酶活性
- 基础过氧化物酶实验
- 首先，必须确定过氧化物酶反应的基线。在一支干净的试管中加入 7 mL 蒸馏水，然后加入 0.2 mL 愈创木酚，配制底物。注意：愈创木酚是一种显色指示剂，随着酶反应的进行，溶液颜色逐渐变为更明显的黄色至橙色。
- 接下来，加入 0.3 mL 的 0.1% H2O2。
- 用记号笔标记试管底物，然后用封口膜覆盖试管。
- 固定盖子，将试管倒置四次以混匀管内物质。
- 在第二个试管中，加入 6.0 mL 蒸馏水和 1.5 mL 芜菁过氧化物酶，并将该试管标记为“Enzyme”。
- 用新的封口膜覆盖此离心管，并按照前述方法（步骤4）倒置混匀四次。
- 当两支试管均混合完毕后，将计时器放置在实验台面上，靠近试管架旁，然后小心地将底物管中的溶液倒入酶管中，注意避免液体溅出。
- 接下来，将酶管中的全部液体倒回底物管中，充分混合溶液，并用另一片封口膜覆盖底物管。
- 将试管放入试管架中，并启动计时器。
- 在混合后0、1、2、3、4和5分钟时观察底物管中的颜色变化。
- 为了量化颜色的相对变化及反应速率，将观察到的颜色与标准色卡中最接近的颜色进行比对。注：在每个取样点拍摄所观察颜色强度的照片，可能有助于更准确地记录结果。
- 在表格中记录你所看到的颜色。 点击此处下载表1
- 探究pH对过氧化物酶活性的影响
- 假设：本实验的假设是反应速率将在中性pH的中间范围内达到最大值或最适值，且这些速率将高于或大致等于基线速率。零假设是基线组与不同pH处理组之间的反应速率无差异。
- 首先，为六个 pH 缓冲液水平（3 - 8）和“Enzyme”标记六支干净的试管。
- 接下来，向每支试管中加入6 mL教师提供的相应pH缓冲溶液。
- 然后，向每支试管中加入1.5 mL辣根过氧化物酶，注意不要让滴管接触缓冲液而造成污染。
- 用封口膜盖住酶管，轻轻倒置每根管子以混匀管内物质。
- 如基线反应实验所述，通过加入7 mL蒸馏水、0.2 mL愈创木酚和0.3 mL 0.1% H2O2 至六个新的洁净试管中。
- 接下来，另取六支干净的试管，标记上pH值3至8以及“Solution”字样，并准备好计时器。
- 迅速操作，将底物管和pH管分别倒入对应的溶液管中。对每种不同的pH水平重复此步骤。
- 然后，用封口膜封住各管，并轻轻倒置混匀四次。每管混匀后，立即放入试管架中。
- 在0分钟时观察每支试管中的颜色，并立即启动计时器。此后每隔1分钟观察一次每支试管中的颜色，持续至5分钟。
- 在每个时间间隔，使用标准中的色码在表格中记录观察到的颜色。
- 探究温度对过氧化物酶活性的影响
- 假设：本实验的假设为，反应速率将在高于室温（23 °C）但低于酶变性温度的范围内达到最适值，且该最高速率将高于基础速率。零假设为，基础速率与不同温度处理之间的反应速率无显著差异。
- 取一个800 mL烧杯，装入约半杯冰，再倒入冷水，制成冰浴。将此烧杯标记为“冰”。
- 然后，标记四个新的600 mL烧杯，编号与底物试管的温度相同，并向每个烧杯中加入150 mL自来水。
- 使用加热板和温度计，将烧杯分别加热至其标签所示的 25、35、45 和 60 °C。
- 按照基线反应所述方法，再准备五对底物和酶反应管，在酶反应管中使用蒸馏水代替pH缓冲液。
- 将底物试管标记为“冰上”、“25 °C”、“35 °C”、“45 °C”和“60 °C”。
- 当所有水浴均达到相应温度后，将底物溶液与酶溶液混合：先将每个底物管中的内容物倒入对应的酶管中，再将酶管中的混合液倒回原底物管。
- 用封口膜覆盖底物管，并在0时刻观察颜色变化。
- 然后，根据每支试管标注的温度，将其放入相应的烧杯水浴中，并启动计时器。
- 每个1分钟间隔时，将试管从水中取出，以标准比色卡为参照记录其颜色。
- 然后，将它们放入各自的水浴中，直至记录完每个时间点，最长至5分钟。
- 结果
- 为确定反应的基线，绘制颜色强度随时间变化的曲线图。注：在5分钟时间段内颜色强度增加的单位数将作为反应的基线速率，用于相对比较。
- 将第一次实验中不同 pH 值下的颜色强度差异绘制成图。
- 加入基线作为对照，然后确定最佳反应速率是高于、低于还是等于基线。
- 利用该图表确定反应的最适pH值。注意：反应可能并非在所有pH条件下都会发生。过氧化物酶的最适pH值通常在6 - 7范围内。通过将酶暴露于不同pH水平的底物中，您会观察到当酶所处环境的pH值变得更偏碱性时，反应速率下降，表明酶的稳定性降低。
- 最后，以相同的基线作为对照，绘制第二次实验中不同温度下颜色强度随时间变化的差异图。
- 利用该图表确定反应的最适温度，并与基线进行比较。注意：反应可能不会在每个温度下都发生。在本实验中，反应在约 45 °C 时效率最高，超过此温度后，过氧化物酶开始发生变性。因此，在 60 °C 的烧杯中不应出现颜色变化。在冰浴中，反应速率也会减慢或停止，因为缺乏足够的能量使酶催化反应。