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Recombineering Homologous Recombination Constructs in <em>Drosophila</em>

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

The purpose of this study was to profile gene expression changes in colorectal tumors to identify new targets and strategies for the management of this disease.

Identification and validation of genes involved in the pathogenesis of colorectal cancer using cDNA microarrays and RNA interference.

Le but de cette &eacute;tude &eacute;tait de modifications de l&#39;expression g&eacute;nique Profil dans des tumeurs colorectales &agrave; identifier de nouvelles cibles et strat&eacute;gies pour la gestion de cette maladie.

Identification et validation des g&egrave;nes impliqu&eacute;s dans la pathogen&egrave;se du cancer colorectal &agrave; l&#39;aide de cDNA microarrays et l&#39;interf&eacute;rence d&#39;ARN.

Lo scopo di questo studio era di profilo gene espressione cambiamenti nei tumori del colon-retto per identificare nuovi obiettivi e strategie per la gestione di questa malattia.

Identificazione e validazione di geni coinvolti nella patogenesi del cancro colorettale usando i microarrays del cDNA e interferenza del RNA.

Tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) is a proinflammatory cytokine with important roles in regulating inflammatory responses as well as cell cycle proliferation and apoptosis. Although TNFalpha stimulates apoptosis, it also activates the transcription factor NF-kappa B, and studies have shown that inhibition of NF-kappa B potentiates the cytotoxicity of TNFalpha. Since several chemotherapy agents act like TNFalpha to both promote apoptosis and activate NF-kappa B, understanding the role of NF-kappa B in suppressing apoptosis may have significant clinical applications. To understand the effects of stimulation with TNFalpha and the role of NF-kappa B in regulating this response, a 23k human cDNA microarray was used to screen TNFalpha-inducible genes in HeLa cells. Real-time PCR verified expression changes in 16 of these genes and revealed three distinct temporal patterns of expression after TNFalpha stimulation. Using RNA interference to disrupt expression of the p65 subunit of NF-kappa B, all but two of the genes were shown to depend on this transcription factor for their expression, which correlated well with the existence of NF-kappa B binding sites in most of their promoters. Inflammatory, proapoptotic, and antiapoptotic genes were all shown to be regulated by NF-kappa B, demonstrating the wide variety of targets activated by NF-kappa B signaling and the necessity of differentiating among these genes for therapeutic purposes.

Identification of NF-kappa B-regulated genes induced by TNFalpha utilizing expression profiling and RNA interference.

Le facteur de n&eacute;crose tumorale alpha (TNF alpha) est une cytokine pro-inflammatoire, avec un r&ocirc;le important dans la r&eacute;gulation des r&eacute;ponses inflammatoires ainsi que la prolif&eacute;ration du cycle cellulaire et l&#39;apoptose. Bien que le TNFalpha stimule l&#39;apoptose, il active &eacute;galement le facteur de transcription NF-kappa B, et des &eacute;tudes ont montr&eacute; que l&#39;inhibition de NF-kappa B potentialise la cytotoxicit&eacute; de TNFalpha. &Eacute;tant donn&eacute; que plusieurs agents de chimioth&eacute;rapie agissent comme TNFalpha &agrave; la fois promouvoir l&#39;apoptose et activer NF-kappa B, understanding the role of NF-kappa B dans la suppression de l&#39;apoptose peut avoir des applications cliniques importantes. Pour comprendre les effets de la stimulation avec le TNFalpha et le r&ocirc;le de NF-kappa B dans la r&eacute;gulation de cette r&eacute;ponse, un 23k humain cDNA microarray a &eacute;t&eacute; utilis&eacute; pour d&eacute;pister des g&egrave;nes inductibles par TNFalpha dans les cellules HeLa. PCR en temps r&eacute;el v&eacute;rifi&eacute; les modifications de l&#39;expression dans 16 de ces g&egrave;nes et a r&eacute;v&eacute;l&eacute; trois tendances temporelles distinctes d&#39;expression apr&egrave;s stimulation TNFalpha. &Agrave; l&#39;aide de l&#39;interf&eacute;rence ARN pour perturber l&#39;expression de la sous-unit&eacute; p65 de NF-kappa B, tous sauf deux des g&egrave;nes se sont r&eacute;v&eacute;l&eacute;s d&eacute;pendent de ce facteur de transcription pour leur expression, ce qui a &eacute;t&eacute; bien corr&eacute;l&eacute;e avec l&#39;existence de sites de liaison de NF-kappa B dans la plupart de leurs promoteurs. G&egrave;nes inflammatoires, pro-apoptotique et antiapoptotiques ont tous montr&eacute;s &agrave; assujettir &agrave; NF-kappa B, d&eacute;montrant la grande vari&eacute;t&eacute; de cibles activ&eacute;s par signalisation NF-kappa B et de la n&eacute;cessit&eacute; de diff&eacute;rencier ces g&egrave;nes &agrave; des fins th&eacute;rapeutiques.

Identification de g&egrave;nes r&eacute;gul&eacute;s par B NF-kappa, induite par le TNFalpha utilisant le profilage de l&#39;expression et l&#39;interf&eacute;rence d&#39;ARN.

Fattore di necrosi tumorale alfa (TNF alfa) &egrave; delle citochine proinfiammatorie con ruoli importanti nel regolare le risposte infiammatorie come proliferazione del ciclo cellulare e apoptosi. Sebbene TNFalpha stimola l&#39;apoptosi, attiva anche il fattore di trascrizione NF-kappa B, e gli studi hanno dimostrato che l&#39;inibizione di NF-kappa B potenzia la citotossicit&agrave; di TNFalpha. Dal momento che diversi agenti chemioterapici agiscono come TNFalpha sia promuovere il apoptosis e attivare NF-kappa B, comprensione del ruolo di NF-kappa B nel sopprimere l&#39;apoptosi pu&ograve; avere significative applicazioni cliniche. Per comprendere gli effetti della stimolazione con TNFalpha e il ruolo di NF-kappa B nella regolazione di questa risposta, un 23k umano cDNA microarray &egrave; stato utilizzato a schermo TNFalpha-inducible geni nelle cellule HeLa. PCR in tempo reale verificati cambiamenti di espressione in 16 di questi geni e rivelato tre distinti pattern temporale di espressione dopo stimolazione TNFalpha. Utilizzo di interferenza del RNA di perturbare l&#39;espressione della subunit&agrave; p65 di NF-kappa B, tutti, ma due dei geni sono stati mostrati a dipendere da questo fattore di trascrizione per la loro espressione, che &egrave; correlata con l&#39;esistenza di siti di legame di NF-kappa B nella maggior parte dei loro promotori. Geni antiapoptotici, Miselli e infiammatoria erano tutti dimostrati di essere regolata da NF-kappa B, dimostrando la grande variet&agrave; di bersagli attivati dalla segnalazione di NF-kappa B e la necessit&agrave; di differenziare tra questi geni per scopi terapeutici.

Identificazione di geni di NF-kappa B-regolato indotta da TNFalpha utilizzando expression profiling e interferenza del RNA.

The epidermal growth factor receptor (EGFR) gene is commonly amplified and rearranged in glioblastoma multiforme leading to overexpression of wild-type and mutant EGFRs. Expression of wild-type EGFR ligands, such as transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) or heparin-binding EGF (HB-EGF), is also often increased in gliomas resulting in an autocrine loop that contributes to the growth autonomy of glioma cells. Glioblastoma multiformes express a characteristic EGFR mutant (EGFRvIII, de 2-7) that does not bind ligand, signals constitutively, and is more tumorigenic than the wild-type receptor. However, the downstream signals that mediate this increased tumorigenicity are not well understood. We hypothesized that signals induced specifically by EGFRvIII and not the wild-type receptor are more likely to mediate its increased tumorigenic activity and examined the gene expression profiles resulting from inducible expression of comparable levels of either wild-type EGFR or EGFRvIII in a U251-MG glioma cell line. Expression of EGFRvIII resulted in specific up-regulation of a small group of genes. Remarkably, all these genes, which include TGFA, HB-EGF, EPHA2, IL8, MAP4K4, FOSL1, EMP1, and DUSP6, influence signaling pathways known to play a key role in oncogenesis and function in interconnected networks. Increased expression of EGFRvIII-induced genes was validated by real-time PCR. The mutant receptor does not bind ligand, and EGFRvIII-induced expression of TGF-alpha and HB-EGF suggests that EGFRvIII plays a role in generating an autocrine loop using the wild-type EGFR in glioma. It also raises the possibility that EGFRvIII may signal, at least in part, through the wild-type receptor. Indeed, we show that inhibiting the activity of HB-EGF, a potent mitogen, with neutralizing antibodies reduces cell proliferation induced by expression of EGFRvIII. This suggests that the EGFRvIII-HB-EGF-wild-type EGFR autocrine loop plays an important role in signal transduction by EGFRvIII in glioma cells. We also show by immunohistochemistry that HB-EGF expression correlates with the presence of EGFRvIII in glioblastoma multiforme. Thus, our study provides a new insight into oncogenic signaling by EGFRvIII and improves our understanding of how autocrine loops are generated in glioma.

Differential gene expression analysis reveals generation of an autocrine loop by a mutant epidermal growth factor receptor in glioma cells.

G&egrave;ne epidermal growth factor receptor (EGFR) est g&eacute;n&eacute;ralement amplifi&eacute; et r&eacute;arrang&eacute; dans le glioblastome multiforme, conduisant &agrave; une surexpression des EGFRs sauvage et les mutants. Expression des ligands EGFR de type sauvage, tels que transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) ou liant l&#39;h&eacute;parine EGF (HB-EGF), est &eacute;galement souvent augment&eacute;e dans les gliomes &agrave; une boucle autocrine qui contribue &agrave; l&#39;autonomie de la croissance des cellules de gliome. Glioblastomes multiformes exprimer un caract&eacute;ristique mutant EGFR (EGFRvIII, de 2-7) qui ne lie pas de ligand, signaux constitutivement et est plus tumorig&egrave;nes que le r&eacute;cepteur de type sauvage. Toutefois, les signaux en aval qui v&eacute;hiculent ce tumorig&eacute;nicit&eacute; accrue ne sont pas bien comprises. Nous avons &eacute;mis l&#39;hypoth&egrave;se que les signaux induits sp&eacute;cifiquement par EGFRvIII et pas du r&eacute;cepteur de type sauvage sont plus susceptibles d&#39;arbitrer son augmentation de l&#39;activit&eacute; tumorig&egrave;ne et examin&eacute; les profils d&#39;expression g&eacute;n&eacute;tique r&eacute;sultant d&#39;une expression inductible des niveaux comparables de sauvage EGFR ou EGFRvIII dans une lign&eacute;e de cellules de gliome U251-MG. Expression de EGFRvIII entra&icirc;n&eacute; vers le haut-r&egrave;glement sp&eacute;cifique d&#39;un petit groupe de g&egrave;nes. Remarquablement, tous ces g&egrave;nes, qui comprennent la TGFA, HB-EGF EPHA2, IL8, MAP4K4, FOSL1, EMP1, influence et DUSP6, signaling pathways connus pour jouer un r&ocirc;le cl&eacute; dans l&#39;oncogen&egrave;se et fonction dans les r&eacute;seaux interconnect&eacute;s. Augmentation de l&#39;expression des g&egrave;nes induits par EGFRvIII a &eacute;t&eacute; valid&eacute;e par PCR en temps r&eacute;el. Le r&eacute;cepteur mutant ne lie pas de ligand et induite par l&#39;EGFRvIII expression de TGF-alpha et HB-EGF sugg&egrave;re que EGFRvIII joue un r&ocirc;le dans la cr&eacute;ation d&#39;une boucle autocrine utilisant l&#39;EGFR de type sauvage dans les gliomes. Il soul&egrave;ve &eacute;galement la possibilit&eacute; que EGFRvIII peut signaler, au moins en partie, par l&#39;interm&eacute;diaire du r&eacute;cepteur de type sauvage. En effet, nous montrons qu&#39;en inhibant l&#39;activit&eacute; de l&#39;HB-EGF, un mitog&egrave;ne puissant, avec pr&eacute;sence d&#39;anticorps neutralisants r&eacute;duit la prolif&eacute;ration cellulaire induite par l&#39;expression de EGFRvIII. Ceci sugg&egrave;re que la boucle autocrine de EGFRvIII-HB-EGF-sauvage EGFR joue un r&ocirc;le important dans la transduction du signal par EGFRvIII dans les cellules de gliome. Nous montrons &eacute;galement par immunohistochimie qui expression HB-EGF est corr&eacute;l&eacute;e avec la pr&eacute;sence de EGFRvIII dans le glioblastome multiforme. Ainsi, notre &eacute;tude offre un nouvel aper&ccedil;u de signalisation oncog&egrave;nes par EGFRvIII et am&eacute;liore notre compr&eacute;hension de comment autocrine boucles sont g&eacute;n&eacute;r&eacute;s dans les gliomes.

Analyse de l&#39;expression diff&eacute;rentielle des g&egrave;nes r&eacute;v&egrave;le la g&eacute;n&eacute;ration d&#39;une boucle autocrine par un r&eacute;cepteur de facteur de croissance &eacute;pidermique mutant dans les cellules de gliome.

Il gene di epidermal growth factor receptor (EGFR) &egrave; comunemente amplificato e riorganizzato in glioblastoma multiforme che porta all&#39;iperespressione di EGFRs wild-type e mutanti. Espressione dei ligandi EGFR wild-type, ad esempio transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) o eparina-binding EGF (HB-EGF), &egrave; aumentato anche spesso in gliomi risultante in un loop autocrino che contribuisce per l&#39;autonomia di crescita delle cellule di glioma. Glioblastoma multiformes esprimere un caratteristico mutante EGFR (EGFRvIII, de 2-7) che non legano il ligando, segnali costitutivamente ed &egrave; pi&ugrave; complesso rispetto al recettore wild-type. Tuttavia, i segnali a valle che mediano questo aumento tumorigenicity non sono ben compresi. Abbiamo ipotizzato che segnali indotti in particolare da EGFRvIII e non il recettore wild-type sono pi&ugrave; propensi a mediare la sua maggiore attivit&agrave; inibiscono ed esaminati i profili di espressione genica risultante dall&#39;espressione inducibile di livelli comparabili di EGFR wild-type o di EGFRvIII in una linea di cellule di glioma U251-MG. Espressione di EGFRvIII ha portato in su-regolazione specifici di un piccolo gruppo di geni. Straordinariamente, tutti questi geni, che includono TGFA, influenza HB-EGF, EPHA2, IL8, MAP4K4, FOSL1, EMP1 e DUSP6, noti per giocare un ruolo chiave nell&#39;oncogenesi e funzione di reti interconnesse vie di segnalazione. Aumentata espressione di geni EGFRvIII-indotta &egrave; stata convalidata da PCR in tempo reale. Il recettore mutante non legare il ligando e indotta da EGFRvIII espressione di TGF-alfa e HB-EGF suggerisce che EGFRvIII gioca un ruolo nella generazione di un loop autocrino utilizzando l&#39;EGFR wild-type nel glioma. Genera anche la possibilit&agrave; che EGFRvIII pu&ograve; segnalare, almeno in parte, attraverso il recettore di tipo selvatico. Infatti, ci mostra che un potente mitogeno, con anticorpi neutralizzanti, inibendo l&#39;attivit&agrave; di HB-EGF, riduce la proliferazione cellulare indotta dall&#39;espressione di EGFRvIII. Questo suggerisce che il loop autocrino EGFRvIII-HB-EGF-selvaggio-tipo EGFR gioca un ruolo importante nella trasduzione del segnale da EGFRvIII in cellule di glioma. Mostriamo anche da immunohistochemistry che espressione di HB-EGF correla con la presenza di EGFRvIII nel glioblastoma multiforme. Cos&igrave;, il nostro studio fornisce una visione nuova segnalazione oncogenica di EGFRvIII e migliora la nostra comprensione di come vengono generati loop autocrino nel glioma.

Analisi di espressione genica differenziale rivela la generazione di un loop autocrino di un mutante epidermal growth factor receptor in cellule di glioma.

Il pathway di Notch regola lo sviluppo di molti tessuti e tipi di cellule ed &egrave; coinvolto in una variet&agrave; di malattie umane, rendendola un&#39;attraente destinazione potenziale terapeutica. Questa promessa &egrave; stata limitata dall&#39;assenza di inibitori potenti o agonisti che sono specifici per i recettori di tacca umani individuali (NOTCH1-4). Utilizzando una proiezione funzionale imparziale, abbiamo individuato gli anticorpi monoclonali che specificamente inibire o indurre attivazione proteolitica fenditure nel NOTCH3. Notevolmente, pi&ugrave; potenti inibitori e attivazione legano a sovrapposizione epitopi entro una regione normativo negativo juxtamembrane che protegge il NOTCH3 da proteolisi e attivazione nel suo stato di autoinhibited riposo. Gli anticorpi inibitori ripristinare fenotipi convogliati su cellule 293T NOTCH3 segnalando, ad esempio aumentata proliferazione cellulare, la sopravvivenza e la motilit&agrave;, considerando che l&#39;anticorpo attivazione imita alcuni degli effetti di attivazione tacca indotta dal ligando. Questi risultati forniscono informazioni sui meccanismi di attivazione e tacca autoinhibition e spianano la strada per l&#39;ulteriore sviluppo di specifiche basate su anticorpi modulatori di recettori Notch, che rischiano di essere di utilit&agrave; in una vasta gamma di impostazioni sperimentali e terapeutiche.

Modulazione della tacca di segnalazione di anticorpi specifici per la regione extracellulare negativa normativa NOTCH3.

The Notch pathway regulates the development of many tissues and cell types and is involved in a variety of human diseases, making it an attractive potential therapeutic target. This promise has been limited by the absence of potent inhibitors or agonists that are specific for individual human Notch receptors (NOTCH1-4). Using an unbiased functional screening, we identified monoclonal antibodies that specifically inhibit or induce activating proteolytic cleavages in NOTCH3. Remarkably, the most potent inhibitory and activating antibodies bind to overlapping epitopes within a juxtamembrane negative regulatory region that protects NOTCH3 from proteolysis and activation in its resting autoinhibited state. The inhibitory antibodies revert phenotypes conveyed on 293T cells by NOTCH3 signaling, such as increased cellular proliferation, survival, and motility, whereas the activating antibody mimics some of the effects of ligand-induced Notch activation. These findings provide insights into the mechanisms of Notch autoinhibition and activation and pave the way for the further development of specific antibody-based modulators of the Notch receptors, which are likely to be of utility in a wide range of experimental and therapeutic settings.

Modulation of Notch signaling by antibodies specific for the extracellular negative regulatory region of NOTCH3.

La voie Notch r&eacute;gule le d&eacute;veloppement de beaucoup de types de cellules et tissus et est impliqu&eacute;e dans une vari&eacute;t&eacute; de maladies humaines, ce qui en fait une cible th&eacute;rapeutique potentielle attractive. Cette promesse a &eacute;t&eacute; limit&eacute;e par l&#39;absence d&#39;inhibiteurs puissants ou des agonistes sp&eacute;cifiques pour les r&eacute;cepteurs humains individuels de Notch (Notch 1-4). &Agrave; l&#39;aide de l&#39;analyse fonctionnelle non biais&eacute;e, nous avons identifi&eacute; des anticorps monoclonaux qui sp&eacute;cifiquement inhiber ou induire l&#39;activation des clivages prot&eacute;olytiques dans NOTCH3. Remarquablement, les anticorps inhibiteurs et activant plus puissants lient au chevauchement des &eacute;pitopes dans une r&eacute;gion r&eacute;gulatrice n&eacute;gative juxtamembrane qui prot&egrave;ge les NOTCH3 prot&eacute;olyse et activation dans son &eacute;tat de repos autoinhibited. Les anticorps inhibiteurs revient ph&eacute;notypes transmis sur les cellules 293 t par NOTCH3 signalisation, tels que la prolif&eacute;ration cellulaire accrue, la survie et la motilit&eacute;, consid&eacute;rant que l&#39;anticorps activation imite certains des effets de l&#39;activation de Notch induite par le ligand. Ces r&eacute;sultats donnent des indications sur les m&eacute;canismes d&#39;auto-inhibition de Notch et activation et ouvrent la voie &agrave; la poursuite du d&eacute;veloppement des modulateurs de base d&#39;anticorps sp&eacute;cifiques des r&eacute;cepteurs Notch, qui risquent d&#39;&ecirc;tre d&#39;utilit&eacute; dans un vaste &eacute;ventail de contextes exp&eacute;rimentales et th&eacute;rapeutiques.

Modulation de l&#39;encoche de signalisation par des anticorps sp&eacute;cifiques pour la r&eacute;gion r&eacute;gulatrice n&eacute;gative extracellulaire de NOTCH3.

&#x795E;&#x7ECF;&#x5143;&#x9700;&#x8981;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x4E13;&#x95E8;&#x8D29;&#x5356;&#x4EBA;&#x53E3;&#xFF0C;&#x7279;&#x522B;&#x662F;&#x5728;&#x795E;&#x7ECF;&#x7A81;&#x89E6;&#x7684;&#x80DE;&#x5185;&#x819C;&#x3002;Rab &#x86CB;&#x767D;&#x88AB;&#x8BA4;&#x4E3A;&#x662F;&#x4E3B;&#x76D1;&#x7BA1;&#x8005;&#x7684;&#x819C;&#x8D29;&#x8FD0;&#x4E2D;&#x7684;&#x6240;&#x6709;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#xFF0C;&#x5E76;&#x53EA;&#x6709;&#x5F88;&#x5C11;&#x6570; Rabs &#x6709;&#x5DF2;&#x77E5;&#x795E;&#x7ECF;&#x5143;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x529F;&#x80FD;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x795E;&#x7ECF;&#x5143;&#x8868;&#x8FBE;&#x3001; &#x4E9A;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5B9A;&#x4F4D;&#x548C;&#x529F;&#x80FD;&#x7684; Rab &#x86CB;&#x767D;&#x5728;&#x751F;&#x7269;&#x8111;&#x4E2D;&#x7684;&#x7B2C;&#x4E00;&#x6B21;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x8868;&#x5F81;&#x3002;

Rab &#x86CB;&#x767D;&#x5728;&#x679C;&#x8747;&#x4E2D;&#x7684;&#x7A81;&#x89E6;&#x529F;&#x80FD;&#x7684;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x53D1;&#x73B0;&#x3002;

Neurons require highly specialized intracellular membrane trafficking, especially at synapses. Rab GTPases are considered master regulators of membrane trafficking in all cells, and only very few Rabs have known neuron-specific functions. Here, we present the first systematic characterization of neuronal expression, subcellular localization, and function of Rab GTPases in an organism with a brain.

Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila.

Les neurones n&#xE9;cessitent hautement sp&#xE9;cialis&#xE9; trafic membranaire intracellulaire, en particulier au niveau des synapses. Rab GTPases sont consid&#xE9;r&#xE9;s comme les principaux r&#xE9;gulateurs du trafic membranaire dans toutes les cellules, et seulement tr&#xE8;s peu de Rabs ont connu neurone fonctions sp&#xE9;cifiques. Ici, nous pr&#xE9;sentons la premi&#xE8;re caract&#xE9;risation syst&#xE9;matique de l&#x26;#39;expression neuronale, la localisation subcellulaire, et la fonction des GTPases Rab dans un organisme avec un cerveau.

D&#xE9;couverte syst&#xE9;matique des Rab GTPases avec des fonctions synaptiques chez la drosophile

Neuronen erfordern hoch spezialisierte intrazellul&auml;ren Membran, Menschenhandel, vor allem an Synapsen. Rab GTPases gelten als Meister Regulierungsbeh&ouml;rden Membran Menschenhandel in allen Zellen, und nur sehr wenige Rabs Neuron-spezifische Funktionen bekannt haben. Hier pr&auml;sentieren wir die erste systematische Charakterisierung der neuronalen Ausdruck, subzellulare Lokalisation und Funktion der Rab GTPases im Organismus mit einem Gehirn.

Systematische Entdeckung der Rab GTPases mit synaptischen Funktionen in Drosophila.

Neuroni richiedono altamente specializzato membrana intracellulare traffico, soprattutto alla sinapsi. Rab GTPases sono considerati regolatori master della membrana traffico in tutte le cellule e solo molto poche Rabs hanno conosciuto le funzioni specifiche del neurone. Qui, vi presentiamo la prima caratterizzazione sistematica di espressione neuronale, localizzazione sottocellulare e funzione di Rab GTPases in un organismo con un cervello.

Sistematica scoperta di Rab GTPases con funzioni sinaptiche in drosofila.

&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30ED;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x7279;&#x306B;&#x30B7;&#x30CA;&#x30D7;&#x30B9;&#x3067;&#x3001;&#x5C02;&#x9580;&#x6027;&#x306E;&#x9AD8;&#x3044;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x8F38;&#x9001;&#x3092;&#x5FC5;&#x8981;&#x3068;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30E9;&#x30D6;&#x306E;GTP&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306F;&#x3001;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x819C;&#x8F38;&#x9001;&#x306E;&#x30DE;&#x30B9;&#x30BF;&#x30FC;&#x30EC;&#x30AE;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3068;&#x8003;&#x3048;&#x3066;&#x304A;&#x308A;&#x3001;&#x3054;&#x304F;&#x5C11;&#x6570;&#x306E;Rabs&#x306F;&#x3001;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30ED;&#x30F3;&#x56FA;&#x6709;&#x306E;&#x95A2;&#x6570;&#x3092;&#x77E5;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30ED;&#x30F3;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x5C40;&#x5728;&#x3001;&#x8133;&#x306E;&#x751F;&#x4F53;&#x5185;&#x3067;&#x306E;Rab GTP&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x95A2;&#x6570;&#x306E;&#x6700;&#x521D;&#x306E;&#x4F53;&#x7CFB;&#x7684;&#x306A;&#x7279;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3002;

&#x30B7;&#x30E7;&#x30A6;&#x30B8;&#x30E7;&#x30A6;&#x30D0;&#x30A8;&#x306E;&#x30B7;&#x30CA;&#x30D7;&#x30B9;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x30E9;&#x30D6;GTP&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x7CFB;&#x7D71;&#x7684;&#x63A2;&#x7D22;

&#xB274;&#xB7F0; &#xACE0;&#xB3C4;&#xB85C; &#xC804;&#xBB38;&#xD654; &#xB41C; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; &#xB9C9; &#xC778;&#xC2E0; &#xB9E4;&#xB9E4;, &#xD2B9;&#xD788; &#xC2DC; &#xB0C5; &#xC2A4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD544;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xB7A9; GTPases &#xB9C8;&#xC2A4;&#xD130; &#xB808; &#xADE4; &#xB808;&#xC774; &#xD130;&#xB85C; &#xAC04;&#xC8FC; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xC138;&#xD3EC;&#xC640;&#xB9CC; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xC778;&#xC2E0; &#xB9E4;&#xB9E4;&#xC758; &#xBA87; Rabs &#xC2E0;&#xACBD; &#xAD00;&#xB828; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xC54C;&#xACE0; &#xC788;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC2E0;&#xACBD; &#xC2DD;, subcellular &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; &#xAE30;&#xB2A5; &#xB7A9; Gtpases&#xC758; &#xB450;&#xB1CC;&#xC640; &#xC720;&#xAE30; &#xCCB4;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xCD5C;&#xCD08;&#xC758; &#xCCB4;&#xACC4;&#xC801;&#xC778; &#xD2B9;&#xC131;&#xD654; &#xC120;&#xBB3C;&#xC774;.

&#xCD08;&#xD30C;&#xB9AC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2DC; &#xB0C5; &#xC2A4; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xAC00;&#xC9C4; &#xB7A9; Gtpases&#xC758; &#xCCB4;&#xACC4;&#xC801;&#xC778; &#xBC1C;&#xACAC;.

Las neuronas necesitan el tr&#xE1;fico intracelular de membrana altamente especializado, especialmente en las sinapsis. Rab GTPasas son considerados reguladores maestros de la membrana de la trata en todas las c&#xE9;lulas, y s&#xF3;lo muy pocos Rabs han conocido las neuronas espec&#xED;ficas funciones. A continuaci&#xF3;n, presentamos la primera caracterizaci&#xF3;n sistem&#xE1;tica de la expresi&#xF3;n neuronal, localizaci&#xF3;n subcelular y la funci&#xF3;n de GTPasas Rab en un organismo con un cerebro.

Descubrimiento sistem&#xE1;tico de Rab GTPasas con funciones sin&#xE1;pticas en Drosophila

Evaluating how an individual gene contributes to a particular biological process benefits greatly from a comprehensive understanding of all members of its gene family. Such knowledge is ideally obtained using multicellular model organisms, which provide rapid and decisive platforms for determining gene function. We recently established a novel transgenesis platform in Drosophila to systematically knock out all members of the Rab small GTPase family of membrane regulators. This platform combines BAC transgenesis/recombineering with ends-out homologous recombinations and Gateway(TM) technologies and provides a new rapid and scalable method that eases the manipulation of endogenous loci. This method not only allows for the generation of molecularly defined lesions, but also the precise replacement or tagging of genes in their endogenous loci. Using this method, we found that up to half of all Rab GTPases exhibit enriched expression at synapses in the nervous system. Here we provide critical details about the underlying recombineering and transgenesis method, new cassettes for tagging endogenous loci and information on important parameters that will allow Drosophila researchers to target members of other gene families.

Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study.

&Eacute;valuer comment un g&egrave;ne individuel contribue &agrave; un processus biologique particulier b&eacute;n&eacute;ficie grandement d&#39;une compr&eacute;hension globale de tous les membres de sa famille de g&egrave;nes. Une telle connaissance est id&eacute;alement obtenue d&#39;organismes multicellulaires mod&egrave;le qui renferment des plates-formes rapides et d&eacute;cisives pour d&eacute;terminer la fonction du g&egrave;ne. Nous avons r&eacute;cemment cr&eacute;&eacute; une plate-forme de transg&eacute;n&egrave;se roman chez la drosophile pour assommer syst&eacute;matiquement de tous les membres de la famille GTPase Rab de r&eacute;gulateurs de la membrane. Cette plateforme combine BAC transg&eacute;n&egrave;se/recombineering avec les extr&eacute;mit&eacute;s des recombinaisons homologues et Gateway(TM) technologies et fournit une nouvelle m&eacute;thode rapide et &eacute;volutive qui facilite la manipulation des loci endog&egrave;ne. Cette m&eacute;thode permet non seulement pour la g&eacute;n&eacute;ration des l&eacute;sions mol&eacute;culairement d&eacute;finies, mais aussi le remplacement pr&eacute;cis ou marquage des g&egrave;nes dans leurs locus endog&egrave;nes. En utilisant cette m&eacute;thode, nous avons constat&eacute; que jusqu&#39;&agrave; la moiti&eacute; de tous les Rab GTPases exposition enrichie expression aux synapses dans le syst&egrave;me nerveux. Ici, nous fournissons des d&eacute;tails essentiels sur la recombineering sous-jacente et la m&eacute;thode de transg&eacute;n&egrave;se, le nouvelles cassettes pour marquage locus endog&egrave;nes et informations sur les param&egrave;tres importants qui permettront aux chercheurs de drosophile aux membres de la cible des autres familles de g&egrave;nes.

Combinaison de recombineering et se termine sur la recombinaison homologue pour caract&eacute;riser syst&eacute;matiquement les familles de g&egrave;nes de Drosophila : Rab GTPases comme &eacute;tude de cas.

Valutare come un singolo gene contribuisce ad un particolare processo biologico beneficia notevolmente una comprensione completa di tutti i membri della sua famiglia genica. Tale conoscenza &egrave; idealmente ottenuto utilizzando organismi pluricellulari modello, che forniscono piattaforme rapide e decisive per determinare la funzione del gene. Abbiamo recentemente istituito una piattaforma transgenesi romanzo in drosofila k.o. sistematicamente tutti i membri della famiglia Rab piccola GTPasi di regolatori a membrana. Questa piattaforma unisce BAC transgenesi/recombineering con estremit&agrave;-out ricombinazioni omologhe e Gateway(TM) tecnologie e fornisce un nuovo metodo di rapido e scalabile che facilita la manipolazione dei loci endogeni. Questo metodo consente non solo per la generazione di molecolarmente definite lesioni, ma anche la sostituzione del precisa o codifica dei geni nel loro loci endogeni. Utilizzando questo metodo, abbiamo trovato che fino alla met&agrave; di tutte le Rab GTPases esposizione arricchita espressione a sinapsi del sistema nervoso. Qui forniamo dettagli critici circa il recombineering sottostante e metodo di transgenesi, nuove cassette per il tagging loci endogeni e informazioni su importanti parametri che permetter&agrave; i ricercatori della Drosophila ai altri familiari gene bersaglio.

Combinazione di recombineering e ricombinazione omologa out finisce per caratterizzare sistematicamente le famiglie di gene di Drosophila: Rab GTPases come un caso di studio.

Article	Year
Identification and validation of genes involved in the pathogenesis of colorectal cancer using cDNA microarrays and RNA interference. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research\| PubMed ID: 12631590	2003
Identification of NF-kappa B-regulated genes induced by TNFalpha utilizing expression profiling and RNA interference. Oncogene\| PubMed ID: 12673210	2003
Differential gene expression analysis reveals generation of an autocrine loop by a mutant epidermal growth factor receptor in glioma cells. Cancer research\| PubMed ID: 16424019	2006
Modulation of Notch signaling by antibodies specific for the extracellular negative regulatory region of NOTCH3. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 18182388	2008
Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current biology : CB\| PubMed ID: 22000105	2011
Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study. Communicative & integrative biology\| PubMed ID: 22808327	2012

Shane Scoggin

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