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Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Massachusetts Institute of Technology

Descriviamo un modello computazionale del DNA shuffling basato sulla termodinamica e la cinetica di questo processo. Il modello indipendentemente canzoni un insieme rappresentativo di molecole di DNA e registra i loro stati in ogni fase di una reazione di mescolamento. Successivamente, questi dati possono essere analizzati per fornire informazioni su qualsiasi metrica pertinente, tra cui l&#39;efficienza del rimontaggio, crossover numero, tipo e distribuzione e distribuzioni lunghezza della sequenza di DNA. La capacit&agrave; predittiva del modello &egrave; stata validata in confronto a tre insiemi indipendenti di dati sperimentali e l&#39;analisi dei risultati della simulazione ha portato a diverse intuizioni uniche nel DNA shuffling processo. Esaminiamo un buon compromesso tra la frequenza di crossover e rimontaggio efficienza e illustrare gli effetti dei parametri sperimentali su questo rapporto. Inoltre, si parler&agrave; di condizioni che favoriscono la formazione di inutili sequenze di DNA &quot;spazzatura&quot; o sequenze multimerica contenente pi&ugrave; copie del prodotto ricomposto. Questo modello sar&agrave; quindi di aiuto nella progettazione delle condizioni ottimali di reazione mescolamento.

Analisi computazionale e sperimentale del DNA shuffling.

We describe a computational model of DNA shuffling based on the thermodynamics and kinetics of this process. The model independently tracks a representative ensemble of DNA molecules and records their states at every stage of a shuffling reaction. These data can subsequently be analyzed to yield information on any relevant metric, including reassembly efficiency, crossover number, type and distribution, and DNA sequence length distributions. The predictive ability of the model was validated by comparison to three independent sets of experimental data, and analysis of the simulation results led to several unique insights into the DNA shuffling process. We examine a tradeoff between crossover frequency and reassembly efficiency and illustrate the effects of experimental parameters on this relationship. Furthermore, we discuss conditions that promote the formation of useless "junk" DNA sequences or multimeric sequences containing multiple copies of the reassembled product. This model will therefore aid in the design of optimal shuffling reaction conditions.

Computational and experimental analysis of DNA shuffling.

Les auteurs d&eacute;crivent un mod&egrave;le informatique de DNA shuffling fond&eacute; sur la thermodynamique et la cin&eacute;tique de ce processus. Le mod&egrave;le ind&eacute;pendamment suit un ensemble repr&eacute;sentatif des mol&eacute;cules d&#39;ADN et enregistre leurs &Eacute;tats &agrave; chaque &eacute;tape d&#39;une s&eacute;rie al&eacute;atoire de r&eacute;action. Ces donn&eacute;es peuvent ensuite &ecirc;tre analys&eacute;es pour obtenir des informations sur toute mesure pertinente, y compris l&#39;efficacit&eacute; du remontage, crossover nombre, type et distribution et distributions de longueurs de s&eacute;quence ADN. La capacit&eacute; de pr&eacute;diction du mod&egrave;le a &eacute;t&eacute; valid&eacute;e par comparaison aux trois s&eacute;ries ind&eacute;pendantes de donn&eacute;es exp&eacute;rimentales et l&#39;analyse des r&eacute;sultats de la simulation a conduit &agrave; plusieurs un aper&ccedil;u unique dans l&#39;ADN, processus de brassage. Nous examiner un compromis entre la fr&eacute;quence de coupure et d&#39;efficacit&eacute; du remontage et illustrer les effets des param&egrave;tres exp&eacute;rimentaux sur cette relation. En outre, nous discutons des conditions qui favorisent la formation de &laquo; junk &raquo; inutiles de s&eacute;quences de l&#39;ADN ou des s&eacute;quences de multim&egrave;res contenant plusieurs copies du produit remont&eacute;. Ce mod&egrave;le facilitera donc la conception des conditions optimales de r&eacute;action s&eacute;rie al&eacute;atoire.

Analyse computationnelle et exp&eacute;rimentale d&#39;ADN tra&icirc;nant.

AAV gene therapy vectors have significant clinical promise, but serum neutralization poses a challenge that must be overcome. We have examined the potential of conjugating the AAV surface with activated polyethylene glycol chains to protect the vector from neutralizing antibodies. Two key parameters were investigated: the polymer chain size and the PEG:lysine conjugation ratio. Transduction data revealed that the vector is fully infectious until a critical PEG conjugation reaction ratio was exceeded, and this critical level was found to vary with polymer chain size. At this key conjugation ratio, however, particles were moderately protected from serum neutralization, 2.3-fold over unmodified vector, demonstrating that there is a small window of PEGylation for which particles are still fully infective and benefit from antibody protection. TEM results and structural analysis indicate that the drop of infectivity as the PEG concentration is increased beyond the critical conjugation ratio may be due to a combination of steric interference with viral regions necessary for infection as well as reaction at important lysine residues. However, this first study analyzing the potential of PEG to protect AAV from serum neutralization shows that the approach has promise, which can be further enhanced if the locations of PEG attachment can be more finely controlled.

PEG conjugation moderately protects adeno-associated viral vectors against antibody neutralization.

Vecteurs de th&eacute;rapie g&eacute;nique AAV ont promesse clinique significatif, mais s&eacute;roneutralisation pose un d&eacute;fi qui doit &ecirc;tre surmont&eacute;. Nous avons examin&eacute; la possibilit&eacute; de conjuguer la surface AAV avec cha&icirc;nes de poly&eacute;thyl&egrave;neglycol activ&eacute;s pour prot&eacute;ger le vecteur des anticorps neutralisants. Deux principaux param&egrave;tres ont &eacute;t&eacute; &eacute;tudi&eacute;s : la taille de cha&icirc;ne polym&egrave;re et le ratio de conjugaison de PEG : lysine. Les donn&eacute;es de transduction ont r&eacute;v&eacute;l&eacute; que le vecteur est totalement contagieux jusqu&#39;&agrave; ce qu&#39;un ratio de r&eacute;action de conjugaison PEG critique a &eacute;t&eacute; d&eacute;pass&eacute;, et ce niveau critique s&#39;est av&eacute;r&eacute; pour varier avec la taille de cha&icirc;ne de polym&egrave;re. &Agrave; ce taux de conjugaison cl&eacute;s, cependant, particules &eacute;taient mod&eacute;r&eacute;ment prot&eacute;g&eacute;s de s&eacute;roneutralisation, 2.3-fold over non modifi&eacute; le vecteur, ce qui d&eacute;montre qu&#39;il y a une petite fen&ecirc;tre de PEGylation pour lequel les particules restent pleinement infectieux et b&eacute;n&eacute;ficient de la protection de l&#39;anticorps. TEM r&eacute;sultats et l&#39;analyse structurale indiquent que la baisse du pouvoir infectieux lorsque la concentration de PEG augmente au-del&agrave; du ratio de conjugaison critique peut &ecirc;tre due &agrave; une combinaison d&#39;interf&eacute;rence st&eacute;rique avec r&eacute;gions virales n&eacute;cessaires pour infection comme r&eacute;action aux r&eacute;sidus lysine important. Toutefois, cette premi&egrave;re &eacute;tude analysant le potentiel de la cheville pour prot&eacute;ger les AAV de s&eacute;roneutralisation montre que l&#39;approche a promise, qui peut encore &ecirc;tre am&eacute;lior&eacute;e si les emplacements de fixation de la cheville peuvent &ecirc;tre plus finement contr&ocirc;l&eacute;es.

Conjugaison de PEG prot&egrave;ge moyennement vecteurs viraux ad&eacute;no-associ&eacute;s contre la neutralisation des anticorps.

Vettori di terapia genica AAV hanno promessa clinico significativo, ma sieroneutralizzazione pone una sfida che deve essere superata. Abbiamo esaminato il potenziale di coniugazione la superficie AAV con catene di polietilenglicole attivato per proteggere il vettore da neutralizzando gli anticorpi. Sono stati studiati due parametri fondamentali: la dimensione della catena polimerica e il rapporto di coniugazione PEG: lisina. Trasduzione dati hanno rivelato che il vettore &egrave; completamente infettivo fino a un rapporto di reazione di coniugazione PEG critico &egrave; stato superato, e questo livello critico &egrave; stato trovato a variare con dimensione catena del polimero. Questo rapporto di coniugazione chiave, tuttavia, particelle moderatamente erano protetti da sieroneutralizzazione, 2.3-fold over unmodified vettoriale, dimostrando che non c&#39;&egrave; una piccola finestra di PEGylation per cui particelle sono ancora pienamente infettiva e beneficiano di protezione anticorpale. Analisi strutturale e TEM risultati indicano che la goccia di infettivit&agrave; come la concentrazione di PEG &egrave; aumentata di l&agrave; del rapporto critico coniugazione pu&ograve; essere dovuto a una combinazione di interferenza sterica con regioni virale necessarie per infezione cos&igrave; come reazione a residui di lisina importante. Tuttavia, questo primo studio analizzando il potenziale di PEG per proteggere AAV da sieroneutralizzazione dimostra che l&#39;approccio ha promessa, che pu&ograve; essere ulteriormente migliorata se le posizioni di attacco PEG possono essere controllate pi&ugrave; finemente.

PEG coniugazione moderatamente protegge vettori virali adeno-associati contro la neutralizzazione dell&#39;anticorpo.

Adeno-associated viral vectors are highly safe and efficient gene delivery vehicles. However, numerous challenges in vector design remain, including neutralizing antibody responses, tissue transport and infection of resistant cell types. Changes must be made to the viral capsid to overcome these problems; however, very often insufficient information is available for rational design of improvements. We therefore applied a directed evolution approach involving the generation of large mutant capsid libraries and selection of adeno-associated virus (AAV) 2 variants with enhanced properties. High-throughput selection processes were designed to isolate mutants within the library with altered affinities for heparin or the ability to evade antibody neutralization and deliver genes more efficiently than wild-type capsid in the presence of anti-AAV serum. This approach, which can be extended to additional gene delivery challenges and serotypes, directs viral evolution to generate 'designer' gene delivery vectors with specified, enhanced properties.

Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors.

Vecteurs viraux ad&eacute;no-associ&eacute;s sont vecteurs de g&egrave;nes tr&egrave;s s&ucirc;re et efficace. Cependant, relever de nombreux d&eacute;fis dans vector design demeure, y compris les r&eacute;ponses d&#39;anticorps neutralisants, transport des tissus et l&#39;infection des types de cellules r&eacute;sistantes. La capside virale doivent &ecirc;tre modifi&eacute;s pour surmonter ces probl&egrave;mes ; Cependant, tr&egrave;s souvent pas suffisamment d&#39;information est disponible pour une conception rationnelle des am&eacute;liorations. Nous avons donc appliqu&eacute; une approche d&#39;&eacute;volution dirig&eacute;e impliquant la g&eacute;n&eacute;ration de biblioth&egrave;ques de grandes capside mutant et s&eacute;lection des adeno-associated virus (AAV) 2 variantes avec des propri&eacute;t&eacute;s am&eacute;lior&eacute;es. Processus de s&eacute;lection du haut d&eacute;bit ont &eacute;t&eacute; con&ccedil;us pour isoler des mutants au sein de la biblioth&egrave;que avec des affinit&eacute;s alt&eacute;r&eacute;es pour l&#39;h&eacute;parine ou la capacit&eacute; &agrave; &eacute;chapper &agrave; la neutralisation des anticorps et de livrer plus efficacement que la capside sauvage en pr&eacute;sence de s&eacute;rum anti-AAV les g&egrave;nes. Cette approche, qui peut &ecirc;tre &eacute;tendue aux d&eacute;fis de livraison suppl&eacute;mentaires de g&egrave;ne et s&eacute;rotypes, dirige l&#39;&eacute;volution virale pour g&eacute;n&eacute;rer des vecteurs de livraison &laquo; designer &raquo; g&egrave;ne avec les propri&eacute;t&eacute;s sp&eacute;cifi&eacute;es, renforc&eacute;es.

R&eacute;alis&eacute; l&#39;&eacute;volution du virus adeno-associ&eacute; rendements g&egrave;ne renforc&eacute;e livraison vecteurs.

Vettori virali adeno-associati sono veicoli di consegna del gene altamente sicuro ed efficiente. Tuttavia, rimangono numerose sfide di disegno vettoriale, risposte anticorpali neutralizzanti, trasporto del tessuto e infezione dei tipi delle cellule resistenti. Devono essere apportate modifiche per le proteine del capside virale per superare questi problemi; Tuttavia, molto spesso insufficiente informazione &egrave; disponibile per la progettazione razionale di miglioramenti. Abbiamo pertanto applicato un approccio diretto evoluzione che coinvolge la generazione di librerie di grande capside mutante e selezione di virus adeno-associati (AAV) 2 varianti con propriet&agrave; migliorate. Processi di selezione di alto-rendimento sono stati progettati per isolare mutanti all&#39;interno della biblioteca con alterata affinit&agrave; per l&#39;eparina o la possibilit&agrave; di eludere la neutralizzazione dell&#39;anticorpo e consegnare i geni in modo pi&ugrave; efficiente rispetto a capside del selvaggio-tipo in presenza di siero anti-AAV. Questo approccio, che pu&ograve; essere estesa a ulteriori gene consegna sfide e sierotipi, indirizza l&#39;evoluzione virale per generare dei vettori-consegna &#39;designer&#39; gene con propriet&agrave; specificata, rafforzata.

Diretta evoluzione del virus adeno-associati rendimenti gene maggiore consegna vettori.

Noise in gene expression is generated at multiple levels, such as transcription and translation, chromatin remodeling and pathway-specific regulation. Studies of individual promoters have suggested different dominating noise sources, raising the question of whether a general trend exists across a large number of genes and conditions. We examined the variation in the expression levels of 43 Saccharomyces cerevisiae proteins, in cells grown under 11 experimental conditions. For all classes of genes and under all conditions, the expression variance was approximately proportional to the mean; the same scaling was observed at steady state and during the transient responses to the perturbations. Theoretical analysis suggests that this scaling behavior reflects variability in mRNA copy number, resulting from random 'birth and death' of mRNA molecules or from promoter fluctuations. Deviation of coexpressed genes from this general trend, including high noise in stress-related genes and low noise in proteasomal genes, may indicate fluctuations in pathway-specific regulators or a differential activation pattern of the underlying gene promoters.

Noise in protein expression scales with natural protein abundance.

Bruit dans l&#39;expression des g&egrave;nes est g&eacute;n&eacute;r&eacute; &agrave; plusieurs niveaux, tels que la transcription et de traduction, de remodelage de la chromatine et de r&eacute;glementation propre voie. &Eacute;tudes de divers promoteurs ont sugg&eacute;r&eacute; diff&eacute;rentes sources de bruit dominant, soulevant la question de l&#39;existence d&#39;une tendance g&eacute;n&eacute;rale &agrave; travers un grand nombre de g&egrave;nes et de conditions. Nous avons &eacute;tudi&eacute; la variation dans les niveaux d&#39;expression des 43 prot&eacute;ines Saccharomyces cerevisiae en cellules cultiv&eacute;es sous 11 conditions exp&eacute;rimentales. Pour toutes les classes de g&egrave;nes et dans toutes les conditions, l&#39;&eacute;cart de l&#39;expression est approximativement proportionnel &agrave; la moyenne ; la mise &agrave; l&#39;&eacute;chelle m&ecirc;me a &eacute;t&eacute; observ&eacute;e &agrave; l&#39;&eacute;tat stable et durant les r&eacute;ponses transitoires aux perturbations. Analyse th&eacute;orique sugg&egrave;re que ce comportement de mise &agrave; l&#39;&eacute;chelle refl&egrave;te la variabilit&eacute; dans le nombre de copies d&#39;ADN messag&egrave;re, r&eacute;sultant de l&#39;al&eacute;atoire &laquo; naissance et la mort &raquo; des mol&eacute;cules d&#39;ARNm ou de fluctuations de promoteur. D&eacute;viation de coexpressed g&egrave;nes de cette tendance g&eacute;n&eacute;rale, y compris le bruit &eacute;lev&eacute; dans les g&egrave;nes li&eacute;s au stress et &agrave; faible bruit dans les g&egrave;nes du prot&eacute;asome, peut indiquer des fluctuations dans les r&eacute;gulateurs de voie sp&eacute;cifique ou un mod&egrave;le d&#39;activation diff&eacute;rentielle des promoteurs g&egrave;ne sous-jacent.

Bruit dans l&#39;expression des prot&eacute;ines augmentent avec l&#39;abondance de la prot&eacute;ine naturelle.

Rumore nell&#39;espressione del gene &egrave; generato a pi&ugrave; livelli, come la trascrizione e traduzione, rimodellamento della cromatina e percorso specifico regolamento. Studi di singoli promotori hanno suggerito diverse sorgenti di rumore dominante, sollevare la questione dell&#39;esistenza di una tendenza generale attraverso un gran numero di geni e condizioni. Abbiamo esaminato la variazione dei livelli di espressione di 43 Saccharomyces cerevisiae proteine in cellule coltivate sotto 11 condizioni sperimentali. Per tutte le classi di geni e in tutte le condizioni, la varianza di espressione era approssimativamente proporzionale alla media; la stessa scala &egrave; stato osservato allo stato stazionario e durante i transitori responses to le perturbazioni. Analisi teorica suggeriscono che questo comportamento di ridimensionamento riflette la variabilit&agrave; nel numero di copie di mRNA, derivanti da casuali &#39;nascita e morte&#39; di molecole di mRNA o dalle fluttuazioni del promotore. Deviazione dei geni Rsc8p da questa tendenza generale, compreso il rumore alto in geni legati allo stress e basso rumore nel proteosomale geni, pu&ograve; indicare le fluttuazioni nel percorso specifico regolatori o un pattern di attivazione differenziale dei promotori gene sottostante.

Rumore nell&#39;espressione della proteina scale con abbondanza di proteine naturali.

Rational design of improved gene delivery vehicles is a challenging and potentially time-consuming process. As an alternative approach, directed evolution can provide a rapid and efficient means for identifying novel proteins with improved function. Here we describe a methodology for generating very large, random adeno-associated viral (AAV) libraries that can be selected for a desired function. First, the AAV2 cap gene is amplified in an error-prone PCR reaction and further diversified through a staggered extension process. The resulting PCR product is then cloned into pSub2 to generate a diverse (>10(6)) AAV2 plasmid library. Finally, the AAV2 plasmid library is used to package a diverse pool of mutant AAV2 virions, such that particles are composed of a mutant AAV genome surrounded by the capsid proteins encoded in that genome, which can be used for functional screening and evolution. This procedure can be performed in approximately 2 weeks.

Construction of diverse adeno-associated viral libraries for directed evolution of enhanced gene delivery vehicles.

Conception rationnelle des vecteurs d&#39;am&eacute;lioration g&eacute;n&eacute;tique est un processus difficile et potentiellement chronophage. Comme approche alternative, &eacute;volution dirig&eacute;e peut fournir un moyen rapide et efficace pour identifier de nouvelles prot&eacute;ines avec la fonction am&eacute;lior&eacute;e. Nous d&eacute;crivons ici une m&eacute;thode pour g&eacute;n&eacute;rer des tr&egrave;s grandes et al&eacute;atoires ad&eacute;no-associ&eacute;s virales (AAV) biblioth&egrave;ques qui peuvent &ecirc;tre s&eacute;lectionn&eacute;s pour un fonctionnement d&eacute;sir&eacute;. Tout d&#39;abord, le g&egrave;ne de cap AAV2 est amplifi&eacute; dans une r&eacute;action de PCR erreurs et plus diversifi&eacute; gr&acirc;ce &agrave; un processus d&#39;extension d&eacute;cal&eacute;s. Le produit PCR qui en r&eacute;sulte est ensuite clon&eacute; dans pSub2 pour g&eacute;n&eacute;rer une diverse (&gt; 10(6)) AAV2 biblioth&egrave;que de plasmide. Enfin, la biblioth&egrave;que de plasmide AAV2 est utilis&eacute;e pour emballer un bassin diversifi&eacute; des mutants AAV2 virions, tels que les particules sont compos&eacute;es d&#39;un g&eacute;nome AAV mutant, entour&eacute; par les prot&eacute;ines de la capside encod&eacute;s dans ce g&eacute;nome, qui peut &ecirc;tre utilis&eacute; pour le d&eacute;pistage fonctionnelle et l&#39;&eacute;volution. Cette intervention peut &ecirc;tre r&eacute;alis&eacute;e en environ 2 semaines.

Construction des biblioth&egrave;ques virales ad&eacute;no-associ&eacute;s divers, pour l&#39;&eacute;volution dirig&eacute;e des vecteurs d&#39;am&eacute;lioration g&eacute;n&eacute;tique.

Design razionale dei veicoli di consegna migliorata gene &egrave; un processo impegnativo e potenzialmente dispendiose. Come un approccio alternativo, evoluzione diretta pu&ograve; fornire un mezzo rapido ed efficiente per l&#39;identificazione di proteine romanzo con miglioramento della funzione. Qui descriviamo una metodologia per la generazione casuale, molto grande adeno-associati virale (AAV) librerie che possono essere selezionate per una funzione desiderata. In primo luogo, gene AAV2 cap &egrave; amplificato nella reazione di PCR error-prona e ulteriormente diversificato attraverso un processo di estensione sfalsati. Il prodotto PCR risultante &egrave; poi clonato in pSub2 per generare un vario (&amp;gt; libreria del plasmide 10(6)) AAV2. Infine, la biblioteca di plasmide AAV2 &egrave; utilizzata per confezionare una piscina diversificata dei virions AAV2 mutante, tale che le particelle sono composte di un genoma mutante di AAV circondato dalle proteine del capside codificate in quel genoma, che pu&ograve; essere utilizzato per lo screening funzionale ed evoluzione. Questa procedura pu&ograve; essere eseguita in circa 2 settimane.

Costruzione di diverse librerie di virale adeno-associati per la diretta evoluzione dei veicoli di consegna del gene maggiore.

Within a population of genetically identical cells there can be significant variation, or noise, in gene expression. Yet even with this inherent variability, cells function reliably. This review focuses on our understanding of noise at the level of both single genes and genetic regulatory networks, emphasizing comparisons between theoretical models and experimental results whenever possible. To highlight the importance of noise, we particularly emphasize examples in which a stochastic description of gene expression leads to a qualitatively different outcome than a deterministic one.

Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression.

Au sein d&#39;une population de cellules g&eacute;n&eacute;tiquement identiques, il peut &ecirc;tre une variation significative, ou un bruit, dans l&#39;expression des g&egrave;nes. Mais m&ecirc;me avec cette variabilit&eacute; inh&eacute;rente, cellules fonction fiable. Cet examen se concentre sur notre compr&eacute;hension du bruit au niveau de g&egrave;nes simples et des r&eacute;seaux de r&eacute;gulation g&eacute;n&eacute;tiques, mettant l&#39;accent sur les comparaisons entre les mod&egrave;les th&eacute;oriques et r&eacute;sultats exp&eacute;rimentaux lorsque cela est possible. Pour souligner l&#39;importance du bruit, nous soulignons en particulier exemples dans lesquels une description stochastique de l&#39;expression g&eacute;nique conduit &agrave; un r&eacute;sultat qualitativement diff&eacute;rent qu&#39;un d&eacute;terministe.

Vivant avec des g&egrave;nes bruyants : comment les cellules fonctionnent de mani&egrave;re fiable avec une variabilit&eacute; inh&eacute;rente &agrave; l&#39;expression des g&egrave;nes.

All&#39;interno di una popolazione di cellule geneticamente identiche ci pu&ograve; essere variazione significativa, o rumore, nell&#39;espressione del gene. Eppure anche con questa variabilit&agrave; intrinseca, cellule funzione in modo affidabile. Questa recensione si concentra sulla nostra comprensione del rumore a livello di singoli geni e di reti di regolazione genetiche, sottolineando i confronti tra modelli teorici e risultati sperimentali quando possibile. Per evidenziare l&#39;importanza del rumore, sottolineiamo soprattutto esempi in cui una descrizione stocastica dell&#39;espressione del gene conduce ad un risultato qualitativamente diverso rispetto a quello deterministico.

Vivere con geni rumorosi: come cellule funzionano in modo affidabile con intrinseca variabilit&agrave; nell&#39;espressione del gene.

Cells often respond to external signals by altering their gene expression. The external signaling information is transduced and typically encoded in concentrations of relevant transcription factors. A recent study demonstrates that, by encoding this information in the frequency with which genes 'see' a transcription factor, the expression of hundreds of genes can be modulated in a linearly proportional manner.

Gene expression: dialing up the frequency.

Les cellules r&eacute;pondent souvent &agrave; des signaux externes en modifiant leur expression de g&egrave;ne. Les informations de signalisation externes sont transduites et g&eacute;n&eacute;ralement cod&eacute;es en concentration de facteurs de transcription pertinentes. Une &eacute;tude r&eacute;cente montre que, en codant ces informations dans la fr&eacute;quence avec laquelle g&egrave;nes &laquo; voir &raquo; un facteur de transcription, l&#39;expression de centaines de g&egrave;nes peut &ecirc;tre modul&eacute;e de fa&ccedil;on proportionnelle lin&eacute;airement.

L&#39;expression des g&egrave;nes : composer vers le haut de la fr&eacute;quence.

Le cellule spesso rispondono a segnali esterni modificando la loro espressione genica. Le informazioni di segnalazione esterne sono transduced e in genere codificate in concentrazioni di fattori di trascrizione pertinenti. Un recente studio dimostra che, codificando questa informazione la frequenza con cui geni &#39;vedere&#39; un fattore di trascrizione, l&#39;espressione di centinaia di geni pu&ograve; essere modulato in maniera linearmente proporzionale.

Espressione genica: la frequenza di composizione.

Epigenetic switches encode their state information either locally, often via covalent modification of DNA or histones, or globally, usually in the level of a trans-regulatory factor. Here we examine how the regulation of cis-encoded epigenetic switches controls the extent of heterogeneity in gene expression, which is ultimately tied to phenotypic diversity in a population. We show that two copies of the FLO11 locus in Saccharomyces cerevisiae switch between a silenced and competent promoter state in a random and independent fashion, implying that the molecular event leading to the transition occurs locally at the promoter, in cis. We further quantify the effect of trans regulators both on the slow epigenetic transitions between a silenced and competent promoter state and on the fast promoter transitions associated with conventional regulation of FLO11. We find different classes of regulators affect epigenetic, conventional, or both forms of regulation. Distributing kinetic control of epigenetic silencing and conventional gene activation offers cells flexibility in shaping the distribution of gene expression and phenotype within a population.

Epigenetic and conventional regulation is distributed among activators of FLO11 allowing tuning of population-level heterogeneity in its expression.

Commutateurs &eacute;pig&eacute;n&eacute;tiques codent leurs informations d&#39;&Eacute;tat soit localement, souvent par modification covalente de l&#39;ADN ou les histones, ou dans le monde, g&eacute;n&eacute;ralement dans le niveau d&#39;un facteur de trans-r&eacute;glementation. Nous examinons ici comment la r&eacute;glementation des commutateurs &eacute;pig&eacute;n&eacute;tiques cod&eacute; cis contr&ocirc;le le degr&eacute; d&#39;h&eacute;t&eacute;rog&eacute;n&eacute;it&eacute; dans l&#39;expression des g&egrave;nes, qui est finalement li&eacute;e &agrave; la diversit&eacute; ph&eacute;notypique dans une population. Nous montrons que deux exemplaires du locus FLO11 chez Saccharomyces cerevisiae basculer entre un &eacute;tat de silence et comp&eacute;tente promoteur de fa&ccedil;on al&eacute;atoire et ind&eacute;pendante, ce qui implique que l&#39;&eacute;v&eacute;nement mol&eacute;culaire conduisant &agrave; la transition s&#39;effectue localement au promoteur, en cis. Nous avons plus de quantifier l&#39;effet des r&eacute;gulateurs trans sur les transitions &eacute;pig&eacute;n&eacute;tiques lentes entre un &eacute;tat de silence et comp&eacute;tente promoteur et sur les transitions promoteur rapide associ&eacute;es &agrave; un r&egrave;glement conventionnel de FLO11. Nous trouvons diff&eacute;rentes classes d&#39;affect de r&eacute;gulateurs &eacute;pig&eacute;n&eacute;tique, classique, ou les deux formes de r&eacute;gulation. Contr&ocirc;le cin&eacute;tique de silen&ccedil;age &eacute;pig&eacute;n&eacute;tique et activation de g&egrave;nes classiques de distribution offre une flexibilit&eacute; de cellules dans le fa&ccedil;onnement de la distribution de l&#39;expression g&eacute;n&eacute;tique et le ph&eacute;notype au sein d&#39;une population.

R&eacute;gulation &eacute;pig&eacute;n&eacute;tique et conventionnelle est r&eacute;partie entre les activateurs de FLO11 permettant le r&eacute;glage de l&#39;h&eacute;t&eacute;rog&eacute;n&eacute;it&eacute; du niveau de la population dans son expression.

Interruttori epigenetici codificano le informazioni sullo stato sia localmente, spesso tramite modifica covalente del DNA o istoni, o globalmente, solitamente nel livello di un fattore di trans-normativo. Qui esaminiamo come la regolazione degli interruttori epigenetici cis-codificato controlla la misura dell&#39;eterogeneit&agrave; nell&#39;espressione del gene, che in definitiva &egrave; legato alla diversit&agrave; fenotipica di una popolazione. Mostriamo che due copie del locus FLO11 in Saccharomyces cerevisiae passare da uno stato promotore silenziato e competente in maniera casuale e indipendente, che implica che l&#39;evento molecolare che conduce la transizione si verifica localmente presso il promotore, nel cis. Abbiamo ulteriormente quantificare l&#39;effetto di trans regolatori sia il lente epigenetiche transizioni tra uno stato promotore silenziato e competente e le transizioni veloci promotore associati regolamento convenzionale di FLO11. Troviamo diverse classi di incidere regolatori epigenetici, convenzionale, o entrambe le forme di regolamento. Distribuzione controllo cinetico del silenziamento epigenetico e attivazione genica convenzionale offre la flessibilit&agrave; di cellule nel modellare la distribuzione di espressione del gene e fenotipo all&#39;interno di una popolazione.

Regolazione epigenetica e convenzionale &egrave; distribuito tra gli attivatori di FLO11 che permette la regolazione del livello di popolazione eterogeneit&agrave; nella sua espressione.

Transcriptional positive-feedback loops are widely associated with bistability, characterized by two stable expression states that allow cells to respond to analog signals in a digital manner. Using a synthetic system in budding yeast, we show that positive feedback involving a promoter with multiple transcription factor (TF) binding sites can induce a steady-state bimodal response without cooperative binding of the TF. Deterministic models of this system do not predict bistability. Rather, the bimodal response requires a short-lived TF and stochastic fluctuations in the TF's expression. Multiple binding sites provide these fluctuations. Because many promoters possess multiple binding sites and many TFs are unstable, positive-feedback loops in gene regulatory networks may exhibit bimodal responses, but not necessarily because of deterministic bistability, as is commonly thought.

Noise can induce bimodality in positive transcriptional feedback loops without bistability.

Transcriptionnelles boucles de r&eacute;troaction positive sont largement associ&eacute;s &agrave; bistabilit&eacute;, caract&eacute;ris&eacute;e par deux &Eacute;tats stables d&#39;expression qui permettent aux cellules de r&eacute;pondre aux signaux analogiques de fa&ccedil;on num&eacute;rique. En utilisant un syst&egrave;me synth&eacute;tique dans la levure de bi&egrave;re, nous montrons que la r&eacute;troaction positive impliquant un promoteur avec plusieurs facteur de transcription (TF) sites de liaison peut induire une r&eacute;ponse bimodale stationnaire sans liaison coop&eacute;rative de la TF. Les mod&egrave;les d&eacute;terministes de ce syst&egrave;me ne pr&eacute;disent pas bistabilit&eacute;. Au contraire, la r&eacute;ponse bimodale n&eacute;cessite un TF de courte dur&eacute;e et des variations stochastiques dans l&#39;expression de la TF. Plusieurs sites de fixation fournissent ces fluctuations. Parce que de nombreux promoteurs poss&egrave;dent plusieurs sites de fixation et nombreux TFs sont instables, des boucles de r&eacute;troaction positive dans les r&eacute;seaux de r&eacute;gulation g&eacute;nique peuvent pr&eacute;senter des r&eacute;ponses bimodales, mais pas n&eacute;cessairement en raison de la bistabilit&eacute; d&eacute;terministe, comme est g&eacute;n&eacute;ralement pens&eacute;.

Bruit peut induire la bimodalit&eacute; dans des boucles de r&eacute;troaction transcriptionnelle positive sans bistabilit&eacute;.

Transcriptional positivo-feedback loop sono ampiamente associati bistability, caratterizzata da due stati espressione stabile che permettono alle cellule di rispondere ai segnali analogici in modo digitale. Utilizzando un sistema sintetico nel lievito gemmante, mostriamo che feedback positivi che coinvolgono un promotore con pi&ugrave; fattore di trascrizione (TF) siti di legame pu&ograve; indurre una risposta bimodale stazionario senza legame cooperativo del TF. Modelli deterministici di questo sistema non prevedere bistability. Piuttosto, la risposta bimodale richiede una breve durata TF e fluttuazioni stocastiche nell&#39;espressione di TF. Siti di legame pi&ugrave; forniscono queste fluttuazioni. Perch&eacute; molti promotori possiedono pi&ugrave; siti di legame e molti TFs sono instabili, positivo-feedback loop in reti di regolazione genica possono esibire risposte bimodale, ma non necessariamente a causa di bistability deterministico, come comunemente si pensa.

Rumore pu&ograve; indurre bimodality nei cicli di feedback positivo transcriptional senza bistability.

An emerging concept in cell signalling is the natural role of reactive oxygen species such as hydrogen peroxide (H2O2) as beneficial messengers in redox signalling pathways. The nature of H2O2 signalling is confounded, however, by difficulties in tracking it in living systems, both spatially and temporally, at low concentrations. Here, we develop an array of fluorescent single-walled carbon nanotubes that can selectively record, in real time, the discrete, stochastic quenching events that occur as H2O2 molecules are emitted from individual human epidermal carcinoma cells stimulated by epidermal growth factor. We show mathematically that such arrays can distinguish between molecules originating locally on the cell membrane from other contributions. We find that epidermal growth factor induces 2 nmol H2O2 locally over a period of 50 min. This platform promises a new approach to understanding the signalling of reactive oxygen species at the cellular level.

Detection of single-molecule H2O2 signalling from epidermal growth factor receptor using fluorescent single-walled carbon nanotubes.

Un nouveau concept dans la signalisation cellulaire est le r&ocirc;le naturel des esp&egrave;ces r&eacute;actives de l&#39;oxyg&egrave;ne comme le peroxyde d&#39;hydrog&egrave;ne (H2O2) comme messagers b&eacute;n&eacute;fiques redox, voies de signalisation. La nature de la signalisation de H2O2 est confondue, cependant, par des difficult&eacute;s &agrave; suivre dans les syst&egrave;mes vivants, spatialement et temporellement, &agrave; de faibles concentrations. Ici, nous d&eacute;veloppons une gamme de nanotubes de carbone unique fluorescent qui permet d&#39;enregistrer s&eacute;lectivement, en temps r&eacute;el, les &eacute;v&eacute;nements discrets, stochastiques extinction qui se produisent comme H2O2 mol&eacute;cules sont &eacute;mis &agrave; partir de cellules de carcinome &eacute;pidermique humain individuel stimul&eacute;es par facteur de croissance &eacute;pidermique. Math&eacute;matiquement, nous montrons que ces tableaux peut distinguer entre mol&eacute;cules originaire localement sur la membrane cellulaire des autres contributions. Nous trouvons que ce facteur de croissance &eacute;pidermique induit 2 nmol H2O2 localement sur une p&eacute;riode de 50 min. Cette plateforme promet une nouvelle approche pour comprendre la signalisation des esp&egrave;ces r&eacute;actives de l&#39;oxyg&egrave;ne au niveau cellulaire.

D&eacute;tection de H2O2 seule mol&eacute;cule de signalisation du r&eacute;cepteur de facteur de croissance &eacute;pidermique en utilisant les nanotubes simple-mur&eacute;s de carbone fluorescent.

Un concetto emergente nella segnalazione delle cellule &egrave; il ruolo naturale di specie reattive dell&#39;ossigeno come il perossido di idrogeno (H2O2) come messaggeri benefici in percorsi di segnalazione redox. La natura della segnalazione di H2O2 &egrave; confuso, tuttavia, dalla difficolt&agrave; di rilevamento nei sistemi viventi, sia spazialmente e temporalmente, a basse concentrazioni. Qui, possiamo sviluppare una matrice di nanotubi di carbonio monoparete fluorescente che possono registrare in modo selettivo, in tempo reale, gli eventi discreti, stocastici tempra che si verificano come molecole di H2O2 sono emessi dalle cellule di carcinoma epidermico umano individuale stimolate dal fattore di crescita epidermico. Mostriamo matematicamente che tali matrici possono distinguere tra molecole originarie localmente sulla membrana delle cellule da altri contributi. Troviamo che quel fattore di crescita epidermico induce nmol 2 H2O2 localmente in un periodo di 50 min. Questa piattaforma promette un nuovo approccio per comprendere la segnalazione di specie reattive dell&#39;ossigeno a livello cellulare.

Rilevamento della singola molecola H2O2 segnalazione da epidermal growth factor receptor usando nanotubi di carbonio a parete singola fluorescente.

Tandem repeats of DNA that contain transcription factor (TF) binding sites could serve as decoys, competitively binding to TFs and affecting target gene expression. Using a synthetic system in budding yeast, we demonstrate that repeated decoy sites inhibit gene expression by sequestering a transcriptional activator and converting the graded dose-response of target promoters to a sharper, sigmoidal-like response. On the basis of both modeling and chromatin immunoprecipitation measurements, we attribute the altered response to TF binding decoy sites more tightly than promoter binding sites. Tight TF binding to arrays of contiguous repeated decoy sites only occurs when the arrays are mostly unoccupied. Finally, we show that the altered sigmoidal-like response can convert the graded response of a transcriptional positive-feedback loop to a bimodal response. Together, these results show how changing numbers of repeated TF binding sites lead to qualitative changes in behavior and raise new questions about the stability of TF/promoter binding.

A regulatory role for repeated decoy transcription factor binding sites in target gene expression.

Les r&eacute;p&eacute;titions en tandem de l&#39;ADN qui contient le facteur de transcription (TF) sites de liaison pourrait servir de leurres, contraignant &agrave; TSF de la concurrence et affectant l&#39;expression du g&egrave;ne cible. En utilisant un syst&egrave;me synth&eacute;tique dans la levure de bi&egrave;re, nous d&eacute;montrons que leurre r&eacute;p&eacute;t&eacute;es sites inhibent l&#39;expression des g&egrave;nes en s&eacute;questrant un activateur de la transcription et en convertissant la dose-r&eacute;ponse gradu&eacute;e des promoteurs de la cible pour une r&eacute;ponse plus nette, de type sigmo&iuml;de. Sur la base de la mod&eacute;lisation et de mesures de l&#39;immunopr&eacute;cipitation de la chromatine, nous attribuons la r&eacute;ponse alt&eacute;r&eacute;e aux sites de leurre TF fixation plus &eacute;troitement que les sites de fixation de promoteur. Liaison &eacute;troite de TF aux tableaux de sites contigus leurre r&eacute;p&eacute;t&eacute;es se produit uniquement lorsque les baies sont pour la plupart inoccup&eacute;es. Enfin, nous montrons que la r&eacute;ponse de type sigmo&iuml;de alt&eacute;r&eacute;e peut convertir la r&eacute;ponse gradu&eacute;e d&#39;une boucle de r&eacute;troaction positive transcriptionnelle une r&eacute;ponse bimodale. Ensemble, ces r&eacute;sultats montrent comment changer de num&eacute;ro de r&eacute;p&eacute;t&eacute; TF binding sites plomb &agrave; des changements qualitatifs dans le comportement et soul&egrave;vent de nouvelles questions quant &agrave; la stabilit&eacute; de la liaison de TF/promoteur.

Un r&ocirc;le r&eacute;gulateur pour les sites de fixation de facteurs de transcription de leurre r&eacute;p&eacute;t&eacute;es dans l&#39;expression des g&egrave;nes cibles.

Ripetizioni in tandem di DNA che contengono fattore di trascrizione (TF) siti di legame potrebbe servire come decoys, competitivamente associazione a TFs e interessare l&#39;espressione genica. Utilizzando un sistema sintetico nel lievito gemmante, dimostreremo che siti di richiamo ripetuto inibiscono espressione genica di sequestrare un attivatore trascrizionale e convertendo la dose-risposta graduata dei promotori di destinazione per una risposta pi&ugrave; nitida, sigmoidal, come. Sulla base di modellazione sia le misure di immunoprecipitazione della cromatina, attribuiamo la risposta alterata di siti leganti l&#39;esca TF pi&ugrave; stretto rispetto a siti di legame del promotore. Stretto legame TF alle matrici di siti contigui ripetuti richiami si verifica solo quando le matrici sono per lo pi&ugrave; non occupate. Infine, ci mostra che l&#39;alterata risposta sigmoidal-come &egrave; in grado di convertire la risposta graduata di un ciclo di feedback positivo transcriptional in una risposta bimodale. Insieme, questi risultati mostrano come cambiare numeri di ripetute TF associazione siti portare a cambiamenti qualitativi nel comportamento e sollevano nuove domande circa la stabilit&agrave; del legame TF/promotore.

Un ruolo normativo per siti di legame del fattore trascrizione richiamo ripetuto nell&#39;espressione genica.

A major hurdle to evolutionary engineering approaches for multigenic phenotypes is the ability to simultaneously modify multiple genes rapidly and selectively. Here, we describe a method for in vivo-targeted mutagenesis in yeast, targeting glycosylases to embedded arrays for mutagenesis (TaGTEAM). By fusing the yeast 3-methyladenine DNA glycosylase MAG1 to a tetR DNA-binding domain, we are able to elevate mutation rates >800 fold in a specific âˆ¼20-kb region of the genome or on a plasmid that contains an array of tetO sites. A wide spectrum of transitions, transversions and single base deletions are observed. We provide evidence that TaGTEAM generated point mutations occur through error-prone homologous recombination (HR) and depend on resectioning and the error-prone polymerase Pol Î¶. We show that HR is error-prone in this context because of DNA damage checkpoint activation and base pair lesions and use this knowledge to shift the primary mutagenic outcome of targeted endonuclease breaks from HR-independent rearrangements to HR-dependent point mutations. The ability to switch repair in this way opens up the possibility of using targeted endonucleases in diverse organisms for in vivo-targeted mutagenesis.

Harnessing mutagenic homologous recombination for targeted mutagenesis in vivo by TaGTEAM.

Un obstacle majeur aux approches de g&eacute;nie &eacute;volutifs pour les ph&eacute;notypes multig&eacute;niques est la capacit&eacute; de modifier simultan&eacute;ment plusieurs g&egrave;nes rapidement et de mani&egrave;re s&eacute;lective. Nous d&eacute;crivons ici une m&eacute;thode pour dans la mutagen&egrave;se cibl&eacute;e vivo chez les levures, ciblage des glycosylases aux tableaux incorpor&eacute;s pour la mutag&eacute;n&egrave;se (TaGTEAM). En fusionnant la levure 3-m&eacute;thylad&eacute;nine DNA glycosylase MAG1 &agrave; un domaine de liaison &agrave; l&#39;ADN de Tite, nous sommes en mesure d&#39;&eacute;lever le taux de mutation &gt; 800 pli dans une r&eacute;gion sp&eacute;cifique &sim;20 kb du g&eacute;nome ou sur un plasmide qui contient un tableau des sites de tetO. On observe un spectre large de transitions, transversions et destructions de base unique. Nous d&eacute;montrons que TaGTEAM g&eacute;n&eacute;r&eacute;es des mutations ponctuelles sont dus &agrave; des erreurs de la recombinaison homologue (HR) et d&eacute;pendent de resectioning et de la polym&eacute;rase Erreurs Pol &zeta;. Nous montrons que les RH est sujette &agrave; cet &eacute;gard en raison de dommages point de contr&ocirc;le d&#39;activation et de paires de bases l&eacute;sions de l&#39;ADN et utiliser ces connaissances pour passer le r&eacute;sultat principal de mutag&egrave;ne des pauses endonucl&eacute;ase cibl&eacute;e de r&eacute;arrangements HR ind&eacute;pendant de mutations ponctuelles ax&eacute;es sur les ressources humaines. La possibilit&eacute; de basculer la r&eacute;paration de cette fa&ccedil;on s&#39;ouvre la possibilit&eacute; d&#39;utiliser des endonucl&eacute;ases cibl&eacute;es dans les divers organismes pour in mutagen&egrave;se cibl&eacute;e vivo.

Exploiter une recombinaison homologue mutag&egrave;ne de mutagen&egrave;se cibl&eacute;e in vivo par TaGTEAM.

Un grande ostacolo agli approcci di ingegneria evolutivi per fenotipi multigenic &egrave; la capacit&agrave; di modificare simultaneamente pi&ugrave; geni rapidamente e in modo selettivo. Qui, descriviamo un metodo per mutagenesi mirata vivo in lievito, targeting glycosylases matrici incorporate per mutagenesi (TaGTEAM). Fondendo il lievito 3-polymerase DNA glycosylase MAG1 a un dominio DNA-binding tetR, siamo in grado di elevare i tassi di mutazione &amp;gt; 800 piega in una regione specifica &sim;20-kb del genoma o su un plasmide che contiene una matrice di tetO siti. Un ampio spettro di transizioni, transversioni e delezioni singole base sono osservati. Forniamo prove che TaGTEAM generate mutazioni puntiformi si verificano attraverso ricombinazione omologa error-prone (HR) e dipendono dalla resectioning e la polimerasi error-prona Pol &zeta;. Mostriamo che HR &egrave; error-prone, in questo contesto a causa del DNA danni checkpoint attivazione e coppia di basi lesioni e usare questa conoscenza per spostare l&#39;outcome primario mutageni di interruzioni di endonucleasi mirati da riarrangiamenti HR-indipendente a mutazioni puntiformi HR-dipendente. La possibilit&agrave; di passare la riparazione in questo modo si apre la possibilit&agrave; di utilizzare endonucleases mirati in diversi organismi per la mutagenesi mirata vivo.

Sfruttando la ricombinazione omologa mutagene per mutagenesi mirata in vivo da TaGTEAM.

Modifying the expression of multiple genes enables both deeper understanding of their function and the engineering of complex multigenic cellular phenotypes. However, deletion or overexpression of multiple genes is typically laborious and involves multiple sequential genetic modifications. Here we describe a strategy to randomize the expression state of multiple genes in Saccharomyces cerevisiae using Cre-loxP recombination. By inserting promoters flanked by inverted loxP sites in front of a gene of interest we can randomly alter its expression by turning it OFF or ON, or between four distinct expression states. We show at least 6 genes can be randomized independently and argue that using orthogonal loxP sites should increase this number to at least 15. Finally, we show how combining this strategy with mating allows easy introduction of native regulation as an additional expression state and use this to probe the role of four different enzymes involved in base excision repair in tolerance to methyl methane sulfonate (MMS), a genotoxic DNA alkylating agent. The set of vectors developed here can be used to randomize the expression of both heterologous genes and endogenous genes, and could immediately prove useful for metabolic engineering in yeast. Because Cre-loxP recombination works in many organisms, this strategy should be readily extendable. Biotechnol. Bioeng. 2013;xxx: xx-xx. Â© 2013 Wiley Periodicals, Inc.

Using the Cre-lox System to Randomize Target Gene Expression States and Generate Diverse Phenotypes.

Modifier l&#39;expression de plusieurs g&egrave;nes permet tant mieux comprendre leur fonction et l&#39;ing&eacute;nierie des ph&eacute;notypes cellulaires multig&eacute;niques complexes. Toutefois, la suppression ou la surexpression de plusieurs g&egrave;nes est g&eacute;n&eacute;ralement laborieuse et implique plusieurs modifications g&eacute;n&eacute;tiques s&eacute;quentielles. Nous d&eacute;crivons ici une strat&eacute;gie visant &agrave; rendre al&eacute;atoire de l&#39;&eacute;tat de l&#39;expression de multiples g&egrave;nes chez Saccharomyces cerevisiae, &agrave; l&#39;aide de recombinaison Cre-loxP. En ins&eacute;rant des promoteurs flanqu&eacute;s de sites loxP invers&eacute; en face d&#39;un g&egrave;ne d&#39;int&eacute;r&ecirc;t, nous pouvons modifier al&eacute;atoirement son expression en la faisant tourner OFF ou sur ou entre les quatre &Eacute;tats d&#39;expression distincte. Nous montrons au moins six g&egrave;nes peuvent &ecirc;tre randomis&eacute;s ind&eacute;pendamment et font valoir qu&#39;&agrave; l&#39;aide de sites loxP orthogonale devrait augmenter ce nombre au moins 15. Enfin, nous montrons comment alliant l&#39;accouplement de cette strat&eacute;gie permet une introduction facile des indig&egrave;ne r&egrave;glement en tant qu&#39;Etat expression suppl&eacute;mentaires et utilisez-le pour sonder le r&ocirc;le des quatre diff&eacute;rentes enzymes intervenant dans la r&eacute;paration de la base de l&#39;excision dans la tol&eacute;rance de m&eacute;thanesulfonate de m&eacute;thyle (MMS), un agent alkylant l&#39;ADN g&eacute;notoxique. L&#39;ensemble des vecteurs d&eacute;velopp&eacute; ici peut &ecirc;tre utilis&eacute; pour tirer au hasard l&#39;expression de g&egrave;nes h&eacute;t&eacute;rologues et g&egrave;nes endog&egrave;nes et pourrait se r&eacute;v&eacute;ler imm&eacute;diatement utile pour le g&eacute;nie m&eacute;tabolique chez les levures. Parce que la recombinaison Cre-loxP fonctionne dans de nombreux organismes, cette strat&eacute;gie devrait &ecirc;tre facilement extensible. Biotechnol. Bioeng. 2013 ; xxx : xx-xx. &copy; 2013 Wiley p&eacute;riodiques, Inc.

Article	Year
Computational and experimental analysis of DNA shuffling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 12626764	2003
PEG conjugation moderately protects adeno-associated viral vectors against antibody neutralization. Biotechnology and bioengineering\| PubMed ID: 15937953	2005
Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors. Nature biotechnology\| PubMed ID: 16429148	2006
Noise in protein expression scales with natural protein abundance. Nature genetics\| PubMed ID: 16715097	2006
Construction of diverse adeno-associated viral libraries for directed evolution of enhanced gene delivery vehicles. Nature protocols\| PubMed ID: 17406299	2006
Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression. Annual review of biophysics and biomolecular structure\| PubMed ID: 17477840	2007
Gene expression: dialing up the frequency. Current biology : CB\| PubMed ID: 19108770	2008
Epigenetic and conventional regulation is distributed among activators of FLO11 allowing tuning of population-level heterogeneity in its expression. PLoS genetics\| PubMed ID: 19798446	2009
Noise can induce bimodality in positive transcriptional feedback loops without bistability. Science (New York, N.Y.)\| PubMed ID: 20185727	2010
Detection of single-molecule H2O2 signalling from epidermal growth factor receptor using fluorescent single-walled carbon nanotubes. Nature nanotechnology\| PubMed ID: 20208549	2010
A regulatory role for repeated decoy transcription factor binding sites in target gene expression. Molecular systems biology\| PubMed ID: 22453733	2012
Harnessing mutagenic homologous recombination for targeted mutagenesis in vivo by TaGTEAM. Nucleic acids research\| PubMed ID: 23470991	2013
Using the Cre-lox System to Randomize Target Gene Expression States and Generate Diverse Phenotypes. Biotechnology and bioengineering\| PubMed ID: 23733452	2013

Narendra Maheshri

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