染料的紫外-可见光谱分析

来源：美国马萨诸塞大学阿默斯特分校的 Lara Al Hariri 和 Ahmed Basabrain

1. 吸收波长比较展开

   在实验的第一部分，你将使用紫外-可见光吸收光谱法（UV-Vis 吸收光谱法）分析荧光素、β-胡萝卜素和靛蓝染料的吸收特性。进行 UV-Vis 光谱分析时，需将溶液置于光源与光电探测器之间。分子会吸收与其电子跃迁所需能量相对应波长的光，而其余光线则被散射或透射。

   吸收光谱反映了到达探测器的各波长光子数量的变化。吸光度越高，表示该波长下被检测到的光子越少。你将首先测量纯溶剂的光谱，仪器会从染料溶液的光谱中扣除该信号，从而仅显示染料的吸光度数据。这种参比称为溶剂空白。

   • 开始前，请穿上实验服、戴上护目镜和手套。注意： β-胡萝卜素和靛蓝溶液分别使用正己烷和二甲基甲酰胺（DMF），因此你需在通风橱内操作染料。DMF 和正己烷会降解薄型腈手套，若手套沾上溶剂，请立即更换。
   • 现在取一个干净的石英比色皿。比色皿通常有两个透明面和两个磨砂或不透明面。始终用手指捏住磨砂面，以保持透明面清洁。
   • 首先，你将分析水中的荧光素溶液。为制备溶剂空白，将去离子水注入比色皿至约 3/4 满。
   • 然后，用实验室擦拭纸清洁比色皿的透明面。检查比色皿中是否存在气泡，并轻轻敲击以去除气泡。
   • 接着，将比色皿带至分光光度计处。打开样品室，最后一次清洁比色皿。指纹和灰尘可能吸收或反射光线，从而引入数据误差。
   • 现在将比色皿插入样品架，使透明面与光路对齐。完全关闭样品室门。按照分光光度计软件的说明，设置 200–800 nm 范围内的吸光度扫描，并将该比色皿作为溶剂空白进行扫描。
   • 扫描完成后，倒空比色皿，并用压缩空气吹去较大的水滴。
   • 然后将其带至共用通风橱，使用干净的巴斯德移液管将提供的 3 µM 荧光素溶液注入比色皿至约 3/4 满。
   • 检查比色皿中是否有气泡，并在必要时去除，然后将其带至分光光度计。放置比色皿前，务必最后一次清洁其透明面。随后，将比色皿作为样品进行扫描。
   • 扫描完成后，确定荧光素吸收的波长。吸光度最高的波长称为 λ_max。
   • 在实验记录本中记录吸收峰的波长及整体吸收范围，然后保存数据。

     表 1：染料的吸光度与 λ_max

     	吸收范围 (nm)	λmax (nm)
     荧光素
     β-胡萝卜素
     靛蓝

     点击此处下载表 1
   • 现在将比色皿中的溶液倒入水相废液瓶，并用水冲洗以去除残留的荧光素。
   • 接下来你将分析 β-胡萝卜素，因此需要制备正己烷溶剂空白。在注入纯正己烷至比色皿约 3/4 满前，先用正己烷冲洗比色皿数次以去除残留的水。
   • 去除气泡，清洁比色皿表面，并将其放入分光光度计。确保扫描设置为 200–800 nm 范围内的吸光度测量，然后将比色皿作为溶剂空白进行扫描。
   • 扫描完成后，将比色皿中的溶液倒入有机废液瓶，并用压缩空气吹干。
   • 使用干净的移液管将提供的 3 µM β-胡萝卜素溶液注入比色皿至约 3/4 满，然后返回分光光度计。
   • 清洁比色皿的透明面，将其放入分光光度计，并作为样品进行扫描。在实验记录本中记录各吸收峰的波长，并保存数据。
   • 现在分析靛蓝染料。靛蓝溶液溶于 DMF，因此将比色皿中的溶液倒入有机废液瓶，并用纯 DMF 冲洗以去除残留的 β-胡萝卜素和正己烷。
   • 将纯 DMF 注入比色皿至约 3/4 满，放入分光光度计，并确保扫描设置与之前相同。运行溶剂空白扫描，然后将比色皿中的溶液倒入有机废液瓶，并用压缩空气吹干。
   • 使用干净的移液管将提供的 3 µM 靛蓝染料溶液注入比色皿至约 3/4 满，并作为样品进行扫描。记录吸光度信息并保存数据。
   • 最后，将比色皿中的溶液倒入有机废液瓶，并用丙酮冲洗。
2. β-胡萝卜素标准曲线展开

   在实验的第二部分，你将使用 UV-Vis 光谱法通过测量 5 种不同浓度的 β-胡萝卜素溶液的吸光度，建立吸光度强度与 β-胡萝卜素浓度之间的关系。这将使你能够绘制吸光度与 β-胡萝卜素浓度的标准曲线，并推导出描述该关系的方程。

   • 首先，在实验记录本中建立一个表格，包含 β-胡萝卜素浓度和 450 nm 处吸光度两列。

     表 2：β-胡萝卜素的吸光度

     测试	浓度 (µM)	λmax 处吸光度 (450 nm)
     1	1.9
     2	3.7
     3	7.5
     4	11
     5	15

     点击此处下载表 2
   • 然后，取一个干净的比色皿，注入正己烷至约 3/4 满，作为溶剂空白。
   • 去除任何气泡，清洁比色皿的透明面，并将其放入分光光度计。设置 200–800 nm 范围内的吸光度扫描，并将比色皿作为溶剂空白进行扫描。
   • 扫描完成后，将比色皿中的溶液倒入有机废液瓶，并用压缩空气吹干。
   • 然后，使用干净的移液管将浓度最低的 1.9 µM β-胡萝卜素溶液注入比色皿至约 3/4 满。
   • 清洁比色皿表面，将其插入分光光度计，并作为样品进行扫描。
   • 扫描完成后，读取 450 nm 处吸收峰的吸光度值。在实验记录本中记录该值作为 1.9 µM 溶液的吸光度。
   • 现在将比色皿中的溶液倒入有机废液瓶，用正己烷冲洗，并用压缩空气吹干。
   • 使用干净的移液管将 3.7 µM β-胡萝卜素溶液注入比色皿至约 3/4 满。清洁比色皿表面，插入分光光度计，并作为另一个样品进行扫描。
   • 扫描完成后，记录 450 nm 处吸收峰的吸光度。对剩余溶液重复此操作，按浓度从低到高依次进行。完成后保存数据。
   • 最后，将比色皿中的溶液倒入有机废液瓶，并用丙酮清洗。
3. 结果展开

   首先观察三种染料的光谱。水中的荧光素吸收蓝光和紫光，最大吸收波长为 490 nm。它不吸收红光，仅部分吸收黄光和绿光。与此一致，固态荧光素呈红色，而荧光素溶液通常呈黄色至绿色。

   β-胡萝卜素也吸收蓝光和紫光。β-胡萝卜素在正己烷中的最大吸收波长为 450 nm，在 478 nm 处还有一个明显的吸收峰。对紫光的强烈吸收是 β-胡萝卜素呈橙色的原因之一。

   DMF 中的靛蓝吸收紫外光以及红光、橙光和黄光，在 611 nm 处有明显吸收峰。因此，靛蓝染料主要反射蓝光和紫光，呈现出其特有的颜色。

   • 现在绘制 β-胡萝卜素浓度的标准曲线。将实验第二部分测得的 450 nm 处 β-胡萝卜素吸光度值对溶液浓度作图。
   • 然后拟合趋势线，求得拟合数据的线性方程。根据比尔-朗伯定律，在该方程中，y 表示吸光度，x 表示浓度，斜率是摩尔衰减系数与光程长度的乘积。
   • 检查你的方程。将其重排以求解浓度，并代入实验第一部分测得的 450 nm 处 β-胡萝卜素吸光度值。计算出的浓度应接近 3 µM/L。