15.13: 互补DNA

“只有转录成信使RNA（mRNA）的基因才是活跃的或表达的。因此，科学家可以从细胞中提取mRNA来研究不同细胞和组织中的基因表达。科学家通过反转录将mRNA转化为互补DNA（cDNA）。由于mRNA不包含内含子（非编码区）和其它调控序列，cDNA与基因组DNA不同，它还允许研究人员直接确定由基因编码的肽的氨基酸序列。”

cDNA合成

cDNA可以通过多种方法产生，但通常的方法是首先从细胞中提取总RNA，然后从更为主要的类型; 转移RNA（tRNA）和核糖体（rRNA）中分离mRNA。成熟的真核生物mRNA有一个多聚(A)尾，即在其3末端添加一系列腺嘌呤核苷酸，而其它类型的RNA则没有。因此，一系列胸腺嘧啶核苷酸(oligo-dTs) 可以附着在诸如柱或磁珠之类的底物上，特别是与mRNA的多（A）尾碱基对。当带有聚 (A) 尾的mRNA被捕获时，其它类型的RNA被冲走。

接下来，逆转录酶是一种来自逆转录病毒的DNA聚合酶，用于从mRNA中生成cDNA 。由于与大多数DNA聚合酶一样，逆转录酶只能将核苷酸添加到链的3端，因此添加 poly(T)引物以结合(A)尾以提供cDNA合成的起点。 cDNA链以发夹环结尾。然后，RNA被降解，通常用碱处理或 RNAse 酶处理，使单链cDNA保持完整。

与cDNA互补的第二条DNA链随后由DNA聚合酶合成，通常使用第一条cDNA链的发夹环或mRNA的缺口片段作为引物。

由此产生的双链cDNA可以插入到细菌或病毒载体中，并使用标准的分子生物学技术进行克隆。还可以构建一个cDNA文库，代表兴趣的细胞或组织中的所有mRNA，以供进一步研究。

体内几乎每个细胞都有相同的脱氧核糖核酸， 但是不同的细胞类型 表达不同的基因， 因为每个细胞中只有某些基因 被转录成信使核糖核酸或姆纳。 在实验室中，姆纳可用作 合成互补脱氧核糖核酸，基因的模板， 以研究基因表达。 一种常见的方法是从细胞中提取核糖核酸， 然后通过将样品在连接了 一段胸腺嘧啶核苷酸的珠子柱上运行， 从而从其他类型的核糖核酸 中分离出姆纳。

它们结合到聚A尾部， 聚A尾部是真核姆纳的3个主要末端上 特异存在的腺嘌呤核苷酸链。 其他类型的核糖核酸不结合并被冲洗掉。 分离出姆纳后， 将聚T引物结合到聚A尾部， 为逆转录酶提供从姆纳 转录单链互补脱氧核糖核酸的起点。 然后添加诸如核糖核酸酶之类 的化学物质以降解核糖核酸。 然后，使用脱氧核糖核酸聚合酶 合成互补脱氧核糖核酸互补的链， 产生双链互补脱氧核糖核酸， 可将其插入细菌或病毒载体中， 并用于分子生物学研究。