薄层色谱法

来源：美国马萨诸塞州阿默斯特市马萨诸塞大学的 Lara Al Hariri 和Ahmed Basabrain

1. 流动相组成对化合物分离的影响展开

   在本实验部分，您将使用薄层色谱法（TLC）比较纯正己烷与60%正己烷和40%乙酸乙酯混合溶剂在分离苯酚、苯甲酸和丁基苯基醚方面的效果，通过测量各化合物在每种溶剂中迁移的距离来进行评估。

   • 实验开始前，穿上实验服，戴上护目镜和腈手套。注意：正己烷和乙酸乙酯均具有挥发性、毒性且易燃，因此必须在通风橱内操作。若手套沾上溶剂，应立即更换，因为正己烷和乙酸乙酯可在数分钟内渗透腈手套。
   • 取一张纸巾铺在实验台面上，使用镊子夹住薄层板的一端小心拿起。注意：始终用镊子夹住薄层板边缘或顶端，以避免损坏或污染硅胶层。
   • 检查硅胶层是否有缺口或划痕，如有必要请更换新板。若仅一端有轻微缺损，可将其作为顶部，不影响使用。
   • 将薄层板置于通风橱内的纸巾上，并在其旁放置一把公制刻度尺。使用石墨铅笔在距板底约1 cm处的硅胶层上轻轻做一标记，并在标记上方写上“100”。
   • 接着，在板底部两侧距底边1 cm处轻轻做标记，并用铅笔仔细连接两标记画出起始线。
   • 然后，在起始线上均匀间隔地添加三个小标记，两侧标记距板边缘至少0.5 cm。注意：此处硅胶层必须保持完好，若用铅笔划伤，应重新准备一块新板。
   • 现在，在实验记录本上精确描摹薄层板轮廓，并复制板上的所有标记。将三个标记分别标注为“苯酚”、“苯甲酸”和“丁基苯基醚”。您也可在薄层板上直接标注这些标记。
   • 以相同方式准备第二块标有“60/40”的薄层板。随后，将标记好的薄层板带至公共实验台，找到乙醇中浓度为1 mg/mL的苯酚、苯甲酸和丁基苯基醚溶液。
   • 将一根洁净的毛细管插入三种溶液之一中，然后短暂而轻柔地将毛细管垂直点在起始线与对应化合物标记的交点处。每种化合物需点样两次。
   • 使用同一根毛细管在第二块薄层板上点加相同溶液。斑点直径不得超过2 mm。随后丢弃毛细管并盖好试剂瓶。
   • 使用洁净的毛细管以相同方式点加其余两种溶液。注意避免溶液交叉污染。注意：若斑点颜色过浅或过小，应等待其干燥后，在干燥斑点上重复点样。若斑点仍湿润，毛细作用可能导致其扩散过宽并稀释。
   • 完成每块板上三个斑点的点样后，丢弃毛细管并将薄层板带回通风橱。保持薄层板平放直至干燥。
   • 现在，标记一个50 mL广口瓶为“100%正己烷”，并将该瓶、瓶盖和10 mL量筒带至溶剂通风橱。
   • 用量筒量取2–3 mL纯正己烷，倒入广口瓶中，使液面深度达0.62–0.7 cm。盖好瓶盖和瓶盖后返回通风橱。
   • 标记第二个50 mL广口瓶为“60%正己烷，40%乙酸乙酯”，并将其与洁净量筒带至溶剂通风橱。量取2–3 mL 60/40混合液倒入瓶中后返回通风橱。
   • 将薄层板立于广口瓶旁，比较溶剂液面与斑点的相对位置。每块板的溶剂液面应低于斑点。
   • 取三张滤纸，将每张滤纸竖直贴靠在每个广口瓶内壁，然后紧密盖上瓶盖。
   • 在每块板的标记上方签名，以便后续识别。确认广口瓶内的滤纸已充分浸润溶剂，且板上斑点已完全干燥。
   • 现在，打开100%正己烷广口瓶，用镊子轻轻将标有“100”的薄层板放入瓶中，保持板面水平进入溶剂。小心关闭瓶盖，避免晃动薄层板。
   • 保持广口瓶静止，让溶剂沿板向上展开。在纯正己烷中展开通常需要约7–10分钟。密切观察薄层板，确保溶剂前沿不触及板顶。
   • 当纯正己烷的溶剂前沿距板顶约1 cm时，用镊子取出薄层板。将其硅胶面朝上平放在纸巾上，并迅速用铅笔在整个板上画线标记溶剂前沿。保持薄层板平放，待溶剂挥发。
   • 以相同方式将另一块板放入60/40洗脱液中。待60/40板的溶剂前沿距板顶约1 cm时，取出并迅速以同样方式标记溶剂前沿。
   • 待100%正己烷板完全干燥后，用镊子夹起，携带铅笔前往公共实验台的紫外灯处。
   • 将薄层板置于紫外灯下，用紫外光照射。由于硅胶层中含有荧光指示剂，板面会发出绿色荧光，而暗斑即为化合物所在位置。
   • 用铅笔仔细描出每个斑点的轮廓，即使其迁移距离很短。
   • 随后关闭紫外灯，将薄层板带至碘显色通风橱。打开碘显色室，用镊子将薄层板竖直放入碘显色室中，再盖上盖子。
   • 等待3–4分钟，使碘蒸气与斑点充分作用。然后用镊子取出薄层板，关闭显色室，并用铅笔描出板上的棕黄色斑点。这些斑点会逐渐褪色，因此需迅速标记。
   • 以相同方式在紫外光下观察干燥的60/40板，再用碘蒸气显色。注意：为避免副反应，应始终先在紫外光下检查薄层板，再暴露于碘蒸气中。
   • 现在，将斑点和溶剂前沿精确复制到实验记录本中对应的薄层板图示上。对每块板，测量并记录溶剂前沿相对于起始线的高度。
   • 最后，测量每个斑点中心到其起始线的距离，并在实验记录本中记录。现在您可以进入实验的下一部分。
2. 未知化合物鉴定展开

   在实验的第二部分，您将使用薄层色谱法（TLC）鉴定一种未知止痛药的成分。该样品可能含有一种或多种以下化合物：阿司匹林、咖啡因和对乙酰氨基酚。这些化合物极性较强，因此您将使用预先配制的90%乙酸乙酯和10%正己烷混合液作为洗脱剂。

   您将在同一块薄层板上同时运行三种标准品和未知样品。之后，您将利用标准品的Rf值来鉴定未知成分。开始前，请先确认您被分配分析的未知样品编号。

   • 现在，在通风橱内铺一张洁净纸巾，并取一块新的薄层板。以与之前相同的方式制备顶部标记和起始线。在板上均匀标记四个点，确保两侧标记距板边缘至少0.5 cm。
   • 在实验记录本中精确绘制该薄层板图示，并将标记点分别标注为“阿司匹林”、“对乙酰氨基酚”、“咖啡因”和“未知”。
   • 现在，将薄层板带至公共实验台。使用洁净毛细管，将阿司匹林、对乙酰氨基酚、咖啡因以及您被分配的未知样品溶液分别点在对应的标记位置上。注意：点加未知样品溶液时，不要将毛细管插入过深，以免未知物中的不溶性物质堵塞毛细管。
   • 点样完成后，丢弃毛细管并盖好试剂瓶，再将薄层板带回通风橱。将板置于纸巾上继续干燥。
   • 接下来，标记一个洁净的50 mL螺口瓶为“90%乙酸乙酯，10%正己烷”，并将其与洁净量筒一起带至溶剂通风橱。
   • 向瓶中加入2–3 mL 90/10混合液后返回通风橱。确认溶剂液面将低于板上斑点。然后，在瓶内竖直放入一张洁净滤纸，并紧密盖上瓶盖。
   • 待薄层板干燥且滤纸充分浸润后，小心将板放入溶剂中。注意：此步骤中必须保持薄层板水平。若溶剂前沿呈对角线状，则各斑点迁移距离将不同，导致无法通过视觉比较未知斑点与标准斑点。
   • 等待溶剂前沿距板顶约1 cm时，取出薄层板，标记溶剂前沿，并平放晾干。
   • 板干燥后，依次用紫外光和碘显色室观察，并用铅笔描出斑点轮廓。
   • 未知样品可能是多种化合物的混合物，因此请仔细检查是否出现与全部三种标准斑点位置对应的斑点。
   • 随后，将斑点精确复制到实验记录本中的薄层板图示上。测量并记录溶剂前沿及各斑点相对于起始线的高度。
   • 完成后，从广口瓶中取出已浸润溶剂的滤纸，置于通风橱内晾干。
   • 将剩余溶剂倒入标准有机废液桶，按实验室常规方法清洗玻璃器皿，并收拾实验仪器。
   • 根据薄层板背衬材料的不同，将使用过的薄层板丢弃至实验室垃圾桶或玻璃废弃物容器中。
   • 最后，待滤纸干燥后，将其与其他废弃物一并丢弃。
3. 结果展开
   • 计算使用100%正己烷洗脱的苯酚、苯甲酸和丁基苯基醚的R_f值。对薄层板上的每种化合物，测量其斑点中心到起始线的距离，再除以溶剂前沿到起始线的距离。
   • 仅丁基苯基醚从起始线迁移了可测量的距离，这与其极性最低的性质一致。为实现有效分离，R_f值应相差0.3–0.7。因此可推断，苯酚和苯甲酸极性太强，无法被正己烷等非极性溶剂有效分离。
   • 计算在60/40正己烷与乙酸乙酯混合液中展开的薄层板的R_f值。乙酸乙酯为中等极性溶剂，因此化合物在板上迁移得更远且间距更大。
   • 分离顺序表明，极性最强的苯甲酸对硅胶的亲和力最高，而极性最弱的丁基苯基醚对硅胶的亲和力最低。这与“极性较低的化合物在极性固定相上迁移更远”的假设一致。
   • 观察第三块板，计算阿司匹林、对乙酰氨基酚和咖啡因的R_f值。其中极性最强的咖啡因迁移距离最短，对乙酰氨基酚次之，而极性最弱的阿司匹林迁移距离最长。
   • 最后，通过将未知样品的斑点与三种标准斑点进行比较，鉴定未知样品中的化合物。