16.12: 原位杂交

原位杂交 (ISH) 是一种使用标记探针检测和定位细胞、组织或组织切片中特定 DNA 或 RNA 分子的技术。 该技术于 1969 年首次用于核酸研究。 目前它是科学研究和临床环境中的重要工具，特别是用于诊断目的。

探针和标签的类型

探针是 DNA 或 RNA 的互补链，可与细胞中相应的核苷酸序列结合。 原位杂交中使用许多不同的探针，例如单链DNA探针、双链DNA探针、反义RNA探针或核糖探针、以及合成的寡脱氧核苷酸探针。 探针的选择取决于几个因素，包括其灵敏度、特异性、稳定性以及穿透组织样本的难易程度。

这些探针可以用放射性同位素、荧光染料或其他抗原分子标记以用于检测目的。 3H、35S和32P是广泛使用的放射性标记探针，而非放射性标记包括生物素、地高辛和荧光素。 这些标记可以通过末端标记、切口平移或随机引物合成方法附着到探针 DNA 分子上。 放射自显影、荧光显微镜或免疫组织化学等检测方法用于基于附着在杂交探针上的标记来实现目标可视化。

原位杂交的优点和缺点

原位杂交的主要优点之一是它甚至可以应用于冷冻组织，从而最大限度地利用难以获得的组织。 此外，它还可以与免疫组织化学等其他技术相结合，检测样品中的蛋白和活性mRNA。 然而，在处理 DNA 和 RNA 拷贝数较低的样品时，使用原位杂交可能很难识别目标。

原位杂交是一种用于在培养细胞或化学保存的组织切片中定位 DNA 或 RNA 的技术。

RNA 原位杂交用于通过检测和定量特异性 mRNA 转录本来监测基因的表达位置。

靶标 mRNA 由单链互补 RNA 探针检测，这些探针由 DNA 模板的体外转录产生或通过化学反应合成。

探针用放射性同位素、荧光团或其他报告分子（如生物素或地高辛）标记，这些分子可以被标记的抗体结合和检测。

RNA 原位杂交有四个主要步骤:组织固定、透化、杂交和检测。

首先，收获新鲜组织并进行化学处理，以阻止组织内的任何生化反应并保持其结构完整性。这种保存技术称为组织固定。

接下来，需要去除组织中的蛋白质和脂质，以便探针能够进入并结合靶 RNA。

为了降解蛋白质并透化细胞膜，样品用 0.2 摩尔盐酸和蛋白酶等酶处理，同时使用去污剂分解脂质。

然后在略低于 RNA-探针杂交物熔点的温度下将靶 RNA 与探针杂交。这有助于探针与互补的 mRNA 退火。通过进行几次洗涤来去除未结合和松散结合的探针。

检测杂交探针的方法取决于标记的类型。放射性探针暴露在照相胶片中，而荧光探针在荧光显微镜下可见。

对于其他标记，针对报告分子的抗体用荧光或比色染料标记。

杂交探针的检测揭示了特异性 mRNA 的分布，表明目标基因的表达位置。