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A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

University of Southern California, Los Angeles

Some species of ciliates undergo massive DNA elimination and genome rearrangement to construct gene-sized "chromosomes" in their somatic nucleus. An example is the extensively scrambled DNA polymerase alpha gene that is broken into 48 pieces and distributed over two unlinked loci in Stylonychia. To understand the emergence of this complex phenomenon during evolution, we examined DNA polymerase alpha genes in several earlier diverging species, representing evolutionary intermediates. Mapping these data onto an evolutionary tree suggests that this gene became extensively fragmented and scrambled over evolutionary time through a series of steps, each leading to greater complexity. Our results also suggest a possible mechanism for intron loss by deletion of intron sequences as DNA during development of the somatic nucleus.

The evolutionary origin of a complex scrambled gene.

Certaines esp&egrave;ces de cili&eacute;s subissent une &eacute;limination massive de l&#39;ADN et le g&eacute;nome r&eacute;arrangement pour construire la taille g&egrave;ne &laquo; chromosomes &raquo; dans leur noyau somatique. Un exemple est le g&egrave;ne alpha largement brouill&eacute; ADN polym&eacute;rase qui est divis&eacute; en 48 pi&egrave;ces et distribu&eacute; sur deux loci non-li&eacute;s &agrave; Stylonychia. Pour comprendre l&#39;&eacute;mergence de ce ph&eacute;nom&egrave;ne complex au cours de l&#39;&eacute;volution, nous avons examin&eacute; ADN polym&eacute;rase alpha g&egrave;nes chez plusieurs esp&egrave;ces pr&eacute;c&eacute;demment divergentes, repr&eacute;sentant des interm&eacute;diaires &eacute;volutives. Cartographie de ces donn&eacute;es &agrave; un arbre &eacute;volutionniste sugg&egrave;re que ce g&egrave;ne est devenu largement fragment&eacute; et brouill&eacute; au fil du temps &eacute;volutif gr&acirc;ce &agrave; une s&eacute;rie d&#39;&eacute;tapes, chacune conduisant &agrave; une plus grande complexit&eacute;. Nos r&eacute;sultats sugg&egrave;rent un m&eacute;canisme possible pour la perte de l&#39;intron par suppression de s&eacute;quences d&#39;intron comme l&#39;ADN au cours du d&eacute;veloppement du noyau somatique.

L&#39;origine &eacute;volutive d&#39;un g&egrave;ne brouill&eacute; complex.

Alcune specie di ciliati subiscono massiccia eliminazione di DNA e riarrangiamento del genoma per costruire gene-sized &quot;cromosomi&quot; nel loro nucleo somatico. Un esempio &egrave; il gene alfa ampiamente strapazzate DNA polimerasi che &egrave; divisa in 48 pezzi e distribuita su due loci non collegati in Stylonychia. Per capire l&#39;emergere di questo fenomeno complesso durante l&#39;evoluzione, abbiamo esaminato il DNA polimerasi alfa geni in diverse specie di precedenza divergenti che rappresenta evolutivi intermedi. Questi dati su un albero evolutivo di mappatura suggerisce che questo gene &egrave; diventato ampiamente frammentato e strapazzato nel tempo evolutivo attraverso una serie di passi, ciascuno che conduce ad una maggiore complessit&agrave;. Anche i nostri risultati suggeriscono un possibile meccanismo per la perdita dell&#39;introne dall&#39;eliminazione di sequenze introne come DNA durante lo sviluppo del nucleo somatico.

L&#39;origine evolutiva di un gene complesso strapazzato.

&#x66F4;&#x6709;&#x6548;&#x7684;&#x7597;&#x6CD5;&#x76EE;&#x524D;&#x8FEB;&#x5207;&#x9700;&#x8981;&#x5BF9;&#x4E19;&#x578B;&#x809D;&#x708E;&#x75C5;&#x6BD2; (HCV) &#x75C5;&#x6BD2;&#x6027;&#x809D;&#x708E;&#x7684;&#x4E3B;&#x8981;&#x539F;&#x56E0;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7528;&#x4E8E;&#x4F53;&#x5916;&#x86CB;&#x767D;&#x8868;&#x8FBE;&#x4E0E;&#x5FAE;&#x6D41;&#x63A7;&#x4EB2;&#x548C;&#x5206;&#x6790;&#x7814;&#x7A76; RNA &#x7ED1;&#x5B9A;&#x7531;&#x4E19;&#x578B;&#x809D;&#x708E;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8DE8;&#x819C;&#x86CB;&#x767D; NS4B &#x7684;&#x4E19;&#x578B;&#x809D;&#x708E;&#x75C5;&#x6BD2; RNA &#x590D;&#x5236;&#x4E2D;&#x53D1;&#x6325;&#x91CD;&#x8981;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5C55;&#x793A;&#x4E19;&#x578B;&#x809D;&#x708E;&#x75C5;&#x6BD2; NS4B &#x7ED1;&#x5B9A; RNA &#x4E0E;&#x6B64;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x662F;&#x5177;&#x4F53;&#x4E0E;&#x5927;&#x7EA6; 3.4 &#x89E3;&#x79BB;&#x5E38;&#x6570; &#xFF08;Kd&#xFF09; &#x7684;&#x75C5;&#x6BD2;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x7684;&#x8D1F;&#x9762;&#x7EDE;&#x7EBF;&#x603B;&#x7AD9; 3&#39; nM&#x3002;&#x590D;&#x5408;&#x56FE;&#x4E66;&#x9986;&#x7684;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x5FAE;&#x6D41;&#x63A7;&#x5C4F;&#x5E55;&#x786E;&#x5B9A;&#x5927;&#x5927;&#x6291;&#x5236; RNA &#x7531; NS4B &#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684; 18 &#x5316;&#x5408;&#x7269;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5316;&#x5408;&#x7269;&#xFF0C;&#x76D0;&#x9178;&#x6C2F;&#x54AA;&#x5511;&#x4E4B;&#x4E00;&#x88AB;&#x53D1;&#x73B0;&#x6291;&#x5236;&#x4E19;&#x578B;&#x809D;&#x708E;&#x75C5;&#x6BD2; RNA &#x590D;&#x5236;&#x4ECB;&#x5BFC; NS4B &#x7684; RNA &#x5177;&#x6709;&#x7EA6;&#x675F;&#x529B;&#xFF0C;&#x5176;&#x5236;&#x6B62;&#x5C0F;&#x6BD2;&#x6027;&#x5BF9;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x57F9;&#x517B;&#x4E2D;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x4EA7;&#x91CF;&#x4E19;&#x578B;&#x809D;&#x708E;&#x75C5;&#x6BD2;&#x7684;&#x751F;&#x547D;&#x5468;&#x671F;&#x65B0;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x548C;&#x533B;&#x836F;&#x7684;&#x53D1;&#x5C55;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E00;&#x79CD;&#x5019;&#x9009;&#x5316;&#x5408;&#x7269;&#x3002;

C &#x578B;&#x809D;&#x708E;&#x76EE;&#x6807;&#x548C;&#x5FAE;&#x6D41;&#x63A7;&#x4EB2;&#x548C;&#x5206;&#x6790;&#x5176;&#x836F;&#x7406;&#x4F5C;&#x7528;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x7684;&#x53D1;&#x73B0;&#x3002;

More effective therapies are urgently needed against hepatitis C virus (HCV), a major cause of viral hepatitis. We used in vitro protein expression and microfluidic affinity analysis to study RNA binding by the HCV transmembrane protein NS4B, which plays an essential role in HCV RNA replication. We show that HCV NS4B binds RNA and that this binding is specific for the 3' terminus of the negative strand of the viral genome with a dissociation constant (Kd) of approximately 3.4 nM. A high-throughput microfluidic screen of a compound library identified 18 compounds that substantially inhibited binding of RNA by NS4B. One of these compounds, clemizole hydrochloride, was found to inhibit HCV RNA replication in cell culture that was mediated by its suppression of NS4B's RNA binding, with little toxicity for the host cell. These results yield new insight into the HCV life cycle and provide a candidate compound for pharmaceutical development.

Discovery of a hepatitis C target and its pharmacological inhibitors by microfluidic affinity analysis.

Sont urgent de th&eacute;rapies plus efficaces contre le virus de l&#39;h&eacute;patite C (VHC), des principales causes des h&eacute;patites virales. Nous avons utilis&eacute; expression prot&eacute;ique in vitro et analyse des affinit&eacute;s microfluidique pour &eacute;tudier les ARN contraignante par la prot&eacute;ine transmembranaire VHC NS4B, qui joue un r&ocirc;le essentiel dans la r&eacute;plication de l&#39;ARN du VHC. Nous montrons que le VHC NS4B lie RNA et que cette liaison est sp&eacute;cifique pour l&#39;extr&eacute;mit&eacute; 3&#39; du brin n&eacute;gatif du g&eacute;nome viral avec une constante de dissociation (Kd) d&#39;environ 3,4 nM. Un &eacute;cran de microfluidique haut d&eacute;bit d&#39;une biblioth&egrave;que compos&eacute; identifi&eacute; 18 compos&eacute;s substantiellement inhibent la liaison de l&#39;ARN par NS4B. Un de ces compos&eacute;s, le chlorhydrate de clemizole, a &eacute;t&eacute; trouv&eacute; pour inhiber la r&eacute;plication de l&#39;ARN du VHC en culture cellulaire qui a &eacute;t&eacute; v&eacute;hicul&eacute;e par sa suppression de la liaison de RNA de NS4B, avec peu de toxicit&eacute; pour la cellule h&ocirc;te. Ces r&eacute;sultats donnent le nouvel aper&ccedil;u du cycle de vie du VHC et fournissent un compos&eacute; du candidat pour l&#39;&eacute;laboration du produit pharmaceutique.

D&eacute;couverte d&#39;une cible de l&#39;h&eacute;patite C et ses inhibiteurs pharmacologiques par analyse des affinit&eacute;s microfluidique.

Wirksamere Therapien sind vordringlich gegen Hepatitis C-Virus (HCV), eine der Hauptursachen f&uuml;r Virushepatitis. Wir haben in-vitro-Proteinexpression und mikrofluidische Affinit&auml;t Analyse RNA-Bindung durch die HCV-Transmembraneprotein NS4B, studieren die spielt eine wesentliche Rolle bei der HCV-RNA-Replikation. Wir zeigen, dass HCV NS4B RNA bindet und diese Bindung spezifisch f&uuml;r das 3&#39;-Terminus des Teilprogramms &quot;negativ&quot; des viralen Genoms mit einer Dissoziationskonstante (Kd) ca. 3.4 ist nM. Ein hohen Durchsatz mikrofluidische Bildschirm einer zusammengesetzten Bibliothek identifiziert 18 Verbindungen, die Bindung der RNA durch NS4B erheblich gehemmt. Eine dieser Verbindungen, Clemizole Hydrochlorid, wurde gefunden, HCV-RNA-Replikation in Zellkultur zu hemmen, die durch seine Unterdr&uuml;ckung der NS4Bs RNA-Bindung, mit wenig Toxizit&auml;t f&uuml;r die Wirtszelle vermittelt wurde. Diese Ergebnisse liefern neue Erkenntnisse &uuml;ber die HCV-Lebenszyklus und liefern eine Kandidaten-Verbindung f&uuml;r pharmazeutische Entwicklung.

Entdeckung einer Hepatitis-C-Ziel und seine pharmakologischen Inhibitoren mikrofluidische Affinit&auml;t Analyse.

Terapie pi&ugrave; efficaci sono urgentemente necessarie contro il virus dell&#39;epatite C (HCV), delle principali cause di epatite virale. Abbiamo usato l&#39;espressione della proteina in vitro e analisi di affinit&agrave; microfluidica per studiare RNA binding dalla proteina transmembrana HCV NS4B, che svolge un ruolo essenziale nella replica di HCV-RNA. Mostriamo che HCV NS4B associa RNA e che questa associazione &egrave; specifica per il terminale 3&#39; del filamento negativo del genoma virale con una costante di dissociazione (Kd) di circa 3,4 nM. Una schermata di microfluidica high-throughput di una libreria composta identificati 18 composti che sostanzialmente inibiscono il legame del RNA da NS4B. Uno di questi composti, clemizole cloridrato, &egrave; stato trovato per inibire la replicazione di HCV-RNA in coltura cellulare che &egrave; stato mediato dalla sua soppressione dell&#39;associazione RNA di NS4B, con poca tossicit&agrave; per la cellula ospite. Questi risultati resa nuova visione del ciclo di vita HCV e forniscono un composto candidato per lo sviluppo farmaceutico.

Individuazione di un target di epatite C e suoi inibitori farmacologici da analisi di affinit&agrave; microfluidica.

C &#x578B;&#x809D;&#x708E;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9; &#xFF08;HCV&#xFF09;&#x3001;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x6027;&#x809D;&#x708E;&#x306E;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x539F;&#x56E0;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057;&#x3066;&#x3088;&#x308A;&#x52B9;&#x679C;&#x7684;&#x306A;&#x6CBB;&#x7642;&#x6CD5;&#x304C;&#x6025;&#x52D9;&#x3067;&#x3059;&#x3002;C &#x578B;&#x809D;&#x708E;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E;&#x819C;&#x8CAB;&#x901A;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; HCV RNA &#x8907;&#x88FD;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x679C;&#x305F;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B; NS4B &#x306B;&#x3088;&#x308B; RNA &#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x52C9;&#x5F37;&#x3059;&#x308B; in vitro &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x3068;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x6D41;&#x4F53;&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x79C1;&#x9054;&#x306F; c &#x578B;&#x809D;&#x708E; NS4B RNA &#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3068;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x304C;&#x7D04; 3.4 &#x306E;&#x89E3;&#x96E2;&#x5B9A;&#x6570; &#xFF08;Kd&#xFF09; &#x3068;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306E;&#x8CA0;&#x306E;&#x9396;&#x306E; 3&#39; &#x672B;&#x7AEF;&#x306E;&#x7279;&#x5B9A;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3059; nM&#x3002;&#x5316;&#x5408;&#x7269;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x30FC;&#x306E;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8; &#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x6D41;&#x4F53;&#x306E;&#x753B;&#x9762;&#x306F;&#x5B9F;&#x8CEA;&#x7684;&#x306B; NS4B &#x306B;&#x3088;&#x308B; RNA &#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x963B;&#x5BB3;&#x3057;&#x305F; 18 &#x306E;&#x5316;&#x5408;&#x7269;&#x3092;&#x540C;&#x5B9A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5316;&#x5408;&#x7269;&#x3001;clemizole &#x5869;&#x9178;&#x5869;&#x306E; 1 &#x3064;&#x305D;&#x306E; NS4B &#x306E; RNA &#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x6291;&#x5236;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x6BD2;&#x6027;&#x3068;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x57F9;&#x990A;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B; c &#x578B;&#x809D;&#x708E;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9; RNA &#x8907;&#x88FD;&#x3092;&#x7981;&#x3058;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x308F;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;HCV &#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D5; &#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x306B;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x529B;&#x3092;&#x3082;&#x305F;&#x3089;&#x3059;&#x3001;&#x533B;&#x85AC;&#x54C1;&#x958B;&#x767A;&#x5019;&#x88DC;&#x5316;&#x5408;&#x7269;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

C &#x578B;&#x809D;&#x708E;&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x85AC;&#x7406;&#x5B66;&#x7684;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x6D41;&#x4F53;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x5206;&#x6790;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x306E;&#x767A;&#x898B;&#x3002;

&#xB354; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC778; &#xCE58;&#xB8CC; C &#xD615; &#xAC04;&#xC5FC; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; (HCV), &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; &#xAC04;&#xC5FC;&#xC758; &#xC8FC;&#xC694; &#xC6D0;&#xC778;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAE34;&#xAE09; &#xD558; &#xAC8C; &#xD544;&#xC694; &#xD558;&#xB2E4;. HCV &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; HCV RNA &#xBCF5;&#xC81C;&#xC5D0; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xD558;&#xB294; ns4b&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; RNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xACF5;&#xBD80;&#xB97C; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBC1C;&#xD604; &#xBC0F; &#xBBF8;&#xC138; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; HCV NS4B RNA &#xACB0;&#xC18D;&#xC774; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC740; &#xC57D; 3.4&#xC758; &#xBD84;&#xB9AC; &#xC0C1;&#xC218; (Kd)&#xC640; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; &#xAC8C;&#xB188;&#xC758; &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xAC00;&#xB2E5;&#xC758; 3&#39; &#xB9D0;&#xB2E8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD2B9;&#xC815; &#xD45C;&#xC2DC; nM. &#xD654;&#xD569;&#xBB3C; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xC2A4;&#xB8E8;&#xD48B; &#xBBF8;&#xC138; &#xC2A4;&#xD06C;&#xB9B0; &#xC2E4;&#xC9C8;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; ns4b&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; RNA&#xC758; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC744; &#xC5B5;&#xC81C; 18 &#xD654;&#xD569;&#xBB3C; &#xBC1C;&#xACAC;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xD654;&#xD569;&#xBB3C;, clemizole &#xC5FC; &#xC911; HCV RNA &#xBCF5;&#xC81C; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xC140;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC791;&#xC740; &#xB3C5;&#xC131;&#xACFC; ns4b&#xC758; RNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC758; &#xADF8;&#xAC83;&#xC758; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC911;&#xC7AC; &#xB41C; &#xC138;&#xD3EC; &#xBC30;&#xC591;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC744; &#xC5B5;&#xC81C; &#xBC1C;&#xACAC; &#xB410;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; HCV &#xB77C;&#xC774;&#xD504; &#xC0AC;&#xC774;&#xD074;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xC5BB;&#xC744; &#xD558; &#xACE0; &#xC81C;&#xC57D; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD6C4;&#xBCF4; &#xD654;&#xD569;&#xBB3C;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

C &#xD615; &#xAC04;&#xC5FC; &#xB300;&#xC0C1;&#xACFC; &#xACB0;&#xD569; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xADF8; &#xC57D;&#xB9AC; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C;&#xC758; &#xBC1C;&#xACAC;.

Terapias m&aacute;s efectivas se necesitan urgentemente contra el virus de la hepatitis C (VHC), una de las principales causas de la hepatitis viral. Utilizamos microflu&iacute;dicos afinidad an&aacute;lisis y expresi&oacute;n de la prote&iacute;na in vitro para estudiar la Uni&oacute;n de la RNA por la prote&iacute;na transmembrana de HCV NS4B, que desempe&ntilde;a un papel esencial en la replicaci&oacute;n del ARN de VHC. Mostramos que el VHC NS4B une RNA y que este enlace es espec&iacute;fico para la terminal 3&#39; de la hebra negativa del genoma viral con una constante de disociaci&oacute;n (Kd) de aproximadamente 3,4 nM. Una pantalla de alto rendimiento microflu&iacute;dicos de una biblioteca compuesta hab&iacute;a identificado 18 compuestos que substancialmente inhibici&oacute;n la Uni&oacute;n de ARN por NS4B. Uno de estos compuestos, clorhidrato de clemizole, fue encontrado para inhibir la replicaci&oacute;n del ARN del VHC en cultivo celular que fue mediada por su supresi&oacute;n de atascamiento de RNA de NS4B, con poca toxicidad de la c&eacute;lula hu&eacute;sped. Estos resultados rendimiento nueva penetraci&oacute;n en el ciclo de vida del VHC y preven un candidato compuesto de desarrollo farmac&eacute;utico.

Descubrimiento de un objetivo de hepatitis C y sus inhibidores farmacol&oacute;gicos por an&aacute;lisis de afinidad de microfluidos.

Hepatitis C Virus (HCV) is a leading cause of liver disease and represents a significant public health challenge. Treatments for this disease are inadequate and improved antiviral therapies are necessary. Several such antivirals are in development, most of which target the well-characterized NS3 protease or the NS5B polymerase. In contrast, the nonstructural 4B (NS4B) protein, though essential for HCV RNA replication, has been the subject of few pharmacological studies. One of the functions ascribed to this protein is the ability to form intracellular membrane-associated foci (MAF), which are believed to be related to the sites of viral replication. Here, we report the identification of a small molecule that inhibits HCV replication and disrupts the organization of these MAF. Genetic analysis links the compound's mode of action to the NS4B gene product, and transient transfections of NS4B-GFP demonstrate that treatment with this compound can lead to the formation of novel elongated assemblies of NS4B. Furthermore, an in vitro dynamic light scattering assay provides evidence that the second amphipathic helix of NS4B may be the target of the drug. Our results demonstrate that this molecule represents a new potential class of HCV inhibitors and also provides us with a useful tool for studying the HCV life cycle.

A small molecule inhibits HCV replication and alters NS4B's subcellular distribution.

Virus de l&#39;h&eacute;patite C (VHC) est des principales causes de maladie h&eacute;patique et repr&eacute;sente un d&eacute;fi important pour la sant&eacute; publique. Traitements pour cette maladie sont insuffisantes et l&#39;am&eacute;lioration des traitements antiviraux sont n&eacute;cessaires. Plusieurs de ces antiviraux est en d&eacute;veloppement, dont la plupart visent la prot&eacute;ase NS3 bien caract&eacute;ris&eacute;e ou la polym&eacute;rase NS5B. En revanche, les 4 b non structurales (NS4B) prot&eacute;ine, bien qu&#39;essentielle pour la r&eacute;plication de l&#39;ARN du VHC, a fait l&#39;objet de peu d&#39;&eacute;tudes pharmacologiques. Parmi les fonctions attribu&eacute;es &agrave; cette prot&eacute;ine est la capacit&eacute; de forme intracellulaire associ&eacute;e &agrave; la membrane foyers (MAF), qui sont soup&ccedil;onn&eacute;s d&#39;&ecirc;tre li&eacute;s aux sites de r&eacute;plication virale. Nous rapportons ici l&#39;identification d&#39;une petite mol&eacute;cule qui inhibe la r&eacute;plication du VHC et perturbe l&#39;organisation de ces CRG. Analyse g&eacute;n&eacute;tique des liens mode du compos&eacute; d&#39;action vers le produit du g&egrave;ne NS4B et transitoires transfections de NS4B-GFP d&eacute;montrent que le traitement avec ce compos&eacute; peut conduire &agrave; la formation de nouveaux assemblys allong&eacute;es de NS4B. En outre, un test in vitro diffusion dynamique de la lumi&egrave;re prouve que la deuxi&egrave;me h&eacute;lice amphipathique de NS4B peut &ecirc;tre la cible de la drogue. Nos r&eacute;sultats d&eacute;montrent que cette mol&eacute;cule repr&eacute;sente une nouvelle classe de potentielle d&#39;inhibiteurs du VHC et nous fournit aussi un outil utile pour &eacute;tudier le cycle de vie du VHC.

Une petite mol&eacute;cule inhibe la r&eacute;plication du VHC et alt&egrave;re la distribution subcellulaire de NS4B.

Virus dell&#39;epatite C (HCV) &egrave; delle principali cause di malattia epatica e rappresenta una sfida significativa di sanit&agrave; pubblica. Trattamenti per questa malattia sono inadeguate e migliorate le terapie antivirali sono necessarie. Parecchi tali farmaci antivirali sono in via di sviluppo, la maggior parte dei quali target ben caratterizzata NS3 proteasi o la polimerasi NS5B. In contrasto, il 4B non strutturali della proteina (NS4B), anche se indispensabile per la replicazione di HCV-RNA, &egrave; stata oggetto di pochi studi farmacologici. Una delle funzioni attribuite a questa proteina &egrave; la capacit&agrave; di forma intracellulare membrana associato foci (MAF), che sono ritenute legate ai siti di replicazione virale. Riportiamo l&#39;identificazione di una piccola molecola che inibisce la replicazione di HCV e sconvolge l&#39;organizzazione di questi MAF. Analisi genetica collegamenti modalit&agrave; del complesso di azione per il prodotto del gene NS4B e transfezioni transienti di NS4B-GFP dimostrano che il trattamento con questo composto pu&ograve; portare alla formazione di nuovi assembly allungata di NS4B. Inoltre, un test in vitro diffusione dinamica della luce fornisce la prova che la seconda elica amphipathic di NS4B possa essere bersaglio del farmaco. I nostri risultati dimostrano che questa molecola rappresenta una nuova classe di potenziale degli inibitori HCV e ci fornisce anche un utile strumento per lo studio del ciclo di vita HCV.

Una piccola molecola inibisce la replicazione di HCV e altera la distribuzione sottocellulare di NS4B.

Exhaustion of CD8(+) T cells and upregulation of programmed death 1 (PD-1), a negative regulator of T cell activation, are characteristic features of individuals chronically infected with human immunodeficiency virus type 1. In a previous study, we showed in mice that a dendritic cell-directed lentiviral vector (DCLV) system encoding the human immunodeficiency virus (HIV)-1 Gag protein was an efficient vaccine modality to induce a durable Gag-specific T cell immune response. In this study, we demonstrate that blocking of the PD-1/PD-1 ligand (PD-L) inhibitory signal via an anti-PD-L1 antibody generated an enhanced HIV-1 Gag-specific CD8(+) immune response following both a single round of DCLV immunization and a homologous prime/boost regimen. The prime/boost regimen combined with PD-L1 blockade generated very high levels of Gag-specific CD8(+) T cells comprising several valuable features: improved ability to produce multiple cytokines, responding to a broader range of Gag-derived epitopes, and long-lasting memory. This enhanced cellular immune response generated by DCLV immunization combined with anti-PD-L1 blockade correlated with improved viral control following challenge with Gag-expressing vaccinia virus. Taken together, our studies offer evidence to support the use of PD-1/PD-L1 blockade as an adjuvant modality to enhance antigen-specific immune responses elicited by T cell-based immunizations such as DCLV.

PD-1/PD-L1 blockade can enhance HIV-1 Gag-specific T cell immunity elicited by dendritic cell-directed lentiviral vaccines.

&Eacute;puisement des cellules T CD8 et upregulation de mort programm&eacute;e 1 (PD-1), un r&eacute;gulateur n&eacute;gatif de l&#39;activation des cellules T, sont caract&eacute;ristiques des personnes chroniquement infect&eacute;es par le virus de l&#39;immunod&eacute;ficience humaine de type 1. Dans une &eacute;tude pr&eacute;c&eacute;dente, nous avons montr&eacute; chez la souris qui a un syst&egrave;me de vecteur lentiviral ax&eacute;s sur les cellules dendritiques (DCLV) codant le virus d&#39;immunod&eacute;ficience humaine (VIH) -1 Gag prot&eacute;ine est une modalit&eacute; de vaccin efficace pour induire une durable Gag sp&eacute;cifique des lymphocytes T immuno-r&eacute;action. Dans cette &eacute;tude, nous d&eacute;montrons que le blocage du signal inhibiteur ligand (PD-L) PD-1/PD-1 par un anticorps anti-PD-L1 g&eacute;n&eacute;r&eacute; une r&eacute;ponse immunitaire accrue de CD8 sp&eacute;cifiques Gag VIH-1 suite &agrave; un seul tour de vaccination DCLV tant un r&eacute;gime homologue premier/boost. Le r&eacute;gime de premier/Pouss&eacute;e combin&eacute; avec PD-L1 blocus g&eacute;n&eacute;r&eacute; des niveaux tr&egrave;s &eacute;lev&eacute;s de cellules T CD8 sp&eacute;cifiques Gag comprenant plusieurs fonctions utiles : am&eacute;liorer la capacit&eacute; &agrave; produire des cytokines multiples, r&eacute;pondant &agrave; une plus larges gamme de Gag d&eacute;riv&eacute;s &eacute;pitopes et longue m&eacute;moire. Cette r&eacute;ponse d&#39;immunitaire cellulaire am&eacute;lior&eacute;e obtenue par immunisation DCLV combin&eacute;e avec blocage anti-PD-L1 en corr&eacute;lation avec le meilleur contr&ocirc;le viral suite challenge avec le virus de la vaccine exprimant le Gag. Pris ensemble, nos &eacute;tudes offrent des &eacute;l&eacute;ments de preuve &agrave; l&#39;appui de l&#39;utilisation de PD-1/PD-L1 blocus comme une modalit&eacute; de traitement adjuvant pour am&eacute;liorer l&#39;antig&egrave;ne-sp&eacute;cifiques des r&eacute;ponses immunitaires induites par les vaccinations ax&eacute;e sur les lymphocytes T comme DCLV.

PD-1/PD-L1 blocus peut renforcer l&#39;immunit&eacute; de lymphocytes T Gag-sp&eacute;cifique au VIH-1 a suscit&eacute; par les vaccins des g&egrave;nes ax&eacute;s sur les cellules dendritiques.

Esaurimento delle cellule cellule T e sovraregolazione di morte programmata 1 (PD-1), un regolatore negativo di attivazione delle cellule T, sono caratteristici degli individui cronicamente infettati da virus dell&#39;immunodeficienza umana di tipo 1. In un precedente studio, abbiamo dimostrato in topi che un sistema vettore lentivirale diretto delle cellule dendritiche (DCLV) codifica il virus dell&#39;immunodeficienza umana (HIV) -1 Gag della proteina &egrave; stata una modalit&agrave; efficace vaccino per indurre una durevole risposta immunitaria di Gag-specifiche delle cellule T. In questo studio dimostriamo che il blocco del segnale inibitorio PD-1/PD-1 ligando (PD-L) tramite un anticorpo anti-PD-L1 generato una maggiore risposta immunitaria Gag-specifici dell&#39;HIV-1 cellule dopo un singolo ciclo di immunizzazione DCLV sia un regime omologo primo/Spinta. Il regime di primo/Spinta combinata con blocco PD-L1 generato livelli molto elevati di cellule Gag specifiche cellule T che comprende molte caratteristiche importanti: migliorata la capacit&agrave; di produrre citochine multiple, rispondendo a una pi&ugrave; ampi gamma di Gag-derivato epitopi e memoria di lunga durata. Questa maggiore risposta immunitaria cellulare generata dall&#39;immunizzazione DCLV combinato con blocco anti-PD-L1 correlato con migliorato controllo virale dopo sfida con virus di vaccinia esprimendo Gag. Presi insieme, i nostri studi offrono prove per sostenere l&#39;uso del PD-1/PD-L1 blocco come una modalit&agrave; adiuvante per migliorare la risposta immunitaria antigene-specifiche hanno suscitato da vaccinazioni T cell-based come DCLV.

PD-1/PD-L1 blocco pu&ograve; aumentano Gag-specifici dell&#39;HIV-1 delle cellule T immunit&agrave; elicitato da dendritiche vaccini lentivirali diretto delle cellule.

Article	Year
The evolutionary origin of a complex scrambled gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 16217011	2005
Discovery of a hepatitis C target and its pharmacological inhibitors by microfluidic affinity analysis. Nature biotechnology\| PubMed ID: 18758449	2008
A small molecule inhibits HCV replication and alters NS4B's subcellular distribution. Antiviral research\| PubMed ID: 20363257	2010
PD-1/PD-L1 blockade can enhance HIV-1 Gag-specific T cell immunity elicited by dendritic cell-directed lentiviral vaccines. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy\| PubMed ID: 22588271	2012

Paul D. Bryson

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