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CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

University of Minnesota

&#x4E00;&#x4E2A;&#x76F4;&#x63A5;&#x94FE;&#x63A5;&#x5230;&#x764C;&#x75C7;&#x3001; &#x8001;&#x5316;&#x3001; &#x548C;&#x9057;&#x4F20;&#x75BE;&#x75C5;&#x4EE5;&#x53CA;&#x764C;&#x75C7;&#x6CBB;&#x7597;&#x4E2D;&#x7684;&#x5173;&#x952E;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF0C;DNA &#x635F;&#x4F24;&#x7684;&#x91CD;&#x8981;&#x6027;&#x662F;&#x884C;&#x4E4B;&#x6709;&#x6548;&#x7684;&#x3002;&#x4ECE;&#x6D41;&#x884C;&#x75C5;&#x5B66;&#x5230;&#x836F;&#x7269;&#x5F00;&#x53D1;&#x7684;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x4E2D;&#x7684; DNA &#x635F;&#x4F24;&#x7684;&#x6D53;&#x539A;&#x5174;&#x8DA3;&#x9A71;&#x52A8;&#x5668;&#x4E3A;&#x5F3A;&#x5065;&#x3001; &#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#xFF0C;&#x8FEB;&#x5207;&#x9700;&#x8981;&#x548C;&#x5BA2;&#x89C2;&#x3001; &#x5B9A;&#x91CF; DNA &#x635F;&#x4F24;&#x5206;&#x6790;&#x7684;&#x5EC9;&#x4EF7;&#x5DE5;&#x5177;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x7ECF;&#x5F00;&#x53D1;&#x7684;&#x9AD8;&#x901A;&#x91CF; DNA &#x635F;&#x4F24;&#x6D4B;&#x91CF;&#x7684;&#x7B80;&#x5355;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x591A;&#x4E2A;&#x75C5;&#x53D8;&#x548C;&#x8DEF;&#x5F84;&#x4FE1;&#x606F;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5229;&#x7528;&#x5355;&#x4E2A;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6355;&#x83B7;&#x7684;&#x91CD;&#x529B;&#x6210;&#x5FAE;&#x5B54;&#x9635;&#x5217;&#x4E0E;&#x51DD;&#x80F6;&#x7535;&#x6CF3;&#x5F62;&#x6001;&#x4E0A;&#x53D1;&#x73B0;&#x7684; DNA &#x635F;&#x4F24;&#x3002;&#x7A7A;&#x95F4;&#x7F16;&#x7801;&#x53EF;&#x4EE5;&#x540C;&#x65F6;&#x68C0;&#x6D4B;&#x591A;&#x4E2A;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x6761;&#x4EF6;&#x5B8C;&#x5168;&#x81EA;&#x52A8;&#x5316;&#x5206;&#x6790;&#x4E0E;&#x5E76;&#x884C;&#x6267;&#x884C;&#x7684;&#x3002;&#x6B64;&#x65B9;&#x6CD5;&#x8FD8;&#x4F7F;&#x65B0;&#x578B;&#x529F;&#x80FD;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x6807;&#x8BB0;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5E76;&#x884C;&#x7684;&#x5355;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA; DNA &#x635F;&#x4F24;&#x6D4B;&#x91CF;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x96C6;&#x6599;&#x4E2D;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FD8;&#x5F00;&#x53D1;&#x4E86; 24 &#x548C; 96 &#x4E95;&#x7248;&#x672C;&#xFF0C;&#x9002;&#x7528;&#x4E8E;&#x9AD8;&#x901A;&#x91CF;&#x7B5B;&#x9009;&#x7684;&#x3002;&#x4F7F;&#x7528;&#x8FD9;&#x4E2A;&#x5E73;&#x53F0;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x6709;&#x91CF;&#x5316;&#x4E0D;&#x540C;&#x9057;&#x4F20;&#x80CC;&#x666F;&#x7684;&#x4E2A;&#x4EBA; DNA &#x4FEE;&#x590D;&#x80FD;&#x529B;&#x548C;&#x6BD4;&#x8F83;&#x6F5C;&#x5728;&#x764C;&#x75C7;&#x5316;&#x7597;&#x836F;&#x7269;&#x7684;&#x7597;&#x6548;&#xFF0C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x7684;&#x4E00;&#x79CD;&#x5173;&#x952E;&#x7684; DNA &#x4FEE;&#x590D;&#x9176;&#xFF0C;&#x4EBA;&#x7C7B; AP &#x6838;&#x9178;&#x5185;&#x5207;&#x9176;&#x3002;&#x6B64;&#x5E73;&#x53F0;&#x4F7F;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x8BC4;&#x4F30;&#x591A;&#x4E2A; DNA &#x4FEE;&#x590D;&#x9014;&#x5F84;&#x548C; subpathways &#x5E76;&#x884C;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x4F7F;&#x836F;&#x7269;&#x53D1;&#x73B0;&#x3001; &#x9057;&#x4F20;&#x6BD2;&#x6027;&#x8BD5;&#x9A8C;&#x548C;&#x73AF;&#x5883;&#x536B;&#x751F;&#x7684;&#x65B0;&#x6218;&#x7565;&#x3002;

&#x5355;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x9677;&#x5370;&#x548C; DNA &#x635F;&#x4F24;&#x5206;&#x6790;&#x4F7F;&#x7528;&#x5FAE;&#x5B54;&#x9635;&#x5217;&#x3002;

With a direct link to cancer, aging, and heritable diseases as well as a critical role in cancer treatment, the importance of DNA damage is well-established. The intense interest in DNA damage in applications ranging from epidemiology to drug development drives an urgent need for robust, high throughput, and inexpensive tools for objective, quantitative DNA damage analysis. We have developed a simple method for high throughput DNA damage measurements that provides information on multiple lesions and pathways. Our method utilizes single cells captured by gravity into a microwell array with DNA damage revealed morphologically by gel electrophoresis. Spatial encoding enables simultaneous assays of multiple experimental conditions performed in parallel with fully automated analysis. This method also enables novel functionalities, including multiplexed labeling for parallel single cell assays, as well as DNA damage measurement in cell aggregates. We have also developed 24- and 96-well versions, which are applicable to high throughput screening. Using this platform, we have quantified DNA repair capacities of individuals with different genetic backgrounds, and compared the efficacy of potential cancer chemotherapeutics as inhibitors of a critical DNA repair enzyme, human AP endonuclease. This platform enables high throughput assessment of multiple DNA repair pathways and subpathways in parallel, thus enabling new strategies for drug discovery, genotoxicity testing, and environmental health.

Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays.

Avec un lien direct vers le cancer, le vieillissement et les maladies h&#xE9;r&#xE9;ditaires ainsi que d&#x26;#39;un r&#xF4;le critique dans le traitement du cancer, l&#x26;#39;importance de dommages &#xE0; l&#x26;#39;ADN est bien &#xE9;tabli. Le vif int&#xE9;r&#xEA;t dans les l&#xE9;sions de l&#x26;#39;ADN dans des applications allant de l&#x26;#39;&#xE9;pid&#xE9;miologie au d&#xE9;veloppement de m&#xE9;dicaments entra&#xEE;ne un besoin urgent de robustesse, un d&#xE9;bit &#xE9;lev&#xE9;, et des outils peu co&#xFB;teux pour objectif, analyse de l&#x26;#39;ADN des dommages quantitative. Nous avons d&#xE9;velopp&#xE9; une m&#xE9;thode simple pour des mesures &#xE0; haut d&#xE9;bit dommages &#xE0; l&#x26;#39;ADN qui fournit des informations sur les l&#xE9;sions multiples et les voies. Le proc&#xE9;d&#xE9; utilise des cellules individuelles captur&#xE9;es par gravit&#xE9; dans une matrice de micropuits avec alt&#xE9;ration de l&#x26;#39;ADN montr&#xE9; morphologiquement par &#xE9;lectrophor&#xE8;se sur gel. Codage spatial permet dosages simultan&#xE9;s de plusieurs conditions exp&#xE9;rimentales r&#xE9;alis&#xE9;es en parall&#xE8;le avec l&#x26;#39;analyse enti&#xE8;rement automatis&#xE9;e. Cette m&#xE9;thode permet &#xE9;galement de nouvelles fonctionnalit&#xE9;s, y compris l&#x26;#39;&#xE9;tiquetage multiplex&#xE9; pour des essais parall&#xE8;les de cellules uniques, ainsi que la mesure dommages &#xE0; l&#x26;#39;ADN dans les agr&#xE9;gats de cellules. Nous avons &#xE9;galement d&#xE9;velopp&#xE9; 24 - et les versions 96-puits, qui sont applicables &#xE0; criblage &#xE0; haut d&#xE9;bit. Gr&#xE2;ce &#xE0; cette plateforme, nous avons quantifi&#xE9; les capacit&#xE9;s de r&#xE9;paration de l&#x26;#39;ADN des individus de diff&#xE9;rentes origines g&#xE9;n&#xE9;tiques, et a compar&#xE9; l&#x26;#39;efficacit&#xE9; des agents chimioth&#xE9;rapeutiques anticanc&#xE9;reux potentiels que les inhibiteurs d&#x26;#39;une enzyme essentielle r&#xE9;paration de l&#x26;#39;ADN, une endonucl&#xE9;ase AP humaine. Cette plate-forme permet d&#x26;#39;&#xE9;valuer le d&#xE9;bit &#xE9;lev&#xE9; de multiples voies de r&#xE9;paration de l&#x26;#39;ADN et subpathways en parall&#xE8;le, permettant ainsi &#xE0; de nouvelles strat&#xE9;gies pour la d&#xE9;couverte de m&#xE9;dicaments, de tests de g&#xE9;notoxicit&#xE9;, et de la sant&#xE9; environnementale.

Le pi&#xE9;geage seule cellule et Analyse des dommages d&#x26;#39;ADN en utilisant des tableaux de micropuits

Con un enlace directo con el c&#xE1;ncer, el envejecimiento y las enfermedades hereditarias, as&#xED; como un papel cr&#xED;tico en el tratamiento del c&#xE1;ncer, la importancia de da&#xF1;o en el DNA est&#xE1; bien establecido. El intenso inter&#xE9;s en el da&#xF1;o del ADN en aplicaciones que van desde la epidemiolog&#xED;a para el desarrollo de drogas lleva a una necesidad urgente para un rendimiento robusto, alto, y herramientas de bajo costo para el an&#xE1;lisis objetivo, cuantitativo da&#xF1;o en el ADN. Hemos desarrollado un m&#xE9;todo simple para la medici&#xF3;n de alto rendimiento da&#xF1;o en el DNA que facilitan informaci&#xF3;n sobre las lesiones m&#xFA;ltiples y las v&#xED;as. Nuestro m&#xE9;todo utiliza c&#xE9;lulas individuales capturados por la gravedad en una matriz de micropocillos con da&#xF1;o en el DNA revel&#xF3; morfol&#xF3;gicamente por electroforesis en gel. Codificaci&#xF3;n espacial permite ensayos simult&#xE1;neos de m&#xFA;ltiples condiciones experimentales se realizan en paralelo con el an&#xE1;lisis totalmente automatizado. Este m&#xE9;todo tambi&#xE9;n permite nuevas funcionalidades, incluyendo el etiquetado multiplexado para ensayos paralelos de c&#xE9;lulas individuales, as&#xED; como la medici&#xF3;n da&#xF1;o en el DNA en los agregados de c&#xE9;lulas. Tambi&#xE9;n hemos desarrollado 24 - y las versiones de 96 pozos, que son aplicables a la selecci&#xF3;n de alto rendimiento. Utilizando esta plataforma, hemos cuantificado la capacidad de reparaci&#xF3;n del ADN de los individuos con diferentes antecedentes gen&#xE9;ticos, y se compar&#xF3; la eficacia de la quimioterapia del c&#xE1;ncer como inhibidores potenciales de una reparaci&#xF3;n cr&#xED;tica enzima ADN, humanos endonucleasa AP. Esta plataforma permite la evaluaci&#xF3;n de alto rendimiento de m&#xFA;ltiples v&#xED;as de reparaci&#xF3;n del ADN y subpathways en paralelo, lo que permite nuevas estrategias para el descubrimiento de f&#xE1;rmacos, pruebas de genotoxicidad, y salud ambiental.

El reventado de los organismos unicelulares y An&#xE1;lisis de da&#xF1;os en el ADN utilizando matrices de micropocillos

Mit einem direkten Link zu Krebs, Alterung, und vererbbare Krankheiten sowie eine entscheidende Rolle in der Krebstherapie ist die Bedeutung der DNA-Sch&auml;digung etabliert. Das intensive Interesse an DNA-Sch&auml;den in Anwendungen von Epidemiologie bis hin zu Medikamentenentwicklung treibt ein dringender Bedarf f&uuml;r robust, hoher Durchsatz und kosteng&uuml;nstige Werkzeuge f&uuml;r Objektive, quantitative Analyse der DNA-Sch&auml;den. Wir haben eine einfache Methode f&uuml;r Hochdurchsatz-DNA-Schaden-Messungen entwickelt, die mehrere L&auml;sionen und Wege informiert. Unsere Methode nutzt Einzelzellen gefangen durch die Schwerkraft in eine Microwell-Array mit DNA-Sch&auml;den, die morphologisch durch Gelelektrophorese offenbart. R&auml;umliche Kodierung erm&ouml;glicht gleichzeitige Proben mehrerer experimentellen Bedingungen, die parallel zur vollautomatischen Analyse durchgef&uuml;hrt. Diese Methode erm&ouml;glicht auch neuartige Funktionen, einschlie&szlig;lich Multiplex labeling f&uuml;r parallele Einzelzelle Proben, als auch DNA-Sch&auml;den-Messung in Zelle Aggregate. Wir haben auch 24 und 96-Well-Versionen entwickelt, die f&uuml;r Hochdurchsatz-Screening gelten. Wir haben mit Hilfe dieser Plattform, DNA-Reparatur-Kapazit&auml;ten von Einzelpersonen mit unterschiedlichen genetischen Hintergr&uuml;nden zu quantifizieren und verglichen die Wirksamkeit von potenziellen Krebs Chemotherapeutika, wie eine kritische DNA-Inhibitoren Enzym, menschliche AP-Endonuklease reparieren. Diese Plattform erm&ouml;glicht hohen Durchsatz Beurteilung mehrerer DNA-Reparatur-Wege und Subpathways parallel, wodurch sich neue Strategien f&uuml;r Drogeentdeckung, Gentoxizit&auml;t und Umwelt und Gesundheit.

Einzelne Zelle &Uuml;berf&uuml;llung und DNA-Schaden-Analyse mithilfe von Microwell-Arrays.

Con un link diretto al cancro, invecchiamento e malattie ereditarie, cos&igrave; come un ruolo fondamentale nel trattamento del cancro, l&#39;importanza del danno al DNA &egrave; ben consolidata. L&#39;intenso interesse in danni del DNA in applicazioni che vanno dalla epidemiologia per lo sviluppo di farmaci spinge un urgente bisogno di robusta, alta produttivit&agrave; e strumenti economici per obiettivo, analisi quantitativa di danni del DNA. Abbiamo sviluppato un metodo semplice per le misure di danni del DNA ad alto rendimento che fornisce informazioni sulle lesioni multiple e percorsi. Il nostro metodo utilizza le singole cellule, catturate dalla forza di gravit&agrave; in una matrice microtiter con danni del DNA ha rivelato morfologicamente tramite elettroforesi del gel. Codifica spaziale consente l&#39;analisi simultanee di pi&ugrave; condizioni sperimentali eseguite in parallelo con analisi completamente automatizzata. Questo metodo consente inoltre di funzionalit&agrave; di romanzo, compreso contrassegno multiplex per dosaggi parallelo singola cella, come misura di danni del DNA in aggregati cellulari. Abbiamo anche sviluppato le versioni 24 e 96 pozzetti, che sono applicabili per lo screening high throughput. Usando questa piattaforma, abbiamo quantificato la capacit&agrave; di riparazione del DNA di individui con diversi background genetico e confrontato l&#39;efficacia di potenziali chemioterapici cancro come inibitori di un critico del DNA di riparazione enzima umano endonucleasi di AP. Questa piattaforma permette di valutazione high throughput di pi&ugrave; percorsi di riparazione del DNA e subpathways in parallelo, consentendo in tal modo nuove strategie per la scoperta della droga, test di genotossicit&agrave; e salute ambientale.

Singola cella dell&#39;abbondanza e analisi di danni del DNA utilizzando micropozzetti matrici.

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&#xC554;, &#xB178;&#xD654;, &#xC0C1;&#xC18D; &#xAC00;&#xB2A5; &#xC9C8;&#xD658; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xC554; &#xCE58;&#xB8CC;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xC9C1;&#xC811; &#xB9C1;&#xD06C;, DNA &#xC190;&#xC0C1;&#xC758; &#xC911;&#xC694;&#xC131;&#xC740; &#xC798;. &#xC5ED;&#xD559;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2E0;&#xC57D; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xAE4C;&#xC9C0; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC5B4;&#xD50C;&#xB9AC;&#xCF00;&#xC774;&#xC158;&#xC5D0;&#xC11C; DNA &#xC190;&#xC0C1;&#xC5D0; &#xAC15;&#xB82C;&#xD55C; &#xAD00;&#xC2EC; &#xAC15;&#xB825; &#xD558; &#xACE0; &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAE34;&#xAE09; &#xD55C; &#xD544;&#xC694; &#xBC0F; &#xBAA9;&#xD45C;, &#xC591;&#xC801; DNA &#xC190;&#xC0C1; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC800;&#xB834; &#xD55C; &#xB3C4;&#xAD6C; &#xB4DC;&#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;. &#xC5EC;&#xB7EC; &#xBCD1; &#xBCC0; &#xBC0F; &#xACBD;&#xB85C; &#xC815;&#xBCF4;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xB294; &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; DNA &#xC190;&#xC0C1; &#xCE21;&#xC815;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xAC04;&#xB2E8;&#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; DNA &#xC190;&#xC0C1;&#xC744; &#xD615;&#xD0DC;&#xD559; &#xC824; &#xC804;&#xAE30; &#xC774;&#xB3D9; &#xBC95;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xACF5;&#xAC1C; &#xB41C; microwell &#xBC30;&#xC5F4;&#xC5D0; &#xC911;&#xB825;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xCEA1;&#xCC98;&#xB41C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC140;&#xC744; &#xC774;&#xC6A9; &#xD55C;&#xB2E4;. &#xACF5;&#xAC04; &#xC778;&#xCF54;&#xB529; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC870;&#xAC74; &#xC644;&#xC804; &#xC790;&#xB3D9;&#xD654; &#xB41C; &#xBD84;&#xC11D; &#xBCD1;&#xD589;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC218;&#xD589;&#xC758; &#xB3D9;&#xC2DC; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB294; &#xB610;&#xD55C; &#xC140; &#xC9D1;&#xACC4;&#xC5D0;&#xC11C; DNA &#xC190;&#xC0C1; &#xCE21;&#xC815; &#xBC0F; &#xBCD1;&#xB82C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC138;&#xD3EC; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB2E4;&#xC911;&#xD654; &#xB41C; &#xB77C;&#xBCA8;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xB610;&#xD55C; &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; &#xC2EC;&#xC0AC;&#xC5D0; &#xC801;&#xC6A9; &#xB418;&#xB294; 24 &#xBC0F; 96 &#xC6B0;&#xBB3C; &#xBC84;&#xC804;&#xC744; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xC11C;&#xB85C; &#xB2E4;&#xB978; &#xC720;&#xC804;&#xC801; &#xBC30;&#xACBD; &#xAC00;&#xC9C4; &#xAC1C;&#xC778;&#xC758; DNA &#xBCF5;&#xAD6C; &#xC6A9;&#xB7C9;&#xC744; &#xCE21;&#xC815;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xACE0; &#xC800; &#xD574;&#xC81C;&#xC758; &#xC911;&#xC694; DNA &#xC218;&#xB9AC; &#xD6A8;&#xC18C;, &#xC778;&#xAC04;&#xC758; AP endonuclease &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xC554; chemotherapeutics&#xC758; &#xD6A8;&#xB2A5; &#xBE44;&#xAD50;. &#xC774; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC;&#xC758; &#xC5EC;&#xB7EC; DNA &#xBCF5;&#xAD6C; &#xACBD;&#xB85C; &#xBC0F; &#xC57D;&#xBB3C; &#xBC1C;&#xACAC;, genotoxicity &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xBC0F; &#xD658;&#xACBD; &#xBCF4;&#xAC74;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC804;&#xB7B5;&#xC744; &#xAC00;&#xC838;&#xC624;&#xBBC0;&#xB85C; &#xBCD1;&#xB82C;&#xB85C; subpathways &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; &#xD3C9;&#xAC00; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB2E8;&#xC77C; &#xC140; &#xD2B8;&#xB7A9; &#xBC0F; DNA &#xC190;&#xC0C1; &#xBD84;&#xC11D; microwell &#xBC30;&#xC5F4;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;.

&#x9635;&#x5217;&#x591A;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7C7B;&#x578B;&#x662F;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5173;&#x952E;&#x6B65;&#x9AA4;&#xFF0C;&#x4F46;&#x51E0;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E09;&#x7EF4;&#x5B9A;&#x4F4D;&#x5728;&#x7EC6;&#x80DE;&#x957F;&#x5EA6;&#x89C4;&#x6A21;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x76EE;&#x524D;&#x91C7;&#x7528;&#x7684; 3D &#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x62C9;&#x4E39;&#x6C34;&#x51DD;&#x80F6; microtissues DNA &#x6A21;&#x677F;&#x7EC4;&#x88C5;&quot;&#x81EA;&#x4E0B;&#x800C;&#x4E0A;&quot;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5236;&#x4F5C;&#x591A;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x6784;&#x9020;&#x3002;&#x6D41;&#x96C6;&#x4E2D;&#x751F;&#x6210;&#x4E73;&#x6DB2;&#x7684;&#x5B98;&#x80FD;&#x9884;&#x805A;&#x4F53;&#x7528;&#x4E8E;&#x751F;&#x4EA7; 100 &#x5FAE;&#x7C73;&#x5355;&#x5206;&#x6563; microtissues &#x901F;&#x5EA6;&#x7684; 100 Hz (10(5) h(-1))&#x3002;&#x591A;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7C7B;&#x578B;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x6682;&#x505C;&#x548C; adherently &#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x4E0E;&#x9AD8;&#x53EF;&#x884C;&#x6027; &#xFF08;~ 97%&#xFF09; &#x5C01;&#x88C5;&#x5230; microtissues&#x3002;&#x7136;&#x540E;&#x6211;&#x4EEC;&#x4F7F;&#x7528; DNA &#x7F16;&#x7801;&#x65B9;&#x6848;&#x4ECE;&#x4F7F;&#x7528;&quot;&#x81EA;&#x4E0A;&#x800C;&#x4E0B;&quot;&#x6280;&#x672F;&#x5B9A;&#x4E49;&#x7684;&#x6A21;&#x677F;&#x7EC4;&#x88C5; microtissues&quot;&#x81EA;&#x4E0B;&#x800C;&#x4E0A;&quot;&#x3002;Microtissues &#x884D;&#x751F;&#x5316;&#x4E0E;&#x4F7F;&#x7528;&#x805A;&#x5408;&#x7269;&#x7F51;&#x7EDC;&#xFF0C;&#x751F;&#x7269;&#x7D20;-&#x94FE;&#x9709;&#x4EB2;&#x548C;&#x8054;&#x7CFB;&#x7684;&#x5355;&#x94FE; DNA &#x548C;&#x7EC4;&#x88C5;&#x5230;&#x6591;&#x70B9; DNA &#x5FAE;&#x9635;&#x5217;&#x4E0A;&#x7684;&#x7279;&#x5B9A;&#x5E8F;&#x5217;&#x7684;&#x6742;&#x4EA4;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4F7F;&#x7528;&#x6B63;&#x4EA4;&#x7684; DNA &#x4EE3;&#x7801;&#xFF0C;&#x5B9E;&#x73B0;&#x591A;&#x4E2A; microtissue &#x7C7B;&#x578B;&#x7684;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x7684;&#x9635;&#x5217;&#x4E0E;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x9AD8;&#x6548;&#x7387;&#x548C; &gt; &#x9635;&#x5217;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x7684; 90%&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BC1;&#x660E;&#x80FD;&#x529B;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x591A;&#x5143;&#x6784;&#x9020;&#x7EC4;&#x6210;&#x7684;&#x4E0A;&#x76AE;&#x548C;&#x95F4;&#x8D28; microtissues &#x540C;&#x65F6;&#x4FDD;&#x7559; 3D &#x5FAE;&#x73AF;&#x5883;&#x4E2D;&#x7684;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7C7B;&#x578B;&#x3002;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF; microtissue &#x4EE3;&#x4E0E;&#x53EF;&#x6269;&#x5C55;&#x8868;&#x9762;&#x6A21;&#x677F;&#x7EC4;&#x88C5;&#x7EC4;&#x5408;&#x6F5C;&#x529B;&#x5256;&#x6790;&#x5065;&#x5EB7;&#x548C;&#x60A3;&#x75C5;&#x7684;&#x56FD;&#x5BB6;&#xFF0C;&#x4E09;&#x4E2A;&#x7EF4;&#x5EA6;&#x4E2D;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x95F4;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x673A;&#x5236;&#x4EE5;&#x53CA;&#x690D;&#x5165;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x4E00;&#x4E2A;&#x6846;&#x67B6;&#x7684;&#x66F4;&#x5927;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x6A21;&#x677F;&#x7EC4;&#x88C5;&#x3002;

&#x6DB2;&#x6EF4;&#x6D3E;&#x751F;&#x805A;&#x4E59;&#x4E8C;&#x9187; microtissues &#x7684; DNA &#x6A21;&#x677F;&#x7EC4;&#x88C5;&#x3002;

Patterning multiple cell types is a critical step for engineering functional tissues, but few methods provide three-dimensional positioning at the cellular length scale. Here, we present a "bottom-up" approach for fabricating multicellular tissue constructs that utilizes DNA-templated assembly of 3D cell-laden hydrogel microtissues. A flow focusing-generated emulsion of photopolymerizable prepolymer is used to produce 100 Î¼m monodisperse microtissues at a rate of 100 Hz (10(5) h(-1)). Multiple cell types, including suspension and adherently cultured cells, can be encapsulated into the microtissues with high viability (~97%). We then use a DNA coding scheme to self-assemble microtissues "bottom-up" from a template that is defined using "top-down" techniques. The microtissues are derivatized with single-stranded DNA using a biotin-streptavidin linkage to the polymer network, and are assembled by sequence-specific hybridization onto spotted DNA microarrays. Using orthogonal DNA codes, we achieve multiplexed patterning of multiple microtissue types with high binding efficiency and >90% patterning specificity. Finally, we demonstrate the ability to organize multicomponent constructs composed of epithelial and mesenchymal microtissues while preserving each cell type in a 3D microenvironment. The combination of high throughput microtissue generation with scalable surface-templated assembly offers the potential to dissect mechanisms of cell-cell interaction in three dimensions in healthy and diseased states, as well as provides a framework for templated assembly of larger structures for implantation.

DNA-templated assembly of droplet-derived PEG microtissues.

Types patron de cellules multiples est une &#xE9;tape critique pour les tissus techniques fonctionnelles, mais peu de m&#xE9;thodes de fournir un positionnement tridimensionnel &#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;chelle de longueur cellulaire. Ici, nous pr&#xE9;sentons une &#xAB;bottom-up&#xBB; pour la fabrication de constructions de tissu multicellulaires qui utilise l&#x26;#39;ADN-bas&#xE9; sur un mod&#xE8;le 3D assemblage de microtissues hydrogel cellules charg&#xE9;es. Un flux de focalisation g&#xE9;n&#xE9;r&#xE9; par &#xE9;mulsion de pr&#xE9;polym&#xE8;re photopolym&#xE9;risable est utilis&#xE9; pour produire de 100 um microtissues monodisperses &#xE0; un taux de 100 Hz (10 (5) h (-1)). Plusieurs types de cellules, y compris la suspension et des cellules cultiv&#xE9;es, adh&#xE9;rente peuvent &#xEA;tre encapsul&#xE9;es dans des microtissues avec une viabilit&#xE9; &#xE9;lev&#xE9;e (~ 97%). Nous utilisons ensuite un r&#xE9;gime d&#x26;#39;ADN codant pour s&#x26;#39;auto-assemblent microtissues &#x26;quot;bottom-up&#x26;quot; &#xE0; partir d&#x26;#39;un mod&#xE8;le qui est d&#xE9;fini en utilisant &#x26;quot;top-down&#x26;quot; techniques. Les microtissues sont d&#xE9;rivatis&#xE9;s avec un ADN simple brin en utilisant une liaison biotine-streptavidine au r&#xE9;seau polym&#xE8;re, et sont assembl&#xE9;s par hybridation sp&#xE9;cifique de s&#xE9;quence sur des puces &#xE0; ADN tachet&#xE9;s. Utilisation des codes ADN orthogonales, nous obtenons un motif multiplex&#xE9;e de types Microbroyeur multiples avec une efficacit&#xE9; de liaison &#xE9;lev&#xE9;e et&#x26;gt; la sp&#xE9;cificit&#xE9; de 90% de motifs. Enfin, nous d&#xE9;montrons la capacit&#xE9; d&#x26;#39;organiser des constructions compos&#xE9;es de plusieurs composants microtissues &#xE9;pith&#xE9;liales et m&#xE9;senchymateuses, tout en pr&#xE9;servant chaque type de cellule dans un microenvironnement 3D. La combinaison de g&#xE9;n&#xE9;ration de d&#xE9;bit &#xE9;lev&#xE9; avec Microbroyeur s&#x26;#39;adaptent ensemble bas&#xE9; sur un mod&#xE8;le de surface offre la possibilit&#xE9; de diss&#xE9;quer les m&#xE9;canismes de l&#x26;#39;interaction cellule-cellule en trois dimensions dans les Etats sains et malades, ainsi que fournit un cadre de montage matric&#xE9;e de structures plus grandes &#xE0; l&#x26;#39;implantation.

ADN-templated Assembl&#xE9;e des Microtissues PEG Droplet d&#xE9;riv&#xE9;s

Musterung mehrere Zelltypen ist ein entscheidender Schritt f&uuml;r die technische funktionelle Gewebe, aber einige Methoden bieten dreidimensionale Positionierung an der zellul&auml;ren L&auml;ngenskala. Hier pr&auml;sentieren wir einen &quot;Bottom-Up&quot;-Ansatz f&uuml;r die Herstellung von vielzelligen Gewebe Konstrukte, der DNA-vorlagenbasierten Montage von 3D Zelle beladene Hydrogel-Microtissues nutzt. Eine Fluss mit Schwerpunkt generierte Emulsion aus Photopolymerizable Prepolymer wird zum produzieren von 100 &mu;m monodispersen Microtissues mit einer Rate von 100 Hz (10 Absatz 5 h(-1)). Mehrere Zelltypen, einschlie&szlig;lich der Aussetzung und adherently kultivierten Zellen, k&ouml;nnen in der Microtissues mit hoher Rentabilit&auml;t (~ 97 %) gekapselt werden. Wir verwenden ein DNA-Codierungsschema f&uuml;r den um Microtissues &quot;Bottom-Up&quot; aus einer Vorlage zu self-assemble, die mit &quot;Top-Down&quot; Techniken definiert ist. Die Microtissues sind derivatized mit einzeln-angeschwemmte DNA mit eine Biotin-Streptavidin-Verkn&uuml;pfung mit dem Polymer-Netzwerk und von Sequenz-spezifische Hybridisierung auf Gefleckte DNA-Microarrays montiert sind. Mit orthogonalen DNA-Codes, erreichen wir Multiplex Musterung mit mehreren Microtissue-Typen mit hoher Bindung Effizienz und &gt; 90 % Spezifit&auml;t Musterung. Schlie&szlig;lich zeigen wir, Multikomponenten-Konstrukte organisiert der epitheliale und Mesenchymale Microtissues komponiert, und gleichzeitig jeder Zellart in eine 3D Mikromilieu. Die Kombination von Hochdurchsatz-Microtissue-Generation mit skalierbare Oberfl&auml;che auf Vorlagen basierende Montage bietet das Potenzial, Mechanismen der Zell-Zell-Interaktion in drei Dimensionen in gesunden und Kranken Staaten zu zergliedern, sowie bietet einen Rahmen f&uuml;r auf Vorlagen basierende Montage von gr&ouml;&szlig;eren Strukturen f&uuml;r die Implantation.

DNA-vorlagenbasierten Montage von Tr&ouml;pfchen abgeleitete PEG Microtissues.

Creazione di serie di pi&ugrave; tipi di cellule &egrave; un passaggio fondamentale per l&#39;ingegneria dei tessuti funzionali, ma pochi metodi consentono un posizionamento tridimensionale presso la scala di lunghezza cellulare. Qui di seguito, presentiamo un approccio &quot;bottom-up&quot; per la realizzazione di costrutti di tessuto pluricellulare che utilizza assembly basati sul DNA di idrogel cella carico 3D microtissues. Un&#39;emulsione di flusso generato di messa a fuoco del prepolimero photopolymerizable &egrave; usata per produrre 100 &mu;m monodispersi microtissues a una frequenza di 100 Hz (5 h(-1)). Diversi tipi di cellule, comprese sospensioni e cellule adherently coltivate, possono essere incapsulati nella microtissues con alta redditivit&agrave; (~ 97%). Quindi usiamo un sistema di codifica del DNA ad assemblarsi microtissues &quot;bottom-up&quot; da un modello che viene definito utilizzando tecniche di &quot;top-down&quot;. I microtissues sono derivatizzata con single-stranded DNA utilizzando un collegamento biotina-streptavidina alla rete del polimero e vengono assemblati tramite l&#39;ibridazione di sequenza-specifico sul spotted microarrays del DNA. Utilizzando i codici del DNA ortogonale, raggiungiamo con efficienza alta associazione multiplex patterning di pi&ugrave; tipi di microtissue e &amp;gt; 90% creazione di serie di specificit&agrave;. Infine, ci dimostrano la capacit&agrave; di organizzare costrutti multicomponente composto microtissues epiteliali e mesenchimali conservando ogni tipo di cellula in un microambiente 3D. La combinazione di generazione microtissue ad alto rendimento con montaggio su modelli superficie scalabile offre il potenziale per sezionare i meccanismi di interazione cellula-cellula in tre dimensioni in stati sani e malati, come pure fornisce un framework per il montaggio su modelli di strutture pi&ugrave; grandi per l&#39;impianto.

Assemblea basati sul DNA di goccia-derivati microtissues PEG.

&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x3001;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x7A2E;&#x985E;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5DE5;&#x5B66;&#x3001;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7D44;&#x7E54;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x3067;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x9577;&#x3055;&#x30B9;&#x30B1;&#x30FC;&#x30EB;&#x3067;&#x306E;&#x4E09;&#x6B21;&#x5143;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;3&#x6B21;&#x5143;&#x30BB;&#x30EB;&#x3092;&#x542B;&#x3093;&#x3060;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x30B2;&#x30EB;microtissues&#x306E;DNA&#x30C6;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x3092;&#x5229;&#x7528;&#x3057;&#x305F;&#x591A;&#x7D30;&#x80DE;&#x7D44;&#x7E54;&#x306E;&#x69CB;&#x6210;&#x8981;&#x7D20;&#x3092;&#x88FD;&#x9020;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E; &#x26;quot;&#x30DC;&#x30C8;&#x30E0;&#x30A2;&#x30C3;&#x30D7;&#x26;quot;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x63D0;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5149;&#x91CD;&#x5408;&#x6027;&#x30D7;&#x30EC;&#x30DD;&#x30EA;&#x30DE;&#x30FC;&#x306E;&#x6D41;&#x308C;&#x3092;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x306B;&#x751F;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30A8;&#x30DE;&#x30EB;&#x30B8;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;100 Hz&#x306E;&#xFF08;10&#xFF08;5&#xFF09;H&#xFF08;-1&#xFF09;&#xFF09;&#x306E;&#x901F;&#x5EA6;&#x3067;100&#x3BC;m&#x306E;&#x5358;&#x5206;&#x6563;microtissues&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30B5;&#x30B9;&#x30DA;&#x30F3;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3068;&#x5BC6;&#x7740;&#x57F9;&#x990A;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x578B;&#x306F;&#x3001;&#x9AD8;&#x3044;&#x751F;&#x5B58;&#x7387;&#xFF08;&#x301C;97&#xFF05;&#xFF09;&#x3067;microtissues&#x306B;&#x30AB;&#x30D7;&#x30BB;&#x30EB;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6B21;&#x306B;&#x3001;&#x81EA;&#x5DF1;&#x7D44;&#x7E54;&#x5316;microtissues &#x26;quot;&#x30C8;&#x30C3;&#x30D7;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3;&#x26;quot;&#x6280;&#x8853;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x30C6;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x304B;&#x3089; &#x26;quot;&#x30DC;&#x30C8;&#x30E0;&#x30A2;&#x30C3;&#x30D7;&#x26;quot;&#x306B;DNA&#x7B26;&#x53F7;&#x5316;&#x65B9;&#x5F0F;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002; microtissues&#x306F;&#x3001;&#x30DD;&#x30EA;&#x30DE;&#x30FC;&#x30CD;&#x30C3;&#x30C8;&#x30EF;&#x30FC;&#x30AF;&#x306B;&#x30D3;&#x30AA;&#x30C1;&#x30F3; - &#x30B9;&#x30C8;&#x30EC;&#x30D7;&#x30C8;&#x30A2;&#x30D3;&#x30B8;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x4E00;&#x672C;&#x9396;DNA&#x3067;&#x8A98;&#x5C0E;&#x4F53;&#x5316;&#x3057;&#x3066;&#x304A;&#x308A;&#x3001;&#x6591;&#x70B9;&#x306E;&#x3042;&#x308B;DNA&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30A2;&#x30EC;&#x30A4;&#x306B;&#x914D;&#x5217;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C0;&#x30A4;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x7D44;&#x307F;&#x7ACB;&#x3066;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x76F4;&#x4EA4;&#x306E;DNA&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x9AD8;&#x7D50;&#x5408;&#x52B9;&#x7387;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x26;gt; 90&#xFF05;&#x306E;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x8907;&#x6570;&#x306E;microtissue&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x306E;&#x591A;&#x91CD;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x5B9F;&#x73FE;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;3D&#x5FAE;&#x5C0F;&#x74B0;&#x5883;&#x5185;&#x306E;&#x5404;&#x30BB;&#x30EB;&#x306E;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x3092;&#x4FDD;&#x6301;&#x3057;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x3001;&#x4E0A;&#x76AE;&#x3068;&#x9593;&#x8449;&#x7CFB;microtissues&#x3067;&#x69CB;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x591A;&#x6210;&#x5206;&#x69CB;&#x9020;&#x3092;&#x6574;&#x7406;&#x3059;&#x308B;&#x80FD;&#x529B;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30B9;&#x30B1;&#x30FC;&#x30E9;&#x30D6;&#x30EB;&#x306A;&#x8868;&#x9762;&#x92F3;&#x578B;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x3068;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;microtissue&#x4E16;&#x4EE3;&#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x306F;&#x3001;&#x5065;&#x5EB7;&#x3068;&#x75C5;&#x6C17;&#x306E;&#x72B6;&#x614B;&#x3067;&#x4E09;&#x6B21;&#x5143;&#x7684;&#x306B;&#x7D30;&#x80DE;&#x9593;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x3092;&#x89E3;&#x5256;&#x3059;&#x308B;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3001;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;&#x79FB;&#x690D;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x3088;&#x308A;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x30C6;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30D5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30E0;&#x30EF;&#x30FC;&#x30AF;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x6DB2;&#x6EF4;&#x7531;&#x6765;&#x306E;PEG Microtissues&#x306E;DNA&#x30C6;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;

&#xC5EC;&#xB7EC; &#xC138;&#xD3EC; &#xC720;&#xD615; &#xD328;&#xD134;&#xD654; &#xC5D4;&#xC9C0;&#xB2C8;&#xC5B4;&#xB9C1; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xB2E8;&#xACC4; &#xC774;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xBA87; &#xAC00;&#xC9C0; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xC140;&#xB8F0;&#xB7EC; &#xAE38;&#xC774; &#xADDC;&#xBAA8; 3 &#xCC28;&#xC6D0; &#xC704;&#xCE58;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC120;&#xBB3C;&#xC774; 3D &#xC140; &#xB77C;&#xB374; hydrogel microtissues&#xC758; DNA &#xD15C;&#xD50C;&#xB9BF; &#xAE30;&#xBC18; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xB97C; &#xC774;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC870;&#xC791; &#xB2E4;&#xC138;&#xD3EC; &#xC870;&#xC9C1; &#xAD6C;&#xC870;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &quot;&#xD558;&#xB2E8;-&#xC5C5;&quot; &#xC811;&#xADFC;. &#xCE5C;&#xD654;&#xC131; prepolymer&#xC758; &#xD750;&#xB984; &#xC911;&#xC2EC;&#xC73C;&#xB85C; &#xC0DD;&#xC131; &#xB41C; &#xC5D0;&#xBA40;&#xC83C; 100 Hz (10(5) h(-1))&#xC758; &#xC18D;&#xB3C4;&#xB85C; 100 &mu; m &#xB2E8; &#xBD84;&#xC0B0; microtissues&#xB97C; &#xC0DD;&#xC0B0; &#xD558;&#xB294;. &#xC11C; &#xC2A4; &#xD39C;&#xC158;&#xACFC; adherently &#xBC30;&#xC591;&#xB41C; &#xC138;&#xD3EC;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD55C; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xC138;&#xD3EC; &#xC720;&#xD615;, &#xB192;&#xC740; &#xC0DD;&#xC874; (~ 97%)&#xC640; microtissues&#xB85C; &#xCEA1;&#xC290;&#xD654; &#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xB2E4;&#xC74C; DNA &#xCF54;&#xB529; &#xAD6C;&#xC131;&#xD45C;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &quot;&#xCD5C;&#xC0C1;&#xC704;-&#xB0B4;&#xB824;&quot; &#xAE30;&#xC220;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC815;&#xC758; &#xB418;&#xB294; &#xD15C;&#xD50C;&#xB9BF;&#xC5D0;&#xC11C; microtissues &quot;&#xD558;&#xB2E8;-&#xC5C5;&quot;&#xC744; self-assemble. Microtissues &#xD3F4;&#xB9AC;&#xBA38; &#xB124;&#xD2B8;&#xC6CC;&#xD06C;&#xC5D0; biotin streptavidin &#xB9C1;&#xD06C;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; DNA&#xC640; derivatized &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xBAA9;&#xACA9;&#xB41C; DNA microarrays&#xC5D0; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xAD00;&#xB828; &#xAD50; &#xC7A1;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC870;&#xB9BD;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xB192;&#xC740; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD6A8;&#xC728; &#xC5EC;&#xB7EC; microtissue &#xD615;&#xC2DD;&#xC758; &#xB2E4;&#xC911;&#xD654; &#xD328;&#xD134;&#xD654;&#xB97C; &#xB2EC;&#xC131; &#xC9C1;&#xAD50; DNA &#xCF54;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;, &#xBC0F; &amp;gt; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC744; &#xD328;&#xD134;&#xD654; 90%. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xAE61;&#xD1B5;&#xC774; &#xAD6C;&#xBB38;&#xC744; &#xC815;&#xB9AC; &#xD558;&#xB294; &#xB2A5;&#xB825;&#xC740; 3D microenvironment&#xC5D0; &#xAC01; &#xC140; &#xD615;&#xC2DD;&#xC744; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558;&#xBA74;&#xC11C; &#xC0C1;&#xD53C;&#xC640; &#xC911;&#xAC04; &#xC5FD; microtissues &#xAD6C;&#xC131; &#xB41C; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; microtissue &#xC138;&#xB300; &#xD655;&#xC7A5; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xD45C;&#xBA74; &#xD15C;&#xD50C;&#xB9BF; &#xAE30;&#xBC18; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xC640; &#xACB0;&#xD569; &#xAC74;&#xAC15; &#xD558; &#xACE0; &#xBCD1;&#xC5D0; &#xAC78;&#xB9B0; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC5D0;&#xC11C; 3 &#xCC28;&#xC6D0;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC138;&#xD3EC; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; &#xD574; &#xBD80;&#xB97C; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xC774;&#xC2DD;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB354; &#xD070; &#xAD6C;&#xC870;&#xC758; &#xD15C;&#xD50C;&#xB9BF; &#xAE30;&#xBC18; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD504;&#xB808;&#xC784; &#xC6CC;&#xD06C;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB4DC;&#xB86D;&#xB9BF; &#xD30C;&#xC0DD; &#xBABB; microtissues&#xC758; DNA &#xD15C;&#xD50C;&#xB9BF; &#xAE30;&#xBC18; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;.

Tipos de modelado de m&#xFA;ltiples c&#xE9;lulas es un paso cr&#xED;tico para la ingenier&#xED;a de tejidos funcionales, pero pocos m&#xE9;todos proporcionan posicionamiento tridimensional en la escala de la longitud celular. A continuaci&#xF3;n, presentamos un &#x26;quot;bottom-up&#x26;quot; para la fabricaci&#xF3;n de construcciones multicelulares tejidos que utiliza el ADN plantilla montaje de 3D microtejidos hidrogel cargado de c&#xE9;lulas. Un flujo de enfoque generada por emulsi&#xF3;n de prepol&#xED;mero fotopolimerizable se utiliza para producir 100 micras microtejidos monodispersas a una velocidad de 100 Hz (10 (5) h (-1)). Varios tipos de c&#xE9;lulas, incluyendo la suspensi&#xF3;n y las c&#xE9;lulas cultivadas, adherente puede ser encapsulado en las microtejidos con alta viabilidad (~ 97%). A continuaci&#xF3;n, utilizamos un esquema de ADN que codifica a la auto-ensamblan microtejidos &#x26;quot;bottom-up&#x26;quot; de una plantilla que se define a partir &#x26;quot;de arriba hacia abajo&#x26;quot; t&#xE9;cnicas. Los microtejidos son derivatizado con una sola hebra de ADN utilizando una vinculaci&#xF3;n biotina-estreptavidina a la red de pol&#xED;mero, y se ensamblan por la secuencia espec&#xED;fica de hibridaci&#xF3;n de ADN en microarrays manchado. El uso de c&#xF3;digos ortogonales de ADN, podemos lograr los patrones de los tipos de multiplexado microtejidos m&#xFA;ltiples con alta eficacia vinculante y&#x26;gt; especificidad del 90% del patr&#xF3;n. Por &#xFA;ltimo, demostrar la capacidad de organizar las construcciones de varios componentes integrados por microtejidos epiteliales y mesenquimales, mientras que la preservaci&#xF3;n de cada tipo de c&#xE9;lula en un microambiente en 3D. La combinaci&#xF3;n de la generaci&#xF3;n de alto rendimiento con microtejidos de superficie escalable con plantilla de montaje ofrece la posibilidad de disecar los mecanismos de interacci&#xF3;n c&#xE9;lula-c&#xE9;lula en tres dimensiones en los estados sanos y enfermos, as&#xED; como proporciona un marco para el montaje con plantilla de estructuras m&#xE1;s grandes para la implantaci&#xF3;n.

ADN-patr&#xF3;n de la Asamblea microtejidos PEG gota de derivados

La recherche d&#39;indicateurs pr&eacute;dictifs de la maladie a largement port&eacute; sur les marqueurs mol&eacute;culaires. Toutefois, les marqueurs biophysiques qui peuvent int&eacute;grer des voies multiples, peuvent pr&eacute;voir une vision plus globale de la physiopathologie. Dr&eacute;panocytose affecte des millions de personnes dans le monde et a &eacute;t&eacute; &eacute;tudi&eacute; intens&eacute;ment, mol&eacute;culaire, cellulaire, tissulaire, et niveau organismique depuis un si&egrave;cle, mais il y a encore peu, voire aucune, marqueurs de quantifier la gravit&eacute; de cette maladie. Parce que les complications de la dr&eacute;panocytose sont en grande partie en raison d&#39;&eacute;v&eacute;nements vaso-occlusifs, nous avons suppos&eacute; qu&#39;une m&eacute;trique physique caract&eacute;risant le processus vaso-occlusifs pourrait servir d&#39;indicateur de la s&eacute;v&eacute;rit&eacute; de la maladie. Ici, nous utilisons un dispositif microfluidique pour caract&eacute;riser la dynamique de &laquo; brouillage &raquo;, ou vaso-occlusion, dans des conditions physiologiquement pertinentes, en mesurant un param&egrave;tre biophysique qui quantifie le taux de variation de la r&eacute;sistance &agrave; l&#39;&eacute;coulement apr&egrave;s un &eacute;v&eacute;nement de d&eacute;soxyg&eacute;nation soudaine. Nos &eacute;tudes montrent que ce seul param&egrave;tre biophysique pourrait &ecirc;tre utilis&eacute; pour distinguer les patients atteints de mauvais r&eacute;sultats de ceux qui ont de bons r&eacute;sultats, &agrave; la diff&eacute;rence des tests de laboratoire existants. Cet indicateur biophysique pourrait donc servir &agrave; orienter le minutage des interventions cliniques, pour surveiller la progression de la maladie et de mesurer l&#39;efficacit&eacute; des m&eacute;dicaments, de transfusion et de nouvelles petites mol&eacute;cules dans un ex vivo r&eacute;glage.

Un indicateur biophysique du risque de vaso-occlusifs dans la dr&eacute;panocytose.

The search for predictive indicators of disease has largely focused on molecular markers. However, biophysical markers, which can integrate multiple pathways, may provide a more global picture of pathophysiology. Sickle cell disease affects millions of people worldwide and has been studied intensely at the molecular, cellular, tissue, and organismal level for a century, but there are still few, if any, markers quantifying the severity of this disease. Because the complications of sickle cell disease are largely due to vaso-occlusive events, we hypothesized that a physical metric characterizing the vaso-occlusive process could serve as an indicator of disease severity. Here, we use a microfluidic device to characterize the dynamics of "jamming," or vaso-occlusion, in physiologically relevant conditions, by measuring a biophysical parameter that quantifies the rate of change of the resistance to flow after a sudden deoxygenation event. Our studies show that this single biophysical parameter could be used to distinguish patients with poor outcomes from those with good outcomes, unlike existing laboratory tests. This biophysical indicator could therefore be used to guide the timing of clinical interventions, to monitor the progression of the disease, and to measure the efficacy of drugs, transfusion, and novel small molecules in an ex vivo setting.

A biophysical indicator of vaso-occlusive risk in sickle cell disease.

La ricerca di indicatori predittivi della malattia &egrave; principalmente focalizzato su marcatori molecolari. Tuttavia, biofisici marcatori, che possono integrare percorsi multipli, possono fornire un quadro pi&ugrave; globale di fisiopatologia. Falciforme colpisce milioni di persone in tutto il mondo ed &egrave; stato studiato intensamente al tessuto molecolare, cellulare e organismica livello per un secolo, ma ci sono ancora pochi, se del caso, marcatori di quantificare la gravit&agrave; di questa malattia. Perch&eacute; le complicanze della malattia di cellule di falce sono in gran parte a causa di eventi vaso-occlusiva, abbiamo ipotizzato che una metrica fisica che caratterizzano il processo di vaso-occlusiva potrebbe servire come indicatore di gravit&agrave; della malattia. Qui, utilizziamo un dispositivo microfluidico per caratterizzare le dinamiche di &quot;jamming&quot;, o vaso-occlusione, in condizioni fisiologicamente rilevanti, attraverso la misurazione di un parametro biofisico che quantifica il tasso di variazione della resistenza al flusso dopo un evento improvviso deoxygenation. I nostri studi mostrano che questo singolo parametro biofisico potrebbe essere utilizzato per distinguere i pazienti con scarsi risultati da quelli con buoni risultati, a differenza dei test di laboratorio esistenti. Questo indicatore biofisico quindi potrebbe essere usato per guidare la tempistica degli interventi clinici, per monitorare la progressione della malattia e per misurare l&#39;efficacia dei farmaci, trasfusioni e romanzo piccole molecole in un ex vivo impostazione.

Un indicatore biofisico del vaso-occlusiva rischio nella malattia di cellule di falce.

A key modality of non-surgical cancer management is DNA damaging therapy that causes DNA double-strand breaks that are preferentially toxic to rapidly dividing cancer cells. Double-strand break repair capacity is recognized as an important mechanism in drug resistance and is therefore a potential target for adjuvant chemotherapy. Additionally, spontaneous and environmentally induced DSBs are known to promote cancer, making DSB evaluation important as a tool in epidemiology, clinical evaluation and in the development of novel pharmaceuticals. Currently available assays to detect double-strand breaks are limited in throughput and specificity and offer minimal information concerning the kinetics of repair. Here, we present the CometChip, a 96-well platform that enables assessment of double-strand break levels and repair capacity of multiple cell types and conditions in parallel and integrates with standard high-throughput screening and analysis technologies. We demonstrate the ability to detect multiple genetic deficiencies in double-strand break repair and evaluate a set of clinically relevant chemical inhibitors of one of the major double-strand break repair pathways, non-homologous end-joining. While other high-throughput repair assays measure residual damage or indirect markers of damage, the CometChip detects physical double-strand breaks, providing direct measurement of damage induction and repair capacity, which may be useful in developing and implementing treatment strategies with reduced side effects.

Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors.

The cancer microenvironment, which incorporates interactions with stromal cells, extracellular matrix (ECM), and other tumor cells in a 3-dimensional (3D) context, has been implicated in every stage of cancer development, including growth of the primary tumor, metastatic spread, and response to treatment. Our understanding of the tumor microenvironment and our ability to develop new therapies would greatly benefit from tools that allow us to systematically probe microenvironmental cues within a 3D context. Here, we leveraged recent advances in microfluidic technology to develop a platform for high-throughput fabrication of tunable cellular microniches ("microtissues") that allow us to probe tumor cell response to a range of microenvironmental cues, including ECM, soluble factors, and stromal cells, all in 3D. We further combine this tunable microniche platform with rapid, flow-based population level analysis (n > 500), which permits analysis and sorting of microtissue populations both pre- and post-culture by a range of parameters, including proliferation and homotypic or heterotypic cell density. We used this platform to demonstrate differential responses of lung adenocarcinoma cells to a selection of ECM molecules and soluble factors. The cells exhibited enhanced or reduced proliferation when encapsulated in fibronectin- or collagen-1-containing microtissues, respectively, and they showed reduced proliferation in the presence of TGF-Î², an effect that we did not observe in monolayer culture. We also measured tumor cell response to a panel of drug targets and found, in contrast to monolayer culture, specific sensitivity of tumor cells to TGFÎ²R2 inhibitors, implying that TGF-Î² has an anti-proliferative affect that is unique to the 3D context and that this effect is mediated by TGFÎ²R2. These findings highlight the importance of the microenvironmental context in therapeutic development and that the platform we present here allows the high-throughput study of tumor response to drugs as well as basic tumor biology in well-defined microenvironmental niches.

Flow-based pipeline for systematic modulation and analysis of 3D tumor microenvironments.

Le micro-environnement de cancer, qui int&egrave;gre les interactions avec les cellules stromales de la matrice extracellulaire (ECM) et autres cellules de la tumeur dans un contexte (3D) 3 dimension, a &eacute;t&eacute; impliqu&eacute; dans toutes les &eacute;tapes du d&eacute;veloppement du cancer, y compris la croissance de la tumeur primitive, m&eacute;tastases et r&eacute;ponse au traitement. Notre compr&eacute;hension du microenvironnement tumoral et notre capacit&eacute; &agrave; d&eacute;velopper de nouvelles th&eacute;rapies b&eacute;n&eacute;ficierait grandement d&#39;outils qui nous permettent de sonder syst&eacute;matiquement les signaux micro-environnementales dans un contexte 3D. Ici, nous avons tir&eacute; parti des r&eacute;cents progr&egrave;s technologiques de la microfluidique pour d&eacute;velopper une plate-forme haut d&eacute;bit fabrication de microniches cellulaire accordable (&quot;microtissues&quot;) qui nous permettent de sonder la r&eacute;ponse des cellules tumorales &agrave; une gamme d&#39;indices micro-environnementales, y compris les ECM, facteurs solubles et des cellules stromales, tout en 3D. Nous avons mieux combiner cette plate-forme parcelle accordable avec analyse de niveau rapide, ax&eacute;e sur les flux de population (n &gt; 500), permettant l&#39;analyse et le tri des populations micro-culture pr&eacute;- et apr&egrave;s-culture par une s&eacute;rie de param&egrave;tres, y compris la prolif&eacute;ration et homotypique ou densit&eacute; cellulaire h&eacute;t&eacute;rotypiques. Nous avons utilis&eacute; cette plateforme pour d&eacute;montrer des r&eacute;actions diff&eacute;rentes des cellules d&#39;ad&eacute;nocarcinome pulmonaire &agrave; une s&eacute;lection des mol&eacute;cules et des facteurs solubles. Les cellules expos&eacute;es prolif&eacute;ration accrue ou r&eacute;duite lorsque encapsul&eacute; dans la fibronectine collag&egrave;ne-1 contenant ou microtissues, respectivement, et ils ont montr&eacute; r&eacute;duit la prolif&eacute;ration en pr&eacute;sence de TGF-&beta;, un effet que nous n&#39;avons pas observ&eacute; en monocouche. Aussi, nous avons mesur&eacute; la r&eacute;ponse cellulaire tumorale &agrave; un panel de cibles m&eacute;dicamenteuses et trouv&eacute;, &agrave; la diff&eacute;rence de culture monocouche, sensibilit&eacute; sp&eacute;cifique des cellules tumorales aux inhibiteurs de la TGF&beta;R2, ce qui implique que le TGF-&beta; a un effet anti-prolif&eacute;rante unique au contexte 3D et que cet effet est m&eacute;di&eacute; par TGF&beta;R2. Ces r&eacute;sultats soulignent l&#39;importance du contexte micro-environnementales dans le d&eacute;veloppement de th&eacute;rapeutique et que la plate-forme, nous pr&eacute;sentons ici permet l&#39;&eacute;tude de haut d&eacute;bit de la r&eacute;ponse tumorale aux drogues ainsi que biologie tumorale de base dans des cr&eacute;neaux de micro-environnementales bien d&eacute;finis.

Flow-based pipeline pour modulation syst&eacute;matique et l&#39;analyse des micro-environnements tumeur 3D.

Il microambiente del tumore, che incorpora le interazioni con le cellule stromale, matrice extracellulare (ECM) e altre cellule tumorali in un contesto tridimensionale (3D), &egrave; stato coinvolto in ogni fase di sviluppo del cancro, tra cui la crescita del tumore primario, diffusione metastatica e la risposta al trattamento. La nostra comprensione del microambiente del tumore e la nostra capacit&agrave; di sviluppare nuove terapie beneficerebbe notevolmente gli strumenti che ci permettono di sondare sistematicamente spunti microenvironmental all&#39;interno di un contesto 3D. Qui, abbiamo sfruttato i recenti progressi nella tecnologia microfluidica per sviluppare una piattaforma per la fabbricazione di high-throughput di sintonizzabile cellulare microniches (&quot;microtissues&quot;) che ci permettono di sondare la risposta cellula tumorale a una serie di spunti microenvironmental, tra cui ECM, fattori solubili e cellule stromali, tutto in 3D. Combiniamo ulteriormente questa piattaforma microniche sintonizzabile con analisi di livello rapida, basata sui flussi di popolazione (n &amp;gt; 500), che permette l&#39;analisi e l&#39;ordinamento delle popolazioni microtissue sia pre- che comincino da una serie di parametri, tra cui proliferazione e homotypic o densit&agrave; delle cellule heterotypic. Abbiamo utilizzato questa piattaforma per dimostrare risposte differenziali delle cellule di adenocarcinoma del polmone a una selezione di molecole in ECM e fattori solubili. Le cellule esposte avanzata o ridotta proliferazione quando incapsulati in microtissues fibronectina o collagene-1-contenenti, rispettivamente, e hanno mostrato ridotta proliferazione in presenza di TGF-&beta;, un effetto che non osserviamo nella coltura dello strato monomolecolare. Abbiamo anche misurato la risposta delle cellule tumorali a un quadro di obiettivi farmacologici e trovato, in contrasto con la coltura dello strato monomolecolare, specifica sensibilit&agrave; delle cellule tumorali di inibitori della TGF&beta;R2, che implica che il TGF-&beta; ha un effetto anti-proliferativo che &egrave; unico per il contesto 3D e che questo effetto &egrave; mediato da TGF&beta;R2. Questi risultati evidenziano l&#39;importanza del contesto microenvironmental in sviluppo terapeutico e che la piattaforma vi presentiamo qui permette lo studio ad alta velocit&agrave; di risposta del tumore a farmaci cos&igrave; come la biologia dei sistemi tumorali base in nicchie ben definite microenvironmental.

Basato su flussi pipeline per modulazione sistematica e analisi di microambienti tumorali 3D.

Fluorescence microscopy is commonly used for imaging live mammalian cells. Here, we describe studies aimed at revealing the potential genotoxic effects of standard fluorescence microscopy. To assess DNA damage, a high throughput platform for single cell gel electrophoresis is used (e.g., the CometChip). Light emitted by three standard filters was studied: (a) violet light [340-380 nm], used to excite DAPI and other blue fluorophores, (b) blue light [460-500 nm] commonly used to image green fluorescent protein (GFP) and Calcein AM, and (c) green light [528-553 nm], useful for imaging red fluorophores. Results show that exposure of samples to light during imaging is indeed genotoxic even when the selected wavelengths are outside the range known to induce significant damage levels. Shorter excitation wavelengths and longer irradiation times lead to higher levels of DNA damage. We have also measured DNA damage in cells expressing enhanced GFP or stained with Calcein AM, a widely used green fluorophore. Data show that Calcein AM leads to a synergistic increase in the levels of DNA damage and that even cells that are not being directly imaged sustain significant DNA damage from exposure to indirect light. The nature of light-induced DNA damage during imaging was assessed using the Fpg glycosylase, an enzyme that enables quantification of oxidative DNA damage. Oxidative damage was evident in cells exposed to violet light. Furthermore, the Fpg glycosylase revealed the presence of oxidative DNA damage in blue-light exposed cells for which DNA damage was not detected using standard analysis conditions. Taken together, the results of these studies call attention to the potential confounding effects of DNA damage induced by standard imaging conditions, and identify wavelength, exposure time, and fluorophore as parameters that can be modulated to reduce light-induced DNA damage.

Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic.

Thrombin is a serine protease and regulator of hemostasis that plays a critical role in the formation of obstructive blood clots, or thrombosis, that is a life-threatening condition associated with numerous diseases such as atherosclerosis and stroke. To detect thrombi in living animals, we design and conjugate thrombin-sensitive peptide substrates to the surface of nanoparticles. Following intravenous infusion, these "synthetic biomarkers" survey the host vasculature for coagulation and, in response to substrate cleavage by thrombin, release ligand-encoded reporters into the host urine. To detect the urinary reporters, we develop a companion 96-well immunoassay that utilizes antibodies to bind specifically to the ligands, thus capturing the reporters for quantification. Using a thromboplastin-induced mouse model of pulmonary embolism, we show that urinary biomarker levels differentiate between healthy and thrombotic states and correlate closely with the aggregate burden of clots formed in the lungs. Our results demonstrate that synthetic biomarkers can be engineered to sense vascular diseases remotely from the urine and may allow applications in point-of-care diagnostics.

Nanoparticles that sense thrombin activity as synthetic urinary biomarkers of thrombosis.

With noncommunicable diseases (NCDs) now constituting the majority of global mortality, there is a growing need for low-cost, noninvasive methods to diagnose and treat this class of diseases, especially in resource-limited settings. Molecular biomarkers combined with low-cost point-of-care assays constitute a potential solution for diagnosing NCDs, but the dearth of naturally occurring, predictive markers limits this approach. Here, we describe the design of exogenous agents that serve as synthetic biomarkers for NCDs by producing urinary signals that can be quantified by a companion paper test. These synthetic biomarkers are composed of nanoparticles conjugated to ligand-encoded reporters via protease-sensitive peptide substrates. Upon delivery, the nanoparticles passively target diseased sites, such as solid tumors or blood clots, where up-regulated proteases cleave the peptide substrates and release reporters that are cleared into urine. The reporters are engineered for detection by sandwich immunoassays, and we demonstrate their quantification directly from unmodified urine; furthermore, capture antibody specificity allows the probes to be multiplexed in vivo and quantified simultaneously by ELISA or paper lateral flow assay (LFA). We tailor synthetic biomarkers specific to colorectal cancer, a representative solid tumor, and thrombosis, a common cardiovascular disorder, and demonstrate urinary detection of these diseases in mouse models by paper diagnostic. Together, the LFA and injectable synthetic biomarkers, which could be tailored for multiple diseases, form a generalized diagnostic platform for NCDs that can be applied in almost any setting without expensive equipment or trained medical personnel.

Article	Year
Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 20534572	2010
DNA-templated assembly of droplet-derived PEG microtissues. Lab on a chip\| PubMed ID: 21776518	2011
A biophysical indicator of vaso-occlusive risk in sickle cell disease. Science translational medicine\| PubMed ID: 22378926	2012
Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors. Cell cycle (Georgetown, Tex.)\| PubMed ID: 23422001	2013
Flow-based pipeline for systematic modulation and analysis of 3D tumor microenvironments. Lab on a chip\| PubMed ID: 23563587	2013
Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology\| PubMed ID: 23650257	2013
Nanoparticles that sense thrombin activity as synthetic urinary biomarkers of thrombosis. ACS nano\| PubMed ID: 24015809	2013
Point-of-care diagnostics for noncommunicable diseases using synthetic urinary biomarkers and paper microfluidics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 24567404	2014

David K. Wood

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