二代测序

下一代测序是一组技术的统称，可相对快速地从许多不同物种或个体群体中生成序列数据。

这些数据可用于精细尺度的群体遗传学或临床研究，且这些技术比传统测序方法更快、更具成本效益。

目前有许多下一代测序方法，但其中最流行的是可逆终止子测序法。其他方法包括焦磷酸测序法和连接测序法。

在可逆终止子测序中，首先将纯化的基因组DNA切割成100-1000个碱基对的小片段。然后通过连接将带有引物结合位点的特殊接头——即寡核苷酸序列——连接到这些DNA片段的两端。

随后将单链DNA片段加载到一种称为流动池的特殊芯片上，该芯片预先包被有与接头序列互补的短寡核苷酸序列。DNA片段通过其接头与芯片结合。

在扩增阶段，使用DNA聚合酶合成互补的DNA链。双链DNA被变性后，原始模板被洗脱去除。

随后，剩余的互补链发生弯曲，并利用另一端的第二个接头形成类似桥的结构。

DNA聚合酶随后可以合成弯曲DNA链的互补链——这一过程称为桥式扩增。

双链桥再次变性，生成线性单链DNA，随后可在芯片上形成新的桥结构。

DNA聚合酶持续进行这些桥式扩增循环，合成数千份DNA片段的拷贝，从而产生克隆簇。

随后将所有反向互补链从芯片上洗脱，仅留下正向DNA链固定在芯片上。

测序反应起始于DNA聚合酶添加带有四种不同荧光标记的修饰dNTP。这些dNTP还包含一种称为可逆终止子的3’阻断基团，该基团仅允许每次添加一个dNTP。

每轮向延伸链中添加 dNTP 后，对芯片进行成像，通过每个 DNA 簇的发射波长来确定碱基种类。

在每次添加dNTP后捕获的流动池荧光图像序列用于确定DNA片段的序列。