut le domaine de la AMP(bind), par marquage des r&eacute;sidus 28 et 71, l&#39;Escherichia coli ad&eacute;nylate kinase (AK) et la distribution de la distance entre les r&eacute;sidus 18 et 203, qui d&eacute;pend de l&#39;ordre de la mol&eacute;cule. Cette r&eacute;partition fait appara&icirc;tre deux &Eacute;tats transition &agrave; la distance intramol&eacute;culaire native au m&ecirc;me rythme que celui de la coop&eacute;rative de repliement de transition de la mol&eacute;cule de l&#39;AK. L&#39;oppos&eacute;, la distribution de la distance entre les r&eacute;sidus 28 et 71 est d&eacute;j&agrave; native comme &agrave; la fin du temps-morts de l&#39;appareil de mixage. Cette formation rapide de native courte distance entre deux sections de cha&icirc;ne largement s&eacute;par&eacute;es peut &ecirc;tre soit tributaire de pliage rapide du domaine de la AMP(bind) ou le r&eacute;sultat d&#39;une interaction non local tr&egrave;s efficace entre des grappes courtes sp&eacute;cifiques des r&eacute;sidus hydrophobes. D&#39;autres exp&eacute;riences sur l&#39;&eacute;tude de la cin&eacute;tique du pliage de certains &eacute;l&eacute;ments structurels dans la prot&eacute;ine aidera la d&eacute;termination de la force motrice de cet &eacute;v&eacute;nement au d&eacute;but de pliage.

Sous-domaine rapide pliage avant la transition de repliement globale d&#39;e. coli l&#39;ad&eacute;nylate kinase : une &eacute;tude de la cin&eacute;tique double.

Il tasso di ripiegamento di proteine globulari dipende da specifiche interazioni intramolecolari locali e non locali. Che cosa &egrave; il relativo ruolo di questi due tipi di interazione presso l&#39;iniziazione di ripiegamento? Affrontiamo questa domanda di applicazione del metodo &quot;double cinetica&quot; basato sull&#39;avvio veloce del ripiegamento del sito specificatamente etichettati campioni della proteina e la rilevazione delle distribuzioni transitorie di distanze intramolecolari selezionate mediante misurazioni veloci del trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza risolta in tempo. Abbiamo determinato la distribuzione della distanza tra le estremit&agrave; di un segmento di 44-catena che include il dominio AMP(bind), etichettando residui 28 e 71, in chinasi (AK) dell&#39;adenilato Escherichia coli e la distribuzione della distanza tra residui 18 e 203, che dipende dall&#39;ordine globale della molecola. Tale distribuzione dimostra due stati transizione alla distanza intramolecolare nativo allo stesso tasso come quello della cooperativa ripiegamento transizione della molecola AK. In netto contrasto, la distribuzione di distanza tra residui 28 e 71 &egrave; gi&agrave; nativa come alla fine del tempo morto del dispositivo di miscelazione. Questa formazione veloce del nativo breve distanza tra le due sezioni ampiamente separati catena pu&ograve; essere dipendente da pieghevole veloce del dominio AMP(bind) o il risultato di un&#39;interazione non locale molto efficacia tra i cluster specifico breve dei residui idrofobi. Ulteriori esperimenti su studiare la cinetica di piegatura selezionati elementi strutturali della proteina aiuter&agrave; la determinazione della forza motrice di questo evento precoce pieghevole.

Sottodominio veloce pieghevole prima della transizione globale refolding di e. coli adenilato chinasi: uno studio di cinetica doppia.

The information obtained by studying fluorescence decay of labeled biopolymers is a major resource for understanding the dynamics of their conformations and interactions. The lifetime of the excited states of probes attached to macromolecules is in the nanosecond time regime, and hence, a series of snapshot decay curves of such probes might - in principle - yield details of fast changes of ensembles of labeled molecules down to sub-microsecond time resolution. Hence, a major current challenge is the development of instruments for the low noise detection of fluorescence decay curves within the shortest possible time intervals. Here, we report the development of an instrument, picosecond double kinetics apparatus, that enables recording of multiple fluorescence decay curves with picosecond excitation pulses over wide spectral range during microsecond data collection for each curve. The design is based on recording and averaging multiphoton pulses of fluorescence decay using a fast 13 GHz oscilloscope during microsecond time intervals at selected time points over the course of a chemical reaction or conformational transition. We tested this instrument in a double kinetics experiment using reference probes (N-acetyl-tryptophanamide). Very low stochastic noise level was attained, and reliable multi-parameter analysis such as derivation of distance distributions from time resolved FRET (fluorescence resonance excitation energy transfer) measurements was achieved. The advantage of the pulse recording and averaging approach used here relative to double kinetics methods based on the established time correlated single photon counting method, is that in the pulse recording approach, averaging of substantially fewer kinetic experiments is sufficient for obtaining the data. This results in a major reduction in the consumption of labeled samples, which in many cases, enables the performance of important experiments that were not previously feasible.

An instrument for fast acquisition of fluorescence decay curves at picosecond resolution designed for "double kinetics" experiments: application to fluorescence resonance excitation energy transfer study of protein folding.

Les renseignements obtenus par l&#39;&eacute;tude de d&eacute;croissance de la fluorescence des biopolym&egrave;res marqu&eacute;s sont une ressource majeure pour la compr&eacute;hension de la dynamique de leurs interactions et les conformations. La dur&eacute;e de vie des &eacute;tats excit&eacute;s des sondes attach&eacute;es aux macromol&eacute;cules est dans le r&eacute;gime de temps de nanosecondes, et par cons&eacute;quent, une s&eacute;rie de courbes de d&eacute;composition instantan&eacute; de telles sondes pourrait - en principe - donner les d&eacute;tails des changements rapides des ensembles de mol&eacute;cules marqu&eacute;es jusqu&#39;&agrave; r&eacute;solution temporelle microseconde. Par cons&eacute;quent, un grand d&eacute;fi actuel est l&#39;&eacute;laboration d&#39;instruments pour la d&eacute;tection de faible bruit des courbes de d&eacute;composition de fluorescence dans les intervalles de temps plus court. Nous rapportons ici l&#39;&eacute;laboration d&#39;un instrument, picoseconde cin&eacute;tique double appareil, qui permet l&#39;enregistrement de plusieurs courbes de d&eacute;croissance de fluorescence avec des impulsions d&#39;excitation de picoseconde sur large bande spectrale au cours de la collecte de donn&eacute;es microseconde pour chaque courbe. La conception est bas&eacute;e sur l&#39;enregistrement et l&#39;&eacute;talement des impulsions multiphotoniques de d&eacute;sint&eacute;gration de fluorescence &agrave; l&#39;aide d&#39;un oscilloscope 13 GHz rapide pendant les intervalles de temps microseconde &agrave; certains moments au cours d&#39;une r&eacute;action chimique ou transition conformationnelle. Nous avons test&eacute; cet instrument dans une exp&eacute;rience de cin&eacute;tique double &agrave; l&#39;aide de sondes de r&eacute;f&eacute;rence (N-ac&eacute;tyl-tryptophanamide). Tr&egrave;s faible bruit stochastique niveau a &eacute;t&eacute; atteint, et analyse multi-param&egrave;tres fiable comme d&eacute;rivation des distributions de la distance de temps r&eacute;solu mesures de FRET (transfert d&#39;&eacute;nergie d&#39;excitation fluorescence) a &eacute;t&eacute; atteint. L&#39;avantage de l&#39;impulsion d&#39;enregistrement et en moyenne approche utilis&eacute;e ici par rapport au double des m&eacute;thodes cin&eacute;tiques bas&eacute;s sur le temps &eacute;tabli une corr&eacute;lation de photon unique m&eacute;thode de comptage, est que dans l&#39;approche de l&#39;enregistrement de l&#39;impulsion, avec une moyenne de beaucoup moins d&#39;exp&eacute;riences cin&eacute;tiques est suffisante pour obtenir les donn&eacute;es. Cela se traduit par une r&eacute;duction importante de la consommation d&#39;&eacute;chantillons &eacute;tiquet&eacute;s, qui, dans bien des cas, permet l&#39;ex&eacute;cution d&#39;exp&eacute;riences importants qui n&#39;&eacute;tait pas possible auparavant.

Un instrument pour une acquisition rapide de d&eacute;croissance de la fluorescence des courbes &agrave; r&eacute;solution de picoseconde con&ccedil;ue pour des exp&eacute;riences de &laquo; double cin&eacute;tique &raquo;: application &agrave; l&#39;&eacute;tude de transfert des &eacute;nergie d&#39;excitation de la r&eacute;sonance fluorescence du repliement des prot&eacute;ines.

Le informazioni ottenute da studiare il decadimento della fluorescenza di biopolimeri etichette sono una risorsa importante per comprendere le dinamiche delle loro conformazioni e interazioni. La durata degli stati eccitati delle sonde collegati a macromolecole &egrave; in regime di tempo nanosecondi, e quindi, una serie di curve di decadimento dello snapshot di tali sonde potrebbero - in linea di principio - resa dettagli di veloci cambi di insiemi di molecole con etichette fino a risoluzione di tempo sub-microsecond. Quindi, una grande sfida attuale &egrave; lo sviluppo di strumenti per la rilevazione di bassa rumorosit&agrave; delle curve di decadimento di fluorescenza entro gli intervalli pi&ugrave; breve tempo possibile. Qui, segnaliamo lo sviluppo di uno strumento, apparato cinetica doppia picosecondi, che consente la registrazione di pi&ugrave; curve di decadimento di fluorescenza con impulsi di eccitazione picosecondo sopra ampio spettro durante la raccolta dei dati microsecondo per ogni curva. Il design &egrave; basato sulla registrazione e una media di multiphoton impulsi di decadimento di fluorescenza usando un oscilloscopio 13 GHz veloce durante gli intervalli di tempo di microsecondo in punti temporali selezionati nel corso di una reazione chimica o transizione conformazionale. Abbiamo testato questo strumento in un esperimento di cinetica doppia usando sonde di riferimento (N-acetil-tryptophanamide). &Egrave; stato raggiunto il livello di rumorosit&agrave; molto basso stocastico e affidabile analisi multiparametro come derivazione delle distribuzioni di distanza da tempo risolto FRET misurazioni (trasferimento di energia del eccitazione di risonanza di fluorescenza) &egrave; stato raggiunto. Il vantaggio dell&#39;impulso di registrazione e una media di approccio utilizzato qui rispetto alla doppia metodi cinetica basati sul tempo stabilito correlato fotone singolo metodo di conteggio, &egrave; che nell&#39;approccio registrazione di impulso, con una media di sostanzialmente meno esperimenti cinetici &egrave; sufficiente per ottenere i dati. Questo si traduce in un&#39;importante riduzione del consumo di campioni etichettati, che in molti casi, consente l&#39;esecuzione di importanti esperimenti che non sono stati in precedenza fattibile.

Uno strumento per l&#39;acquisizione veloce di decadimento della fluorescenza curve a risoluzione picosecondo progettato per esperimenti &quot;double cinetica&quot;: applicazione studio di trasferimento dell&#39;energia di fluorescenza risonanza eccitazione di ripiegamento proteico.

Article	Year
Early closure of a long loop in the refolding of adenylate kinase: a possible key role of non-local interactions in the initial folding steps. Journal of molecular biology\| PubMed ID: 19013178	2009
Fast subdomain folding prior to the global refolding transition of E. coli adenylate kinase: a double kinetics study. Journal of molecular biology\| PubMed ID: 22898349	2012
An instrument for fast acquisition of fluorescence decay curves at picosecond resolution designed for "double kinetics" experiments: application to fluorescence resonance excitation energy t... The Review of scientific instruments\| PubMed ID: 22938314	2012

Eldad Ben-Ishay

Biography

JoVE Journal Publications

Other Publications