DNA 提取与限制性内切酶分析
- DNA 提取
- 注意：在本实验中，你将在两种实验条件下进行 DNA 提取：一种使用含有去污剂 SDS 的缓冲液，另一种不使用去污剂。假设：本实验的备择假设可能是，未使用 SDS（一种可破坏细胞膜的强阴离子去污剂）制备的样本，其 DNA 产量低于使用 SDS 制备的样本。本实验的零假设可能是，两个样本将产生等量的 DNA。
- 开始采集用于 DNA 提取的组织样本。此处你将使用自己的口腔黏膜细胞。用冰棒棍在口腔内侧轻轻刮擦约 30 秒。重要提示：切勿用力刮擦导致疼痛或出血。
- 将漏斗置于一个 15 mL 圆锥形离心管中。
- 然后取一个已标记杯子中提供的 10 mL 1% 生理盐水溶液，在口中含漱但不吞咽。
- 持续含漱 90 秒，然后将含有口腔细胞的生理盐水吐入漏斗，使其收集到圆锥形离心管中。
- 接下来，用你的姓名首字母标记两个空的微量离心管。
- 将其中一个管标记为 +SDS，另一个标记为 -SDS，以区分两种处理条件。
- 然后向每根管中加入 1.5 至 2 mL 含有口腔细胞的生理盐水溶液。
- 将离心管放入微量离心机中离心 30 秒。
- 从微量离心机中取出离心管，小心倾倒上清液，避免扰动沉积在管底的细胞。
- 用更多含有口腔细胞的生理盐水重新填充离心管，并重复离心步骤。
- 重复此过程，注意将细胞均匀分配至 +SDS 和 -SDS 管中，直至所有口腔细胞均被收集完毕。
- 接下来，向标记为 +SDS 的管中加入 1 mL 含 SDS 的裂解缓冲液，然后通过反复吹打重悬细胞沉淀。
- 然后向标记为 -SDS 的管中加入 1 mL 不含 SDS 的裂解缓冲液，并通过反复吹打重悬细胞沉淀。
- 随后向每根管中加入 10 µL 蛋白酶 K，然后小心地将离心管放入 56 ºC 水浴中孵育 10 分钟。
- 10 分钟后，小心地从水浴中取出离心管，并向每根管中加入 100 µL 2.5 M NaCl。
- 牢固盖紧管盖，反复倒置数次以充分混匀。
- 接下来，标记一个 15 mL 圆锥形离心管为 +SDS，另一个为 -SDS。
- 将每根微量离心管中的内容物倒入对应的 15 mL 圆锥形离心管中。
- 从冰箱中取出一份 10 mL 的 100% 乙醇。
- 将一根圆锥形离心管倾斜持握，缓慢加入 1 mL 100% 乙醇，使其在管中原有液体上方形成一层。
- 对第二根圆锥形离心管重复此操作。
- 现在观察两根离心管。在乙醇层与下方水相层的界面处应出现丝状沉淀物，该丝状物质即为提取出的 DNA。拍摄管中 DNA 的照片，并在实验记录本中清晰记录观察结果，包括文字描述和示意图。
- 使用玻璃搅拌棒从 +SDS 管中挑取 DNA 并进行观察。对 -SDS 管重复此操作，同样记录观察结果。注意比较两根管中沉淀物的量是否存在差异，并思考其可能原因。
- 最后，将所有液体废弃物倒入适当的废液容器中，并将所有实验工具归还至实验室指定位置。
- 限制性内切酶虚拟酶切
- 为研究限制性内切酶的作用机制，首先访问新英格兰生物实验室（New England Biolabs）网站：https://www.neb.com/
- 该网站提供的资源允许研究人员在实际实验前进行虚拟实验。点击“Tools and Resources”以找到 NEBcutter 工具并启动程序。
- 在搜索框右侧找到“Viral + phage”列表，从中选择 Lambda。这是你将要进行酶切的 DNA 名称。在“the sequence is”处选择“Linear”选项，在“Enzymes to use”处选择“NEB enzymes”选项，然后点击 Submit。
- 下一页将显示 Lambda DNA 的完整限制性酶切图谱。该图谱可用于预测使用特定酶时的结果。接下来，点击“Main options”标题下的“Custom digest”。
- 搜索酶 StuI，注意其最适反应缓冲液为 buffer 2.1 或 CS buffer。选择 StuI 酶并点击 digest。
- 在下一个窗口中，点击“Main options”标题下的“View gel”。选择使用 pBR322-BstN1 酶切产物运行虚拟 1% 凝胶电泳的选项。
- 结果出现后，截取屏幕图像并粘贴至空白文档中。
- 之后，返回 NEBcutter 工具的主页面，选择“New custom digest”。
- 此次搜索 BsrGI 酶，注意其最适反应缓冲液为 buffer 2.1 或 buffer 3.1。选择该酶并点击 digest。
- 在“Main options”标题下点击“View gel”，选择使用 pBR322-BstN1 酶切产物运行虚拟 1% 凝胶电泳的选项。
- 截取结果图像并保存至文本文档中。
- 最后，重复上述步骤，将 StuI 和 BsrGI 两种酶同时用于一次酶切反应。
- 再次截取图像并保存所得凝胶图谱。
- DNA 分型
- 在开始限制性内切酶酶切前，先将 Lambda DNA、NEB buffer 2.1、StuI 酶和 BsrGI 酶的分装样品放入冰桶中，并带至工作区域。
- 标记一根离心管为 StuI，用于盛装 StuI 酶切反应体系。
- 标记另一根离心管为 BsrGI，用于盛装 BsrGI 酶切反应体系。
- 再标记一根离心管为 S+B，用于盛装两种酶共同作用的酶切反应体系。
- 使用适当的微量移液器，按照表 1 中列出的反应体系进行配制：点击此处下载表 1
- 首先，向每根离心管中加入 40 µL 水。
- 然后，每次使用新的移液枪头，向每根管中加入 5 µL buffer 2.1，并反复吹打混匀。
- 接下来，向每根管中加入 4 µL Lambda DNA，然后向相应管中分别加入 0.5 µL 的对应酶。
- 最后，向每根管中加入足量水，使总体积达到 50 µL。
- 接下来，将离心管置于 37 ºC 水浴中孵育 15 至 60 分钟，并将缓冲液和酶放回冰箱冷冻保存。
- 为准备用于电泳的琼脂糖凝胶，在 250 mL 锥形瓶中将 1 g 琼脂糖粉末与 100 mL TAE 缓冲液混合。
- 将溶液在微波炉中全功率加热约 90 秒，注意防止溶液沸腾溢出。
- 随后，使用手套或隔热垫小心地从微波炉中取出溶液，并静置冷却约 15 分钟。
- 在琼脂糖溶液冷却期间，设置好制胶模具。
- 当琼脂糖溶液冷却后，向其中加入 5 µL 10,000X SYBR Safe 凝胶染料。
- 将用于形成凝胶加样孔的梳子插入凝胶电泳装置的制胶模具中。
- 将琼脂糖凝胶溶液倒入制胶模具中，静置使其凝固。
- 待凝胶完全凝固后，垂直向上拔出梳子，并根据需要移除制胶模具两端的挡板。
- 将凝胶放入电泳槽中，使加样孔靠近负极（黑色电极），然后加入 1x TAE 缓冲液至完全覆盖凝胶。
- 从水浴中取出你的样品。
- 然后向每个样品中加入 8.3 µL 6X 上样染料。
- 向第一孔中加入 10 µL 含已知大小 DNA 片段的 pBR322-BstN1 酶切产物。
- 向第二孔中加入 25 µL StuI 样品。
- 向第三孔中加入 25 µL BsRGI 样品。
- 向第四孔中加入 25 µL S+B 样品。
- 为运行凝胶，将导线连接至电泳槽，再接入电源。红色正极应位于离加样孔最远的一端，黑色负极应靠近加样孔，因为样品将从负极向正极迁移。
- 打开电源，将电泳槽设置为 170 伏，运行约 60 分钟。
- 电泳结束后，关闭电源，断开电极与电泳槽的连接。
- 然后将凝胶从电泳槽中取出，使用紫外透射仪观察。注意：请佩戴护目镜或使用提供的防护罩，以保护眼睛免受紫外线伤害。
- 最后，使用手机相机从正上方平行于凝胶表面拍摄凝胶图像。
- 结果
- 将你在实验中运行的凝胶结果与 StuI 的虚拟酶切结果进行比较。
- StuI 的虚拟酶切产生七条条带。数出凝胶中 StuI 泳道的条带数量，并判断其是否与虚拟酶切结果一致或呈现相似模式。注意：琼脂糖凝胶电泳中的小分子量条带通常不可见。
- 现在观察 BsrGI 酶切的结果。BsrGI 的虚拟酶切产生六条条带。数出 BsrGI 泳道的条带数量，并判断虚拟酶切与实验酶切结果是否相同或相似。
- 最后，观察 StuI 和 BsrGI 联合酶切的虚拟结果。两种酶共同作用的虚拟酶切产生 12 条条带。数出凝胶中对应泳道的条带数量，并判断 DNA 条带模式是否与虚拟酶切结果相似。