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Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Istituto Italiano di Tecnologia

Mouse polyomavirus (PyV) virions enter cells by internalization into smooth monopinocytic vesicles, which fuse under the cell membrane with larger endosomes. Caveolin-1 was detected on monopinocytic vesicles carrying PyV particles in mouse fibroblasts and epithelial cells (33). Here, we show that PyV can be efficiently internalized by Jurkat cells, which do not express caveolin-1 and lack caveolae, and that overexpression of a caveolin-1 dominant-negative mutant in mouse epithelial cells does not prevent their productive infection. Strong colocalization of VP1 with early endosome antigen 1 (EEA1) and of EEA1 with caveolin-1 in mouse fibroblasts and epithelial cells suggests that the monopinocytic vesicles carrying the virus (and vesicles containing caveolin-1) fuse with EEA1-positive early endosomes. In contrast to SV40, PyV infection is dependent on the acidic pH of endosomes. Bafilomycin A1 abolished PyV infection, and an increase in endosomal pH by NH4Cl markedly reduced its efficiency when drugs were applied during virion transport towards the cell nucleus. The block of acidification resulted in the retention of a fraction of virions in early endosomes. To monitor further trafficking of PyV, we used fluorescent resonance energy transfer (FRET) to determine mutual localization of PyV VP1 with transferrin and Rab11 GTPase at a 2- to 10-nm resolution. Positive FRET between PyV VP1 and transferrin cargo and between PyV VP1 and Rab11 suggests that during later times postinfection (1.5 to 3 h), the virus meets up with transferrin in the Rab11-positive recycling endosome. These results point to a convergence of the virus and the cargo internalized by different pathways in common transitional compartments.

Mouse polyomavirus enters early endosomes, requires their acidic pH for productive infection, and meets transferrin cargo in Rab11-positive endosomes.

Virions polyomavirus (PyV) souris entrer dans les cellules par internalisation dans les v&eacute;sicules monopinocytic lisse, qui fusionnent sous la membrane de la cellule avec la plus grande endosomes. Cav&eacute;oline-1 a &eacute;t&eacute; d&eacute;tect&eacute;e sur les v&eacute;sicules monopinocytic transportant des particules PyV dans les fibroblastes de souris et les cellules &eacute;pith&eacute;liales (33). Ici, nous montrons que PyV peut &ecirc;tre efficacement internalis&eacute; par les cellules Jurkat, qui ne pas exprimer la cav&eacute;oline-1 et n&#39;ont pas cav&eacute;oles, et que la surexpression d&#39;un mutant dominant n&eacute;gatif de cav&eacute;oline-1 dans les cellules &eacute;pith&eacute;liales de souris n&#39;emp&ecirc;che pas leur infection productive. Colocalisation forte de VP1 avec antig&egrave;ne endosome pr&eacute;coce 1 (EEA1) et de EEA1 avec cav&eacute;oline-1 dans les fibroblastes de souris et les cellules &eacute;pith&eacute;liales sugg&egrave;re que les v&eacute;sicules monopinocytic portant le virus (et les v&eacute;sicules contenant la cav&eacute;oline-1) fusible avec EEA1 s&eacute;ropositifs endosomes pr&eacute;coces. &Agrave; la diff&eacute;rence de SV40, PyV infection d&eacute;pend le pH acide des endosomes. Bafilomycines A1 aboli PyV infection, et une augmentation du pH endosomal par NH4Cl a nettement r&eacute;duit son efficacit&eacute; lorsque les m&eacute;dicaments ont &eacute;t&eacute; appliqu&eacute;s au cours du transport de virion vers le noyau de la cellule. Le bloc de l&#39;acidification a permis le maintien d&#39;une fraction des virions dans les endosomes pr&eacute;coces. Pour contr&ocirc;ler davantage le trafic de PyV, nous avons utilis&eacute; le transfert d&#39;&eacute;nergie de fluorescence de r&eacute;sonance (FRET) pour d&eacute;terminer la localisation mutuelle de PyV VP1 avec la transferrine et de la GTPase Rab11 &agrave; une r&eacute;solution de 2 &agrave; 10 nm. FRETTE positive entre PyV VP1 et cargaison de transferrine et entre PyV VP1 et Rab11 sugg&egrave;re que, au cours de temps plus tard (1,5 &agrave; 3 h) apr&egrave;s l&#39;infection, le virus se retrouve avec la transferrine dans l&#39;endosome recyclage Rab11 positifs. Ces r&eacute;sultats indiquent qu&#39;une convergence du virus et la cargaison int&eacute;rioris&eacute;es par les diff&eacute;rentes voies dans des compartiments transitoires communes.

Souris polyomavirus p&eacute;n&egrave;tre dans les endosomes pr&eacute;coces, exige leur pH acide pour infection productive et rencontre la cargaison de la transferrine dans les endosomes Rab11 positifs.

Virioni poliomavirus (PyV) mouse entra cellule di internalizzazione in vescicole monopinocytic liscio, che fuse sotto la membrana cellulare con grandi endosomes. Caveolina-1 &egrave; stato rilevato su monopinocytic vescicole che trasportano particelle PyV in fibroblasti e cellule epiteliali (33). Qui, vi mostriamo che PyV pu&ograve; essere interiorizzato in modo efficiente da cellule Jurkat, che non esprimono caveolina-1 e mancanza caveolae, e quel sovraespressione di un mutante dominante-negativo caveolina-1 in cellule epiteliali di topo non impedisce la loro infezione produttiva. Forte presenza di VP1 con primi endosome antigene 1 (EEA1) e di EEA1 con caveolina-1 in fibroblasti e cellule epiteliali suggerisce che la monopinocytic vescicole che trasportano il virus (e vescicole contenenti caveolina-1) fusibile con EEA1-positivi presto endosomes. A differenza di SV40, PyV infezione dipende il pH acido dei endosomes. Bafilomycin A1 abolito PyV infezione, e un aumento del pH endosomal da NH4Cl marcatamente ridotta l&#39;efficienza quando i farmaci sono stati applicati durante il trasporto del virione verso il nucleo cellulare. Il mantenimento di una frazione di virioni in early endosomes ha provocato il blocco di acidificazione. Per monitorare l&#39;ulteriore traffico di PyV, abbiamo usato il trasferimento di energia di risonanza fluorescente (FRET) per determinare la localizzazione reciproco di PyV VP1 con Transferrina e Rab11 GTPasi ad una risoluzione di 2-10 nm. FRET positivo tra PyV VP1 e carico di transferrina e tra PyV VP1 e Rab11 suggerisce che durante il successivamente volte postinfection (1,5-3 h), il virus incontra con Transferrina nel endosome riciclaggio Rab11-positivo. Questi risultati indicano una convergenza del virus e il cargo interiorizzato da diversi percorsi in compartimenti transitori comuni.

Polyomavirus del mouse entra presto endosomes, richiede loro pH acido per infezione produttiva e incontra cargo Transferrina in Rab11-positivi endosomes.

Creatine kinase (CK) (E.C. 2.7.3.2) buffers cellular ATP concentration during fluctuating ATP turnover. Muscle cytosolic CK isoform interacts with various subcellular structures where it is functionally coupled with relevant ATPases. However, how this interaction affects its activity is not known. We have therefore studied the interaction of CK with myofibrils and the role of different conformational states of CK molecule induced by ATP, phosphocreatine, ADP and the ATP-creatine pair. Purified rabbit psoas myofibrils with CK specific activity of 0.4+/-0.02 IU/mg were used. The exchange rates between the myofibrillar M-band and its surroundings were measured with fluorofore conjugated CK (IAF) by the Fluorescence Lost in Photobleaching (FLIP) method within a very narrow pH range 7.1-7.15. For CK-IAF without docked substrates, the time derivative of the initial loss of the fluorescent signal within the M-band equalled -3.26 at the fifth second and the decrease reached 82% by the 67th second. For CK-IAF with added substrates, the derivatives fell into the range of -0.95 to -1.30, with respective decreases from 16 to 46% at the 67th second. The results show that the substrates slowed down the exchange rate. This indicates that the strength of the bond between CK and the M-band of myofibrils increased.

Creatine kinase binds more firmly to the M-band of rabbit skeletal muscle myofibrils in the presence of its substrates.

Cr&eacute;atine kinase (CK) (EC 2.7.3.2) met en m&eacute;moire tampon des concentration d&#39;ATP cellulaire lors de fluctuation d&#39;ATP. Isoforme cytosolique de CK musculaire interagit avec diff&eacute;rentes structures subcellulaires o&ugrave; il est fonctionnellement coupl&eacute; avec des ATPases pertinentes. Cependant, comment cette interaction affecte son activit&eacute; ne sait pas. Nous avons donc &eacute;tudi&eacute; l&#39;interaction de la CK avec les myofibrilles et le r&ocirc;le des diff&eacute;rents &Eacute;tats conformationnels de mol&eacute;cule CK induite par l&#39;ATP, phosphocr&eacute;atine, ADP et la paire ATP-cr&eacute;atine. Purifi&eacute;e myofibrilles du psoas de lapin avec l&#39;activit&eacute; sp&eacute;cifique de CK de 0.4+/-0.02 UI/mg ont &eacute;t&eacute; utilis&eacute;s. Les taux de change entre la bande M myofibrillaire et ses environs ont &eacute;t&eacute; mesur&eacute;es avec fluorofore CK conjugu&eacute;s (IAF) par la Fluorescence perdu dans la m&eacute;thode de photoblanchiment (FLIP) au sein d&#39;un pH tr&egrave;s &eacute;troit gamme 7.1-7.15. Pour CK-IAF sans substrats ancr&eacute;es, la d&eacute;riv&eacute;e temporelle de la perte initiale du signal fluorescent dans la bande M &eacute;gal&eacute;-3.26 &agrave; la cinqui&egrave;me seconde, et la diminution atteint 82 % par le second 67e. Les d&eacute;riv&eacute;s sont tomb&eacute;s sur CK-IAF dont le substrat de l&#39;ajout, dans la fourchette de -0,95 &agrave;-1.30, avec des baisses respectives de 16 &agrave; 46 % lors de la 67e deuxi&egrave;me. Les r&eacute;sultats montrent que les substrats ralentissent le taux de change. Cela indique que la force de la liaison entre CK et la M-bande de myofibrilles a augment&eacute;.

Cr&eacute;atine kinase se lie plus fermement &agrave; la M-bande des myofibrilles des muscles squelettiques de lapin en pr&eacute;sence de ses substrats.

Creatina chinasi (CK) (E.C. 2.7.3.2) buffer concentrazione di ATP cellulare durante il fatturato ATP fluttuante. Isoforma CK citosolica muscolo interagisce con varie strutture subcellulari dove &egrave; funzionalmente accoppiato con ATPasi pertinenti. Tuttavia, il come questa interazione influisce sulla sua attivit&agrave; non &egrave; noto. Abbiamo quindi studiato l&#39;interazione di CK con miofibrille e il ruolo dei diversi stati conformazionali della molecola CK indotta da ATP, fosfocreatina, ADP e la coppia di ATP-creatina. Purificato miofibrille psoas coniglio con attivit&agrave; specifica CK di 0.4+/-0.02 IU/mg sono state utilizzate. I tassi di cambio tra la banda M miofibrillare e i suoi dintorni sono stati misurati con fluorofore coniugati CK (IAF) dalla fluorescenza perso nel metodo Photobleaching (FLIP) all&#39;interno di un pH molto stretta gamma 7.1-7.15. Per CK-IAF senza substrati ancorati, il derivato di tempo della perdita iniziale del segnale fluorescente all&#39;interno della M-band eguagliato-3.26 al secondo quinto e la diminuzione ha raggiunto 82% dalla seconda 67a. Per CK-IAF con substrati aggiunti, i derivati caddero nella gamma di-0.95 di-1.30, con rispettivi diminuisce da 16 a 46% al 67 &deg; secondo. I risultati mostrano che i substrati rallentarono il tasso di cambio. Questo indica che la forza del legame tra CK e il M.-fascia di miofibrille aumentato.

Creatina chinasi si lega pi&ugrave; saldamente alla M-band di miofibrille muscolo scheletrico coniglio in presenza di suoi substrati.

During neuronal differentiation, lamellipodia and filopodia explore the environment in search for the correct path to the axon's final destination. Although the motion of lamellipodia and filopodia has been characterized to an extent, little is known about the force they exert. In this study, we used optical tweezers to measure the force exerted by filopodia and lamellipodia with a millisecond temporal resolution. We found that a single filopodium exerts a force not exceeding 3 pN, whereas lamellipodia can exert a force up to 20 pN. Using metabolic inhibitors, we showed that no force is produced in the absence of actin polymerization and that development of forces larger than 3 pN requires microtubule polymerization. These results show that actin polymerization is necessary for force production and demonstrate that not only do neurons process information, but they also act on their environment exerting forces varying from tenths pN to tens of pN.

Properties of the force exerted by filopodia and lamellipodia and the involvement of cytoskeletal components.

Au cours de la diff&eacute;renciation neuronale, lamellipodia et filopodes explorent l&#39;environnement &agrave; rechercher le chemin d&#39;acc&egrave;s correct vers la destination finale de l&#39;axone. Bien que le mouvement des lamellipodia et des filopodes a &eacute;t&eacute; caract&eacute;ris&eacute; dans une certaine mesure, on en sait peu sur la force qu&#39;elles exercent. Dans cette &eacute;tude, nous avons utilis&eacute; des pinces optiques pour mesurer la force exerc&eacute;e par les filopodes et lamellipodia avec une r&eacute;solution temporelle de la milliseconde. Nous avons trouv&eacute; qu&#39;un seul filopodium exerce une force ne d&eacute;passant ne pas 3 pN, tandis que lamellipodia peut exercer une force jusqu&#39;&agrave; pN 20. En utilisant des inhibiteurs m&eacute;taboliques, nous avons montr&eacute; qu&#39;aucune force n&#39;est produite en l&#39;absence de polym&eacute;risation de l&#39;actine et que le d&eacute;veloppement des forces plus grands que pN 3 n&eacute;cessite la polym&eacute;risation des microtubules. Ces r&eacute;sultats montrent que polym&eacute;risation de l&#39;actine est n&eacute;cessaire pour la production de force et d&eacute;montrer que non seulement les neurones traitent l&#39;information, mais ils agissent &eacute;galement sur leur environnement exer&ccedil;ant des forces variant de dixi&egrave;mes pN &agrave; des dizaines de pN.

Propri&eacute;t&eacute;s de la force exerc&eacute;e par les filopodes et lamellipodia et l&#39;implication des composants du cytosquelette.

Durante la differenziazione neuronale, lamellipodia e filopodia esplorare l&#39;ambiente nella ricerca per il corretto percorso verso la destinazione finale dell&#39;assone. Anche se il movimento di lamellipodia e filopodia &egrave; stato caratterizzato in una certa misura, poco si sa circa la forza che esercitano. In questo studio, abbiamo usato la pinzetta ottica per misurare la forza esercitata dal filopodia e lamellipodia con una risoluzione temporale di millisecondo. Abbiamo trovato che un singolo filopodium esercita una forza non superiore a 3 pN, mentre lamellipodia pu&ograve; esercitare una forza fino a pN 20. Utilizzando inibitori metabolici, abbiamo dimostrato che nessuna forza &egrave; prodotta in assenza di polimerizzazione dell&#39;actina e che lo sviluppo delle forze pi&ugrave; grandi di quanto pN 3 richiede polimerizzazione dei microtubuli. Questi risultati mostrano che polimerizzazione dell&#39;actina &egrave; necessaria per la produzione di forza e dimostrare che non solo i neuroni elaborare le informazioni, ma agiscono anche sul loro ambiente esercitare forze variano da pN decimi a decine di pN.

Propriet&agrave; della forza esercitata dalla filopodia e lamellipodia e il coinvolgimento di componenti citoscheletriche.

We investigated possibilities of the combination of the one- and two-photon excitation microscopy for examination of the experimental melanoma tissue in vivo, in mice under general anesthesia, and ex vivo on freshly harvested specimens. Our aim was to obtain sufficiently informative images of unstained tumor tissues and their modifications after hyperthermia treatment. The mouse experimental melanoma structure was studied and compared with normal tissue from the same animal by using confocal and nonlinear microscopy techniques based on (i) one-photon excitation (1PE) fluorescence, (ii) 1PE reflectance, (iii) second harmonic generation imaging, and (iv) two-photon excitation autofluorescence. We checked different spectral conditions and other settings of image acquisition, as well as combinations of the above imaging modalities, to fully exploit the potential of these techniques in the evaluation of treated and untreated cancer tissue morphology. Our approach enabled to reveal the collagen fiber network in relation with the other tissues, and to identify invasive tumor cells. It also proved to be useful for the examination of interrelationships between functional and morphological aspects based on optical properties of the tissues, especially in studies of changes between the tumor and control tissue, as well as changes induced by physical treatments, e.g., delivery of microwave hyperthermia treatment. These differences were also evaluated quantitatively, when we found out that the maximum Euler-PoincarÃ© characteristic reflects well the melanoma morphological structure. The results showed that the proposed investigative approach could be suitable also for a direct evaluation of tissue modifications induced by clinical interventions.

Imaging of mouse experimental melanoma in vivo and ex vivo by combination of confocal and nonlinear microscopy.

Nous avons &eacute;tudi&eacute; les possibilit&eacute;s de la combinaison de la microscopie d&#39;excitation celui - et deux photons pour examen des tissus m&eacute;lanome exp&eacute;rimental in vivo, chez des souris sous anesth&eacute;sie g&eacute;n&eacute;rale et ex vivo sur des sp&eacute;cimens fra&icirc;chement r&eacute;colt&eacute;s. Notre objectif &eacute;tait d&#39;obtenir des images suffisamment informatives des tissus tumoraux non color&eacute;s et leurs modifications apr&egrave;s le traitement de l&#39;hyperthermie. La structure de m&eacute;lanome exp&eacute;rimental de souris a &eacute;t&eacute; &eacute;tudi&eacute;e et par rapport aux tissus normaux de l&#39;animal m&ecirc;me en utilisant des techniques de microscopie confocale et non lin&eacute;aire bas&eacute;es sur (i) un photon d&#39;excitation (1PE) fluorescence, r&eacute;flectance 1PE (ii), l&#39;imagerie harmonique (iii) la deuxi&egrave;me g&eacute;n&eacute;ration et (iv) deux photons excitation autofluorescence. Nous avons v&eacute;rifi&eacute; les conditions spectrales diff&eacute;rentes et autres param&egrave;tres d&#39;acquisition d&#39;images, ainsi que des combinaisons des modalit&eacute;s d&#39;imagerie ci-dessus, pour exploiter pleinement le potentiel de ces techniques dans l&#39;&eacute;valuation des traitement et non trait&eacute;s de morphologie tissulaire du cancer. Notre approche a permis de r&eacute;v&eacute;ler le r&eacute;seau de fibres de collag&egrave;ne en relation avec les autres tissus et pour identifier les cellules de tumeur invasive. Il est &eacute;galement av&eacute;r&eacute; pour &ecirc;tre utile pour l&#39;examen des liens entre les aspects fonctionnels et morphologiques bas&eacute;es sur les propri&eacute;t&eacute;s optiques des tissus, surtout dans les &eacute;tudes des changements entre la tumeur et le contr&ocirc;le tissu, ainsi que les changements induits par traitements physiques, par exemple, livraison de traitement de l&#39;hyperthermie micro-ondes. Ces diff&eacute;rences ont &eacute;galement &eacute;t&eacute; &eacute;valu&eacute;es quantitativement, lorsque nous avons constat&eacute; que la caract&eacute;ristique d&#39;Euler-Poincar&eacute; maximale refl&egrave;te bien la structure morphologique du m&eacute;lanome. Les r&eacute;sultats ont montr&eacute; que la d&eacute;marche d&#39;enqu&ecirc;te propos&eacute;e pourrait convenir &eacute;galement pour une &eacute;valuation directe des modifications tissulaires induites par des interventions cliniques.

Imagerie du m&eacute;lanome exp&eacute;rimental de souris in vivo et ex vivo par la combinaison de la microscopie confocale et non lin&eacute;aire.

Abbiamo studiato la possibilit&agrave; di combinazione di microscopia di eccitazione di uno e due-fotone per esame del tessuto melanoma sperimentale in vivo, in topi in anestesia generale ed ex vivo su campioni appena raccolti. Il nostro obiettivo era quello di ottenere immagini sufficientemente informativi dei tessuti tumorali non marcate e loro modifiche dopo il trattamento di ipertermia. La struttura di melanoma sperimentale del mouse &egrave; stata studiata e confrontata con tessuto normale dall&#39;animale stesso utilizzando tecniche di microscopia confocale e non lineare basati su (i) one-fotone fluorescenza eccitazione (1PE), (ii) 1PE riflettanza, (iii) seconda armonica generazione immagini e (iv) due-fotone eccitazione autofluorescenza. Abbiamo controllato diverse condizioni spettrale e altre impostazioni di acquisizione di immagini, come pure le combinazioni delle suddette modalit&agrave; di imaging, di sfruttare appieno il potenziale di queste tecniche nella valutazione dei trattati e non trattati la morfologia dei tessuti di cancro. Il nostro approccio abilitato a rivelare la rete di fibre collagene in relazione con gli altri tessuti e di identificare le cellule tumorali invasive. Anche dimostrato di essere utile per l&#39;esame delle interrelazioni tra aspetti morfologici e funzionali, basati sulle propriet&agrave; ottiche dei tessuti, soprattutto negli studi di cambiamenti tra il tumore e controllo tessuto, cos&igrave; come i cambiamenti indotti da trattamenti fisici, ad esempio, consegna di trattamento di ipertermia a microonde. Queste differenze sono state inoltre valutate quantitativamente, quando abbiamo scoperto che la caratteristica di Eulero-Poincar&eacute; massima ben riflette la struttura morfologica del melanoma. I risultati hanno mostrato che l&#39;approccio investigativo proposto potrebbe essere adatto anche per una valutazione diretta delle modifiche dei tessuti indotta da interventi clinici.

Imaging del melanoma sperimentale di topo in vivo ed ex vivo dalla combinazione di microscopia confocale e non lineare.

Polymerization of actin filaments is the primary source of motility in lamellipodia and it is controlled by a variety of regulatory proteins. The underlying molecular mechanisms are only partially understood and a precise determination of dynamical properties of force generation is necessary. Using optical tweezers, we have measured with millisecond (ms) temporal resolution and picoNewton (pN) sensitivity the force-velocity (Fv) relationship and the power dissipated by lamellipodia of dorsal root ganglia neurons. When force and velocity are averaged over 3-5 s, the Fv relationships can be flat. On a finer timescale, random occurrence of fast growth and subsecond retractions become predominant. The maximal power dissipated by lamellipodia over a silica bead with a diameter of 1 microm is 10(-16) W. Our results clarify the dynamical properties of force generation: i), force generation is a probabilistic process; ii), underlying biological events have a bandwidth up to at least 10 Hz; and iii), fast growth of lamellipodia leading edge alternates with local retractions.

Force generation in lamellipodia is a probabilistic process with fast growth and retraction events.

La polym&eacute;risation des filaments d&#39;actine est que la principale source de motilit&eacute; dans lamellipodia et il est contr&ocirc;l&eacute;e par une vari&eacute;t&eacute; de prot&eacute;ines r&eacute;gulatrices. Les m&eacute;canismes mol&eacute;culaires sous-jacents ne sont que partiellement connues et une d&eacute;termination pr&eacute;cise des propri&eacute;t&eacute;s dynamiques de la g&eacute;n&eacute;ration de force est n&eacute;cessaire. &Agrave; l&#39;aide de pinces optiques, nous avons mesur&eacute; avec r&eacute;solution temporelle de milliseconde (ms) et picoNewton (pN) sensibilit&eacute; la relation force-vitesse (Fv) et la puissance dissip&eacute;e par lamellipodia de neurones des ganglions spinaux. Quand la force et la vitesse sont en moyenne sur 3-5 s, les relations de Fv peuvent &ecirc;tre plates. Sur une &eacute;chelle de temps plus fine, &eacute;v&eacute;nement al&eacute;atoire d&#39;une croissance rapide et subsecond r&eacute;tractations deviennent pr&eacute;dominants. La puissance maximale dissip&eacute;e par lamellipodia sur une perle de silice d&#39;un diam&egrave;tre de 1 microm est 10(-16) W. Nos r&eacute;sultats clarifier les propri&eacute;t&eacute;s dynamiques de la g&eacute;n&eacute;ration de la force : J&#39;ai), mise sur pied est un processus probabiliste ; II), qui sous-tendent les &eacute;v&eacute;nements biologiques ont une bande passante jusqu&#39;&agrave; au moins 10 Hz ; et iii), rapide croissance du bord d&#39;attaque de lamellipodia alterne avec r&eacute;tractation locale.

Mise sur pied en lamellipodia est un processus probabiliste avec une croissance rapide et les &eacute;v&eacute;nements de r&eacute;traction.

La polimerizzazione dei filamenti di actina &egrave; che la fonte primaria della motilit&agrave; in lamellipodia ed esso &egrave; controllata da una variet&agrave; di proteine regolatorie. I meccanismi molecolari sottostanti sono solo parzialmente comprensibili e una precisa determinazione delle propriet&agrave; dinamico della forza di generazione &egrave; necessaria. Utilizzando una pinzetta ottica, abbiamo misurato con risoluzione temporale di millisecondo (ms) e la sensibilit&agrave; di picoNewton (pN) la relazione forza-velocit&agrave; (Fv) e la potenza dissipata da lamellipodia dei neuroni dei gangli spinali. Quando forza e velocit&agrave; sono media di 3-5 s, le relazioni di Fv possono essere piatte. Su una scala temporale pi&ugrave; preciso, occorrenza casuale di crescita veloce e retrazioni subsecond diventano predominanti. La potenza massima dissipata da lamellipodia sopra una perlina di silice con un diametro di 1 microm &egrave; 10(-16) W. I nostri risultati chiarire le propriet&agrave; dinamiche della forza di generazione: i), forza di generazione &egrave; un processo probabilistico; II), sottostanti eventi biologici hanno una larghezza di banda fino a almeno 10 Hz; e iii), crescita veloce di lamellipodia leading edge si alterna con retrazioni locale.

Generazione di forza in lamellipodia &egrave; un processo probabilistico con crescita veloce e gli eventi di retrazione.

Holographic microscopy is increasingly recognized as a promising tool for the study of the central nervous system. Here we present a "holographic module", a simple optical path that can be combined with commercial scanheads for simultaneous imaging and uncaging with structured two-photon light. The present microscope is coupled to two independently tunable lasers and has two principal configurations: holographic imaging combined with galvo-steered uncaging and holographic uncaging combined with conventional scanning imaging. We applied this flexible system for simultaneous two-photon imaging and photostimulation of neuronal cells with complex light patterns, opening new perspectives for the study of brain function in situ and in vivo.

Simultaneous two-photon imaging and photo-stimulation with structured light illumination.

Regeneration of functional connectivity within a neural network after different degrees of lesion is of utmost clinical importance. To test pharmacological approaches aimed at recovering from a total or partial damage of neuronal connections within a circuit, it is necessary to develop a precise method for controlled ablation of neuronal processes. We combined a UV laser microdissector to ablate neural processes in vitro at single neuron and neural network level with infrared holographic optical tweezers to carry out force spectroscopy measurements. Simultaneous force spectroscopy, down to the sub-pico-Newton range, was performed during laser dissection to quantify the tension release in a partially ablated neurite. Therefore, we could control and measure the damage inflicted to an individual neuronal process. To characterize the effect of the inflicted injury on network level, changes in activity of neural subpopulations were monitored with subcellular resolution and overall network activity with high temporal resolution by concurrent calcium imaging and microelectrode array recording. Neuronal connections have been sequentially ablated and the correlated changes in network activity traced and mapped. With this unique combination of electrophysiological and optical tools, neural activity can be studied and quantified in response to controlled injury at the subcellular, cellular, and network level.

Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks.

R&eacute;g&eacute;n&eacute;ration de connectivit&eacute; fonctionnelle au sein d&#39;un r&eacute;seau de neurones apr&egrave;s diff&eacute;rents degr&eacute;s de l&eacute;sion est d&#39;une importance clinique. Pour tester des approches pharmacologiques visant &agrave; r&eacute;cup&eacute;rer d&#39;un dommage total ou partiel des connexions neuronales dans un circuit, il est n&eacute;cessaire de d&eacute;velopper une m&eacute;thode pr&eacute;cise pour ablation contr&ocirc;l&eacute;e des processus neuronaux. Nous avons combin&eacute; une microdissector de laser UV pour l&#39;ablation des processus neuronaux in vitro au seul neurone et au niveau du r&eacute;seau de neurones avec des pinces optiques holographiques infrarouges d&#39;effectuer des mesures de spectroscopie de force. Spectroscopie simultan&eacute;e de force, vers le bas pour la gamme sub-pico-Newton, a &eacute;t&eacute; r&eacute;alis&eacute;e au cours de la dissection pour quantifier la lib&eacute;ration de tension dans une neurite partiellement ablation laser. Par cons&eacute;quent, nous pourrions contr&ocirc;ler et mesurer les d&eacute;g&acirc;ts inflig&eacute;s &agrave; un processus de neurones individuel. Pour caract&eacute;riser l&#39;effet du pr&eacute;judice inflig&eacute; au niveau r&eacute;seau, changements dans l&#39;activit&eacute; des sous-populations de neurones ont &eacute;t&eacute; mesur&eacute;s avec r&eacute;solution subcellulaire et activit&eacute; de r&eacute;seau globale avec une haute r&eacute;solution temporelle par enregistrement de calcium simultan&eacute;es d&#39;imagerie et de la micro&eacute;lectrode de tableau. Connexions neuronales ont &eacute;t&eacute; l&#39;objet d&#39;une ablation s&eacute;quentiellement et les changements corr&eacute;l&eacute;s &agrave; l&#39;activit&eacute; du r&eacute;seau retrouv&eacute;s et cartographi&eacute;s. Avec cette combinaison unique d&#39;outils &eacute;lectrophysiologiques et optiques, activit&eacute; neuronale peut &ecirc;tre &eacute;tudi&eacute;e et quantifi&eacute;e en r&eacute;ponse &agrave; une l&eacute;sion contr&ocirc;l&eacute;e &agrave; la subcellulaires, cellulaires et niveau r&eacute;seau.

Combin&eacute; des pinces optiques et dissecteur de laser pour ablation contr&ocirc;l&eacute;e de connexions fonctionnelles dans les r&eacute;seaux de neurones.

Rigenerazione di connettivit&agrave; funzionale all&#39;interno di una rete neurale dopo diversi gradi di lesione &egrave; della massima importanza clinica. Per testare gli approcci farmacologici finalizzati al recupero da un danno totale o parziale delle connessioni neuronali all&#39;interno di un circuito, &egrave; necessario sviluppare un metodo preciso per ablazione controllata dei processi neuronali. Abbiamo combinato un UV laser microdissector per ablazione processi neurali in vitro a livello di rete neurale e singolo neurone con infrarossi pinzetta ottica olografica di effettuare misurazioni di spettroscopia di forza. Spettroscopia di vigore simultanea, fino alla gamma di sub-pico-Newton, &egrave; stata eseguita durante la dissezione laser per quantificare il rilascio di tensione in dei neuriti parzialmente ablato. Pertanto, possiamo controllare e misurare il danno inflitto a un singolo processo neuronale. Per caratterizzare l&#39;effetto del danno inflitto al livello rete, cambiamenti nell&#39;attivit&agrave; di sottopopolazioni neurale sono stati monitorati con risoluzione sottocellulare e attivit&agrave; di rete complessiva con alta risoluzione temporale di registrazione di matrice imaging e microelettrodo calcio simultanee. Connessioni neuronali sono stati ablazione sequenziale e le modifiche correlate in attivit&agrave; di rete, individuate e mappato. Con questa combinazione unica di strumenti elettrofisiologici e ottici, attivit&agrave; neurale pu&ograve; essere studiato e quantificato in risposta alla lesione controllata al subcellulare, cellulare e il livello di rete.

Combinato pinzetta ottica e dissettore laser per ablazione controllata di connessioni funzionali in reti neurali.

During development, axons of neurons in the mammalian central nervous system lose their ability to regenerate. To study the regeneration process, axons of mouse hippocampal neurons were partially damaged by an UVA laser dissector system. The possibility to deliver very low average power to the sample reduced the collateral thermal damage and allowed studying axonal regeneration of mouse neurons during early days in vitro. Force spectroscopy measurements were performed during and after axon ablation with a bead attached to the axonal membrane and held in an optical trap. With this approach, we quantified the adhesion of the axon to the substrate and the viscoelastic properties of the membrane during regeneration. The reorganization and regeneration of the axon was documented by long-term live imaging. Here we demonstrate that BDNF regulates neuronal adhesion and favors the formation of actin waves during regeneration after axonal lesion.

The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF.

Au cours du d&eacute;veloppement, les axones des neurones dans le syst&egrave;me nerveux central des mammif&egrave;res perdent leur capacit&eacute; &agrave; se r&eacute;g&eacute;n&eacute;rer. Afin d&#39;&eacute;tudier le processus de r&eacute;g&eacute;n&eacute;ration, les axones des neurones de l&#39;hippocampe souris ont &eacute;t&eacute; partiellement endommag&eacute;s par un syst&egrave;me de dissecteur laser UVA. La possibilit&eacute; de livrer de tr&egrave;s faible puissance moyenne de l&#39;&eacute;chantillon r&eacute;duit les dommages collat&eacute;raux thermique et autoris&eacute;s &agrave; &eacute;tudier la r&eacute;g&eacute;n&eacute;ration des neurones de souris au cours des premiers jours in vitro. Mesures de spectroscopie de force ont &eacute;t&eacute; effectu&eacute;es pendant et apr&egrave;s l&#39;axone ablation avec un filet attach&eacute; &agrave; la membrane axonale et qui s&#39;est tenue dans un pi&egrave;ge optique. Avec cette approche, nous avons quantifi&eacute; l&#39;adh&eacute;rence de l&#39;axone au substrat et les propri&eacute;t&eacute;s visco-&eacute;lastiques de la membrane pendant la r&eacute;g&eacute;n&eacute;ration. La r&eacute;organisation et la r&eacute;g&eacute;n&eacute;ration de l&#39;axone est document&eacute;e par l&#39;imagerie live &agrave; long terme. Nous d&eacute;montrons que le BDNF r&eacute;gule l&#39;adh&eacute;sion neuronale et favorise la formation de vagues d&#39;actine pendant la r&eacute;g&eacute;n&eacute;ration apr&egrave;s une l&eacute;sion axonale.

La formation de vagues d&#39;actine pendant la r&eacute;g&eacute;n&eacute;ration apr&egrave;s une l&eacute;sion axonale est renforc&eacute;e par le BDNF.

Durante lo sviluppo, assoni di neuroni del sistema nervoso centrale dei mammiferi perdono la loro capacit&agrave; di rigenerare. Per studiare il processo di rigenerazione, assoni di neuroni hippocampal del mouse sono stati parzialmente danneggiati da un sistema dissettore laser a raggi UVA. La possibilit&agrave; di erogare potenza media molto bassa al campione ridotto il danno termico collaterale e ha permesso di studiare la rigenerazione assonale dei neuroni del mouse durante i primi giorni in vitro. Forza spettroscopia misurazioni sono state eseguite durante e dopo l&#39;assone ablazione con un tallone attaccato alla membrana assonale e tenuto in una trappola ottica. Con questo approccio, abbiamo quantificato l&#39;adesione dell&#39;assone al substrato e le propriet&agrave; viscoelastiche della membrana durante la rigenerazione. La riorganizzazione e la rigenerazione dell&#39;assone &egrave; stato documentato da immagini dal vivo a lungo termine. Qui ci dimostrano che il BDNF regola adesione neuronale e favorisce la formazione di onde di actina durante la rigenerazione dopo lesione assonale.

La formazione di onde di actina durante la rigenerazione dopo lesione assonale si arricchisce di BDNF.

Brain-machine interfaces (BMI) were born to control "actions from thoughts" in order to recover motor capability of patients with impaired functional connectivity between the central and peripheral nervous system. The final goal of our studies is the development of a new proof-of-concept BMI-a neuromorphic chip for brain repair-to reproduce the functional organization of a damaged part of the central nervous system. To reach this ambitious goal, we implemented a multidisciplinary "bottom-up" approach in which in vitro networks are the paradigm for the development of an in silico model to be incorporated into a neuromorphic device. In this paper we present the overall strategy and focus on the different building blocks of our studies: (i) the experimental characterization and modeling of "finite size networks" which represent the smallest and most general self-organized circuits capable of generating spontaneous collective dynamics; (ii) the induction of lesions in neuronal networks and the whole brain preparation with special attention on the impact on the functional organization of the circuits; (iii) the first production of a neuromorphic chip able to implement a real-time model of neuronal networks. A dynamical characterization of the finite size circuits with single cell resolution is provided. A neural network model based on Izhikevich neurons was able to replicate the experimental observations. Changes in the dynamics of the neuronal circuits induced by optical and ischemic lesions are presented respectively for in vitro neuronal networks and for a whole brain preparation. Finally the implementation of a neuromorphic chip reproducing the network dynamics in quasi-real time (10 ns precision) is presented.

In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses.

Les interfaces cerveau-machine (IMC) sont n&eacute;s au contr&ocirc;le &laquo; des actions de pens&eacute;es &raquo; afin de r&eacute;cup&eacute;rer le moteur capacit&eacute; des patients avec une d&eacute;ficience connectivit&eacute; fonctionnelle entre le syst&egrave;me nerveux central et p&eacute;riph&eacute;rique. L&#39;objectif final de nos travaux est l&#39;&eacute;laboration d&#39;une nouvelle puce de validation, un IMC neuromorphic pour cerveau-r&eacute;paration &agrave; reproduire l&#39;organisation fonctionnelle d&#39;une partie endommag&eacute;e du syst&egrave;me nerveux central. Pour atteindre cet objectif ambitieux, nous avons impl&eacute;ment&eacute; une approche multidisciplinaire de la &laquo; bottom-up &raquo; dans laquelle les r&eacute;seaux in vitro sont le paradigme pour le d&eacute;veloppement d&#39;un in silico mod&egrave;le &ecirc;tre int&eacute;gr&eacute;e &agrave; un dispositif neuromorphic. Dans cet article, nous pr&eacute;sentons la strat&eacute;gie globale et mettre l&#39;accent sur les diff&eacute;rents &eacute;l&eacute;ments constitutifs de nos &eacute;tudes: (i) l&#39;exp&eacute;rimental caract&eacute;risation et mod&eacute;lisation des &laquo; r&eacute;seaux de taille finie &raquo;, qui repr&eacute;sentent les circuits auto-organis&eacute;e plus petits et plus g&eacute;n&eacute;rales capables de g&eacute;n&eacute;rer une dynamique collective spontan&eacute;e ; (ii) l&#39;induction des l&eacute;sions dans les r&eacute;seaux de neurones et la pr&eacute;paration du cerveau entier avec une attention particuli&egrave;re sur l&#39;impact sur l&#39;organisation fonctionnelle des circuits ; (iii) la premi&egrave;re production d&#39;une puce neuromorphic capable d&#39;appliquer un mod&egrave;le en temps r&eacute;el des r&eacute;seaux neurones. Une caract&eacute;risation dynamique des circuits taille finie avec r&eacute;solution unicellulaire est fournie. Un mod&egrave;le de r&eacute;seau neuronal bas&eacute; sur neurones d&#39;izhikevich a &eacute;t&eacute; en mesure de reproduire les observations exp&eacute;rimentales. Changements dans la dynamique des circuits neuronaux induits par des l&eacute;sions isch&eacute;miques et optiques sont pr&eacute;sent&eacute;s respectivement pour les r&eacute;seaux de neurones in vitro et pour une pr&eacute;paration de tout le cerveau. Enfin, la mise en &oelig;uvre d&#39;une puce neuromorphic reproduisant la dynamique du r&eacute;seau en temps quasi r&eacute;el (pr&eacute;cision de 10 ns) est pr&eacute;sent&eacute;.

&Eacute;tudes in vitro &agrave; grande &eacute;chelle exp&eacute;rimentales et th&eacute;oriques pour la r&eacute;alisation de bi-directional cerveau-proth&egrave;ses.

Interfacce cervello-macchina (BMI) sono nati a controllo &quot;azioni da pensieri&quot; al fine di recuperare la motricit&agrave; dei pazienti con alterata connettivit&agrave; funzionale tra il sistema nervoso centrale e periferico. L&#39;obiettivo finale dei nostri studi &egrave; lo sviluppo di un nuovo chip di proof-of-concept, un BMI neuromorphic per riparazione di cervello-a riprodurre l&#39;organizzazione funzionale di una parte danneggiata del sistema nervoso centrale. Per raggiungere questo ambizioso obiettivo, abbiamo implementato un approccio &quot;bottom-up&quot; multidisciplinare in cui le reti in vitro sono il paradigma per lo sviluppo di un in silico modello ad essere incorporati in un dispositivo di neuromorphic. In questo libro ci presenta la strategia complessiva e concentrarsi sui diversi blocchi dei nostri studi: (i) la sperimentale caratterizzazione e modellazione delle &quot;reti di dimensione finita&quot;, che rappresentano i circuiti auto-organizzati pi&ugrave; piccoli e pi&ugrave; generali in grado di generare dinamiche collettive spontanee; (ii) l&#39;induzione di lesioni in reti neuronali e la preparazione del cervello intero con speciale attenzione all&#39;impatto sull&#39;organizzazione funzionale dei circuiti; (iii) la prima produzione di un chip di neuromorphic in grado di implementare un modello in tempo reale delle reti neuronali. Viene fornita una caratterizzazione dinamica dei circuiti di dimensione finita con risoluzione della singola cella. Un modello di rete neurale basato su neuroni Izhikevich era in grado di replicare alle osservazioni sperimentali. Cambiamenti nella dinamica dei circuiti neuronali indotti da lesioni ischemiche e ottiche sono presentati rispettivamente per le reti neuronali in vitro e per una preparazione intero cervello. Infine l&#39;implementazione di un chip neuromorphic riproducendo le dinamiche di rete in tempo quasi-real (precisione 10 ns) &egrave; presentato.

Studi in vitro su larga scala teorici e sperimentali per la realizzazione del cervello-protesi bi-direzionale.

Cell signaling involves complex transduction mechanisms in which information released by nearby cells or extracellular cues are transmitted to the cell, regulating fundamental cellular activities. Understanding such mechanisms requires cell stimulation with precise control of low numbers of active molecules at high spatial and temporal resolution under physiological conditions. Optical manipulation techniques, such as optical tweezing, mechanical stress probing or nano-ablation, allow handling of probes and sub-cellular elements with nanometric and millisecond resolution. PicoNewton forces, such as those involved in cell motility or intracellular activity, can be measured with femtoNewton sensitivity while controlling the biochemical environment. Recent technical achievements in optical manipulation have new potentials, such as exploring the actions of individual molecules within living cells. Here, we review the progress in optical manipulation techniques for single-cell experiments, with a focus on force probing, cell mechanical stimulation and the local delivery of active molecules using optically manipulated micro-vectors and laser dissection.

Cell signaling experiments driven by optical manipulation.

Signalisation cellulaire implique des m&eacute;canismes de transduction complexe sur lequel informations commercialis&eacute;s par est proche de cellules ou extracellulaires des signaux sont transmis &agrave; la cellule, r&eacute;glementant les activit&eacute;s cellulaires fondamentale. Comprendre ces m&eacute;canismes, il faut la stimulation des cellules avec un contr&ocirc;le pr&eacute;cis du nombre peu &eacute;lev&eacute; de mol&eacute;cules actives &agrave; haute r&eacute;solution spatiale et temporelle, dans des conditions physiologiques. Techniques de manipulation optique, tels que l&#39;&eacute;pilation optique, de sonder des sollicitations m&eacute;caniques ou de nano-ablation, permettent une manipulation des sondes et des &eacute;l&eacute;ments subcellulaires avec nanom&eacute;trique et r&eacute;solution de milliseconde. PicoNewton forces, telles que celles impliqu&eacute;es dans la motilit&eacute; cellulaire ou activit&eacute; intracellulaire, peuvent &ecirc;tre mesur&eacute;es avec une sensibilit&eacute; de femtoNewton tout en contr&ocirc;lant l&#39;environnement biochimique. R&eacute;centes r&eacute;alisations techniques de manipulation optique ont de nouveaux potentiels, p. ex., examiner les actions des mol&eacute;cules individuelles au sein des cellules vivantes. Ici, nous passons en revue les progr&egrave;s r&eacute;alis&eacute;s dans les techniques de manipulation optique pour des exp&eacute;riences de cellule unique, en mettant l&#39;accent sur la force de probing, cellulaire stimulation m&eacute;canique et les micro-vecteurs de livraison locale de mol&eacute;cules actives utilisant optiquement manipul&eacute; et dissection au laser.

Cell signaling exp&eacute;riences conduits par manipulation optique.

Segnalazione delle cellule coinvolge meccanismi di trasduzione complesso nel quale le informazioni spunti rilasciati da vicino cellule o extracellulari sono trasmessi alla cella, che regolano le attivit&agrave; cellulari fondamentali. La comprensione di tali meccanismi richiede la stimolazione delle cellule con un controllo preciso del basso numero di molecole attive ad alta risoluzione spaziale e temporale in condizioni fisiologiche. Tecniche di manipolazione ottica, come ottica tweezing, sondaggio stress meccanici o nano-ablazione, consentono la gestione di sonde e subcellulare elementi con nanometriche e risoluzione di millisecondo. Le forze di PicoNewton, come quelli coinvolti nella motilit&agrave; cellulare o attivit&agrave; intracellulare, possono essere misurate con femtoNewton sensibilit&agrave; controllando l&#39;ambiente biochimico. Recenti realizzazioni tecniche di manipolazione ottica hanno nuovi potenziali, come esplorare le azioni delle singole molecole all&#39;interno di cellule viventi. Qui, passiamo in rassegna i progressi nelle tecniche di manipolazione ottica per esperimenti di cella singola, con un focus sulla forza di tastatura, cella micro-vettori di recapito locale di molecole attive utilizzando otticamente manipolato e stimolazione meccanica e laser dissezione.

Article	Year
Mouse polyomavirus enters early endosomes, requires their acidic pH for productive infection, and meets transferrin cargo in Rab11-positive endosomes. Journal of virology\| PubMed ID: 16611921	2006
Creatine kinase binds more firmly to the M-band of rabbit skeletal muscle myofibrils in the presence of its substrates. Molecular and cellular biochemistry\| PubMed ID: 17578655	2007
Properties of the force exerted by filopodia and lamellipodia and the involvement of cytoskeletal components. PloS one\| PubMed ID: 17957254	2007
Imaging of mouse experimental melanoma in vivo and ex vivo by combination of confocal and nonlinear microscopy. Microscopy research and technique\| PubMed ID: 19208388	2009
Force generation in lamellipodia is a probabilistic process with fast growth and retraction events. Biophysical journal\| PubMed ID: 20303855	2010
Simultaneous two-photon imaging and photo-stimulation with structured light illumination. Optics express\| PubMed ID: 20940765	2010
Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of biomedical optics\| PubMed ID: 21639566	2011
The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Scientific reports\| PubMed ID: 22355698	2011
In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Frontiers in neural circuits\| PubMed ID: 23503997	2013
Cell signaling experiments driven by optical manipulation. International journal of molecular sciences\| PubMed ID: 23698758	2013

Francesco Difato

Biography

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