visualization-analysis-mrna-molecules-using-fluorescence-situ

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence <em>In Situ</em> Hybridization in <em>Saccharomyces cerevisiae</em>

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Princeton University

&#x632F;&#x8361;&#x4E2D;&#x5F88;&#x5927;&#x4E00;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x9175;&#x6BCD;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x6A21;&#x5F0F;&#x4E0E;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x5173;&#x8054;&quot;&#x4EE3;&#x8C22;&#x5468;&#x671F;&#xFF0C;&quot;&#x901A;&#x5E38;&#x88AB;&#x89C6;&#x4E3A;&#x4EC5;&#x5728; prestarved&#x3001; &#x8FDE;&#x7EED;&#x6587;&#x5316;&#x4E2D;&#x7684;&#x9175;&#x6BCD;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x9C7C;&#x7684; mRNA &#x4E2D;&#x4F7F;&#x7528;&#x5355;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x6765;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x632F;&#x8361;&#x53D1;&#x751F;&#x5728;&#x7ED8;&#x5236;&#x5728;&#x6052;&#x5316;&#x5668;&#x5448;&#x6307;&#x6570;&#x7EA7;&#x589E;&#x957F;&#x7684;&#x4E0D;&#x540C;&#x6B65;&#x6587;&#x5316;&#x4ECE;&#x5355;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7684;&#x5047;&#x8BBE;&#x3002;&#x4ECE;&#x540C;&#x6B65;&#x6587;&#x5316;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x6570;&#x636E;&#x88AB;&#x7528;&#x6765;&#x9884;&#x6D4B;&#x7684;&#x5206;&#x6CCC;&#x4E0D;&#x540C;&#x6B65;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x57FA;&#x56E0;&#x6210;&#x5BF9;&#x4ECE;&#x91CD;&#x5408;&#x5916;&#x89C2;&#x3002;&#x9C7C;&#x7ED3;&#x679C;&#x7684;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x663E;&#x793A;&#x589E;&#x957F;&#x7F13;&#x6162;&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x9650;&#x5236;&#x6216;&#x78F7;&#x9650;&#x5236;&#x5355;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x540C;&#x6B65;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x663E;&#x793A;&#x9884;&#x6D4B;&#x7684;&#x632F;&#x8361;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F97;&#x51FA;&#x7684;&#x7ED3;&#x8BBA;&#x9175;&#x6BCD;&#x4EE3;&#x8C22;&#x5468;&#x671F;&#x662F;&#x9175;&#x6BCD;&#x4EE3;&#x8C22;&#x7684;&#x5185;&#x5728;&#x5C5E;&#x6027;&#xFF0C;&#x4E0D;&#x4F9D;&#x8D56;&#x4E8E;&#x540C;&#x6B65;&#x6216;&#x5916;&#x90E8;&#x9650;&#x5236;&#x751F;&#x957F;&#x7684;&#x78B3;&#x6E90;&#x3002;

&#x4EE3;&#x8C22;&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x6216;&#x78F7;&#x9178;&#x4E0A;&#x6709;&#x9650;&#x7684;&#x4E0D;&#x540C;&#x6B65;&#x7A33;&#x6001;&#x7684;&#x4EBA;&#x53E3;&#x4ECE;&#x5355;&#x4E00;&#x7684;&#x9175;&#x6BCD;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x5FAA;&#x73AF;&#x3002;

Oscillations in patterns of expression of a large fraction of yeast genes are associated with the "metabolic cycle," usually seen only in prestarved, continuous cultures of yeast. We used FISH of mRNA in individual cells to test the hypothesis that these oscillations happen in single cells drawn from unsynchronized cultures growing exponentially in chemostats. Gene-expression data from synchronized cultures were used to predict coincident appearance of mRNAs from pairs of genes in the unsynchronized cells. Quantitative analysis of the FISH results shows that individual unsynchronized cells growing slowly because of glucose limitation or phosphate limitation show the predicted oscillations. We conclude that the yeast metabolic cycle is an intrinsic property of yeast metabolism and does not depend on either synchronization or external limitation of growth by the carbon source.

Metabolic cycling in single yeast cells from unsynchronized steady-state populations limited on glucose or phosphate.

Oscillations dans les modes d&#39;expression d&#39;une grande partie des g&egrave;nes de la levure sont associ&eacute;es avec le &laquo; cycle m&eacute;tabolique, &raquo; g&eacute;n&eacute;ralement vu seulement dans les cultures prestarved, continues de levure. Nous avons utilis&eacute; des poissons de l&#39;ARNm dans des cellules individuelles pour v&eacute;rifier l&#39;hypoth&egrave;se que ces oscillations se produisent dans les cellules provenant de cultures non synchronis&eacute;s en croissance exponentielle en ch&eacute;mostats. Donn&eacute;es d&#39;expression g&eacute;nique de cultures synchronis&eacute;es furent utilis&eacute;es pour pr&eacute;dire l&#39;apparition co&iuml;ncide d&#39;ARNm de paires de g&egrave;nes dans les cellules non synchronis&eacute;s. Analyse quantitative des r&eacute;sultats poisson montre que les cellules individuelles non synchronis&eacute;s de plus en plus lentement &agrave; cause de la limitation de la glyc&eacute;mie ou limitation de phosphate montrent les oscillations pr&eacute;dites. Nous concluons que le cycle m&eacute;tabolique de la levure est une propri&eacute;t&eacute; intrins&egrave;que du m&eacute;tabolisme de la levure et ne d&eacute;pend pas de la synchronisation ou limitation externe de la croissance par la source de carbone.

M&eacute;tabolique cyclisme dans les cellules de levure unique provenant de populations de stationnaire non synchronis&eacute;es limit&eacute;es sur le glucose ou le phosphate.

Schwingungen im Muster des Ausdrucks der ein gro&szlig;er Teil der Hefe-Gene sind &quot;metabolische Zyklus,&quot; in der Regel nur in prestarved, kontinuierliche Kulturen der Hefe gesehen zugeordnet. Wir verwendet Fisch von mRNA in einzelne Zellen, um die Hypothese zu testen, dass diese Schwingungen in Einzelzellen, gezeichnet von nicht synchronisierten Kulturen exponentiell in Chemostats passieren. Genexpression Daten aus synchronisierten Kulturen wurden verwendet, um zusammenfallenden Darstellung von mRNAs von Paaren der Gene in den Zellen nicht synchronisierten vorherzusagen. Quantitative Analyse der Fisch Ergebnisse zeigt, dass nicht synchronisierte Einzelzellen w&auml;chst langsam wegen Glukose Beschr&auml;nkung oder Phosphat-Beschr&auml;nkung die vorhergesagten Schwingungen zeigen. Wir schlie&szlig;en, dass der Hefe metabolische Zyklus eine intrinsische Eigenschaft des Hefe-Stoffwechsels ist und Synchronisierung oder externe Beschr&auml;nkung des Wachstums durch die Kohlenstoffquelle nicht abh&auml;ngig.

Metabolische Radfahren in einzelne Hefezellen nicht synchronisierten station&auml;ren Bev&ouml;lkerungen begrenzt auf Glukose oder Phosphat.

Oscillazioni nel pattern di espressione di una grande frazione dei geni di lievito sono associate con il &quot;ciclo metabolico,&quot; di solito visto solo nelle culture prestarved, continue di lievito. Abbiamo usato il pesce di mRNA nelle singole celle per testare l&#39;ipotesi che queste oscillazioni accadono in singole cellule provenienti da culture non sincronizzate cresce esponenzialmente in chemostati. Dati di espressione genica da colture sincronizzate sono stati utilizzati per predire coincida aspetto dei mRNAs da coppie di geni nelle cellule non sincronizzate. Analisi quantitativa dei risultati pesce dimostra che le singole celle non sincronizzate cresce lentamente a causa della limitazione di glucosio o la limitazione di fosfato Visualizza le oscillazioni predetta. Concludiamo che il ciclo metabolico di lievito &egrave; una propriet&agrave; intrinseca del metabolismo del lievito e non dipende dalla sincronizzazione o limitazione esterna della crescita con la fonte di carbonio.

Metabolica in bicicletta in cellule di lievito singolo non sincronizzate steady-state popolazioni limitate su glucosio o fosfato.

&#x9175;&#x6BCD;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x5927;&#x90E8;&#x5206;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x632F;&#x52D5;&#x300C;&#x306E;&#x307F; prestarved&#x3001;&#x9023;&#x7D9A;&#x9175;&#x6BCD;&#x306E;&#x57F9;&#x990A;&#x306F;&#x901A;&#x5E38;&#x898B;&quot;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x300D;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x632F;&#x52D5;&#x306F; chemostats &#x3067;&#x6307;&#x6570;&#x95A2;&#x6570;&#x7684;&#x306B;&#x6210;&#x9577;&#x304C;&#x975E;&#x540C;&#x671F;&#x306E;&#x6587;&#x5316;&#x304B;&#x3089;&#x63CF;&#x304B;&#x308C;&#x305F;&#x5358;&#x4E00;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x8D77;&#x3053;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x4EEE;&#x8AAC;&#x3092;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x500B;&#x3005; &#x306E;&#x30BB;&#x30EB;&#x306E; mRNA &#x306E;&#x9B5A;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x540C;&#x671F;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6587;&#x5316;&#x304B;&#x3089;&#x975E;&#x540C;&#x671F;&#x30BB;&#x30EB;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x7D44;&#x304B;&#x3089;&#x306E; Mrna &#x306E;&#x4E00;&#x81F4;&#x306E;&#x5916;&#x89B3;&#x3092;&#x4E88;&#x6E2C;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x9B5A;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306E;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x306F;&#x30B0;&#x30EB;&#x30B3;&#x30FC;&#x30B9;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5236;&#x9650;&#x306E;&#x5236;&#x9650;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x3086;&#x3063;&#x304F;&#x308A;&#x3068;&#x6210;&#x9577;&#x3057;&#x3066;&#x500B;&#x3005; &#x306E;&#x975E;&#x540C;&#x671F;&#x30BB;&#x30EB;&#x4E88;&#x6E2C;&#x306E;&#x632F;&#x52D5;&#x3067;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x9175;&#x6BCD;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x9175;&#x6BCD;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x8FBC;&#x307F;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D1;&#x30C6;&#x30A3;&#x3057;&#x3001;&#x540C;&#x671F;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x5916;&#x90E8;&#x5236;&#x9650;&#x6210;&#x9577;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x70AD;&#x7D20;&#x6E90;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x306A;&#x3044;&#x3092;&#x7DE0;&#x7D50;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x4EE3;&#x8B1D;&#x5358;&#x4E00;&#x9175;&#x6BCD;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30B0;&#x30EB;&#x30B3;&#x30FC;&#x30B9;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x9650;&#x5B9A;&#x672A;&#x540C;&#x671F;&#x306E;&#x5B9A;&#x5E38;&#x96C6;&#x56E3;&#x304B;&#x3089;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xD6A8; &#xBAA8; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xD070; &#xBD84;&#xC218;&#xC758; &#xD45C;&#xD604;&#xC758; &#xD328;&#xD134;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9C4;&#xB3D9; &quot;&#xB300;&#xC0AC; &#xC0AC;&#xC774;&#xD074;,&quot; &#xBCF4;&#xD1B5; &#xD6A8; prestarved, &#xC9C0;&#xC18D;&#xC801;&#xC778; &#xBB38;&#xD654;&#xC5D0;&#xB9CC; &#xBCFC; &#xC218;&#xC640; &#xAD00;&#xB828;&#xC774; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC9C4;&#xB3D9; chemostats &#xAE30; &#xD558; &#xAE09;&#xC218;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC99D;&#xAC00; &#xD558; &#xACE0; &#xB3D9;&#xAE30;&#xD654; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; &#xBB38;&#xD654;&#xC5D0;&#xC11C; &#xADF8;&#xB824;&#xC9C4; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xB294; &#xAC00;&#xC124;&#xC744; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xC140;&#xC5D0; Mrna&#xC758; &#xC0DD;&#xC120;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB3D9;&#xAE30;&#xD654; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC30D;&#xC5D0;&#xC11C; Mrnas&#xC758; &#xC77C;&#xCE58; &#xBAA8;&#xC591;&#xC744; &#xC608;&#xCE21; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xAE30;&#xD654; &#xB41C; &#xBB38;&#xD654;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBC1C;&#xD604; &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xBB3C;&#xACE0;&#xAE30; &#xACB0;&#xACFC;&#xC758; &#xC815;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xB3D9;&#xAE30;&#xD654; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; &#xC138;&#xD3EC; &#xD3EC;&#xB3C4; &#xB2F9; &#xC81C;&#xD55C; &#xB610;&#xB294; &#xC778;&#xC0B0; &#xC5FC; &#xC81C;&#xD55C;&#xC73C;&#xB85C; &#xC778;&#xD574; &#xCC9C;&#xCC9C;&#xD788; &#xC131;&#xC7A5; &#xC608;&#xCE21;&#xB41C; &#xC9C4;&#xB3D9; &#xD45C;&#xC2DC; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xACB0;&#xB860; &#xD6A8; &#xBAA8; &#xB300;&#xC0AC; &#xC0AC;&#xC774;&#xD074;&#xC740; &#xD6A8; &#xBAA8; &#xB300;&#xC0AC;&#xC758; &#xBCF8;&#xC9C8;&#xC801;&#xC778; &#xC18D;&#xC131; &#xB3D9;&#xAE30;&#xD654; &#xB610;&#xB294; &#xC678;&#xBD80; &#xD0C4;&#xC18C; &#xC18C;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC131;&#xC7A5; &#xD55C;&#xACC4;&#xC5D0; &#xC758;&#xC874; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB300;&#xC0AC; &#xD55C; &#xD6A8; &#xBAA8; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD3EC;&#xB3C4; &#xB2F9; &#xB610;&#xB294; &#xC778;&#xC0B0; &#xC5FC; &#xC81C;&#xD55C; &#xB3D9;&#xAE30;&#xD654; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; &#xC548;&#xC815; &#xB41C; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC758; &#xC778;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD074;&#xB9C1;.

Las variaciones en los patrones de expresi&oacute;n de una gran parte de los genes de la levadura se asocian con el &quot;ciclo metab&oacute;lico,&quot; generalmente se observa s&oacute;lo en las culturas prestarved, continuas de levadura. Utilizamos peces de ARNm en c&eacute;lulas individuales para probar la hip&oacute;tesis de que estas oscilaciones ocurren en las c&eacute;lulas extra&iacute;das de culturas sincronizadas creciendo exponencialmente en chemostats. Datos de expresi&oacute;n g&eacute;nica de culturas sincronizadas fueron usados para predecir la aparici&oacute;n coincidente de mRNAs de pares de genes en las c&eacute;lulas no sincronizadas. An&aacute;lisis cuantitativo de los resultados de pescado demuestra que las c&eacute;lulas individuales sincronizadas creciendo lentamente debido a la limitaci&oacute;n de la glucosa o limitaci&oacute;n de fosfato Mostrar las oscilaciones previstas. Concluimos que el ciclo metab&oacute;lico de la levadura es una propiedad intr&iacute;nseca del metabolismo de la levadura y no depende de sincronizaci&oacute;n o limitaci&oacute;n externa de crecimiento por la fuente de carbono.

Metab&oacute;licos en las c&eacute;lulas de levadura sola en bicicleta de poblaciones de estado estacionario no sincronizadas limitadas en glucosa o fosfato.

Ryan Briehof

Biography

JoVE Journal Publications

Other Publications