RACE - cDNA 末端快速扩增

首次发现新的 mRNA 基因转录本时，未必总能获得全长 cDNA。mRNA 模板末端的未知序列可能导致 cDNA 克隆不完整。

这些部分cDNA的序列可以通过一种称为cDNA末端快速扩增（RACE）的技术进行延伸，从而获得该转录本的完整cDNA。

在此技术中，采用锚定PCR从已知的内部位点克隆至mRNA的3'端或5'端缺失的序列。

在3’ RACE中，以mRNA为模板，利用逆转录酶和一种由寡聚dT序列与一个称为锚定序列的特异性核苷酸序列连接而成的杂合引物合成cDNA。

寡聚-dT 结合成熟 mRNA 3’端的多聚A尾，而引物的锚定部分则在新合成的第一条 cDNA 链的多聚T序列上游添加一组独特的核苷酸。

使用一种基因特异性引物（GSP），该引物可与cDNA序列的已知末端配对，用于合成第二条DNA链。将新合成的DNA变性后，利用与锚定序列互补的接头引物和GSP 进行多轮PCR，以填补并扩增缺失的3’序列。

在5’ RACE中，基因特异性引物在反转录过程中结合mRNA的3’端。然后，利用末端脱氧核苷酸转移酶在生成的cDNA的3’端添加poly-A尾。

逆转录完成后  使用带有寡聚dT和锚定序列的接头引物合成互补链。  然后使用基因特异性引物和接头引物对完整的cDNA序列进行复制和扩增。

在两种类型的RACE中，接头引物仍可能结合并扩增非靶标cDNA。

因此，使用结合于第一轮 PCR 引物下游的巢式引物进行第二轮扩增循环。这可以增加特异性全长 cDNA 的产量。