JoVE Core
Molecular Biology
Chapter 7: DNA Repair and Recombination
7.16:
保守的位点特异性复合和相变
由于 DNA 片段以特定方向的方式进行切割和重组,因此位点特异性重组已成为一种有效的基因工程技术。Flippase 和 Cyclization 重组酶或 Flp 和 Cre 分别是源自噬菌体的酪氨酸重组酶家族的两个成员,用于介导哺乳动物细胞系中蛋白质的位点特异性 DNA 插入、缺失和靶向表达。
Cre 重组酶的识别位点称为 LoxP 位点,长度约为 34 个碱基对。LoxP 位点包含 13 bp 回文序列,这意味着核苷酸序列在 5′ 至 3′ 和 3′ 至 5′ 方向上的读数相同。由 Cre 重组酶介导的位点特异性重组是用于制造具有获得性突变的转基因小鼠的最常用方法之一。将 Cre 重组酶的热稳定变体与组织特异性启动子结合使用,可以对 Cre 重组酶的表达和作用进行空间控制。例如,将肾脏特异性钙粘蛋白启动子置于 Cre 基因的上游,可以使酶仅在肾组织中表达。为了暂时控制 Cre 重组酶活性,酶基因与配体结合域融合,使酶仅在特定配体存在下表达。
使用位点特异性重组作为基因组编辑工具的一个主要限制是,必须首先插入一个或多个重组靶位点,或者必须偶然存在。如果可以预先选择与酶识别位点一致的基因组位点,则重组酶可以以”定制”靶标特异性使用。最近的研究使用诱变和基因改组来设计 Flp 变体,这些变体可以在功能上识别具有组合突变的位点。该结果为基因改组的未来迭代带来了希望,可以产生更特异性的 Flp 变体,并且可以在商业上用作工程大型基因组的分子工具。
位点特异性重组是一种遗传交换,其中称为位点特异性重组酶的特殊酶催化 DNA 片段在具有某种序列同源性的特定位点之间的移动。
当发生此类运动时,要交换的区域通常两侧是一对对称序列,该序列由大约 20 至 30 个碱基对长的双链 DNA 组成。
与这些序列结合的称为重组酶的特殊酶可以属于丝氨酸或酪氨酸重组酶家族。这些家族在酶的活性位点具有丝氨酸或酪氨酸残基,并采用不同的机制。
在丝氨酸重组酶的情况下,亚基首先特异性结合其新的识别序列,形成突触复合物。然后,活性位点丝氨酸攻击这些序列中心的磷酸二酯 DNA 骨架,产生称为交叉位点的断点。
接下来,丝氨酸重组酶将在链交换进行之前切割所有涉及的 DNA 螺旋。
相比之下,酪氨酸重组酶以相同的方式结合,但一次切割并连接 DNA 双链体的一条链。然后,酪氨酸残基与裂解链的 3′ 末端共价结合,而游离的 5′ 羟基攻击蛋白质-DNA 键,形成 Holliday 连接中间体。
此复杂模式是第一个交叉事件。然后,当剩余的 DNA 链在第二个事件中被重组酶亚基切割和交换时,Holliday 连接被分解为重组产物。
像这样的重组事件有三种可能的结果。
第一种是整合,其中环状 DNA 分子入第二个线性 DNA。
当两个位点位于同一 DNA 分子上时,第二个结果可能是切除,其中 DNA 切割的部分被简单地去除,可以自由整合到基因组的其他位置。
在第三种情况下,如果切口部位位于相反的方向,则可能会发生倒置 – DNA 部分被去除,然后以相反的方向重新整合。
这种现象的一个经过充分研究的例子是沙门氏菌染色体片段的位点特异性倒置,这使它能够根据环境产生两种不同类型的蛋白质鞭毛蛋白,这个过程称为相位变异。
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