16.15: 核糖体分析

核糖体分析或核糖测序是一种深度测序技术，可生成细胞中活跃翻译的快照。 它选择性地对受核糖体保护的 mRNA 进行测序，以深入了解细胞在任何给定时间点的翻译情况。

核糖体分析的应用

核糖体分析有许多应用，包括体内监测特定器官或组织类型内的翻译以及量化新的蛋白合成水平。

该技术有助于识别翻译的开放阅读框并发现新的翻译产物，包括短肽和具有未知功能的特征蛋白的亚型。 核糖体分析还有助于识别细胞中的几种 mRNA，这些 mRNA 在收到外部信号之前不会被翻译。

核糖体分析的技术挑战

核糖体分析面临许多技术挑战，例如需要大量样本、及时抑制翻译的可靠性以及 RNA 污染。

闪冻技术可以克服快速翻译抑制的挑战。 与翻译延伸抑制剂（例如放线菌酮）相比，它有助于有效捕获细胞内核糖体的分布。

与 mRNA 结合的核糖体 RNA (rRNA) 通常在核糖体分析过程中被去除。 然而，有时仍然观察到一些 rRNA 污染物。 研究人员使用双链体特异性核酸酶 (DSN) 来减少 rRNA 污染，该酶从堪察加蟹的肝胰腺中分离出来，可切割 dsDNA 和 DNA-RNA 杂交体。 该方法通常还用于在下一代测序之前对 cDNA 文库进行标准化以及从 RNA-seq 文库中耗尽 rRNA。

核糖体分析的另一个限制是分析数据，这需要正确的生物信息学专业知识。 R 软件包 riboSeqR 用于解决这个问题，它提供了解析多个样本的核糖体分析数据的方法。

识别基因组中转录并翻译成蛋白质的区域是了解基因组及其表达的关键步骤。

这是通过一种称为核糖体分析的技术实现的，也称为核糖体分析。它绘制核糖体在 mRNA 上的位置并识别被积极翻译成蛋白质的 mRNA。

为了分离 RNA，必须首先裂解细胞以进入其中的分子。然后用 RNase 处理裂解物。这些酶切割未被核糖体覆盖的 mRNA，只留下受保护的 mRNA 片段。

然后使用蔗糖梯度将核糖体保护的片段与未受保护的裂解片段分离。

然后从 mRNA 片段中去除核糖体，并使用逆转录酶通过 RT-PCR 将 RNA 转化为 DNA。

接下来，对 DNA 进行测序并定位在参考基因组上。这决定了核糖体沿每个 mRNA 的确切位置。

核糖体分析还有助于识别无法识别的开放阅读框或 ORF。ORF 是起始密码子和终止密码子之间的 DNA 区域，可以翻译成蛋白质。寻找 ORF 有助于鉴定新基因。

考虑哺乳动物细胞系中基因表达模式的研究。实验程序包括将细胞暴露于可能打开基因表达并启动 mRNA 合成的刺激下。

使用核糖体分析鉴定被积极翻译的 mRNA。

该实验表明，基因 B 正在被翻译，而基因 A 和 C 没有。

它还显示基因组中另一个大约 100 个核苷酸长的小区域正在被积极翻译。

这个未识别的区域是一个开放的阅读框，可能编码一种被实验刺激上调的新型蛋白质。