线虫同步化：获得处于相同发育阶段的线虫群体的方法

摘要

来源：Sarasija, S. 和 Norman, K. R. 完整细胞中氧气消耗速率的测定 秀丽隐杆线虫. J. Vis. Exp. (2019).

在本视频中，我们展示了一种获得发育同步的无菌成年秀丽隐杆线虫（C. elegans）群体的方法。示例实验方案通过同步线虫以研究活体动物的耗氧速率。

方案

本方案节选自 Sarasija 和 诺曼, 完整细胞中氧气消耗速率的测定 秀丽隐杆线虫， J. Vis. Exp. (2019).

1. 线虫群体的培养与同步化

这些动物在约 42 小时后将发育至 L4 幼虫阶段。此时，使用铂金接种针将 L4 幼虫转移至接种了 OP50 并含有 0.5 mg/mL 5-氟-2'-脱氧尿苷（FUdR）的 NGM 平板上，以防止其产生后代。
注意 确保在同一实验中所有品系的同步化时间相近。FUdR 处理可使动物不育，从而阻止产卵和后代产生，否则可能影响耗氧率（OCR）。这些不育的动物将在次日（约 66 小时的第 1 天成虫）用于检测。已有报道指出，FUdR 可能影响某些突变型线虫的生理状态和寿命，因此在使用该药物进行不育处理时应考虑这一因素。线虫也可通过雌性化突变（如 fem-1(hc17) 或 fem-3(e2006)）实现不育，但这些突变可能影响线粒体功能。

1. 将所需遗传背景的L4期幼虫（例如N2［野生型］和sel-12动物）转移至线虫生长培养基（NGM）平板上（参见 表1 用于配方）新鲜涂布形成菌苔的 大肠杆菌 (OP50)。每种菌株至少使用两个100 mm或三个60 mm培养皿。将线虫在适宜的生长温度（15–25 °C）下培养3–4天，或直至培养皿中出现大量虫卵和成年雌性线虫。
2. 用约 6 mL M9 缓冲液冲洗培养板上的卵和线虫（参见 表1 每100 mm培养皿的线虫加入适量配方缓冲液，用玻璃巴斯德吸管将线虫转移至对应菌株的15 mL离心管中。以6,180 x g离心3分钟，吸除M9缓冲液，仅保留线虫和虫卵沉淀。
3. 加入3–4 mL漂白剂溶液（参见 表1 将配方所需试剂加入各管，间歇性涡旋振荡6分钟。加入M9缓冲液至每管满管，于6,180 × g离心1分钟，吸除上清液。用M9缓冲液重复洗涤三次，将虫卵沉淀转移至一支新的15 mL离心管中，管内预先加入约9 mL M9缓冲液。
4. 将新孵化的线虫在20 °C下振荡同步16–48小时。以6,180 x g离心1.5分钟，将同步化的L1期动物转移至分别接种了OP50菌苔的新鲜NGM平板上（每块100 mm平板约6,000–10,000只动物），于20 °C培养。

结果

表1：NGM平板、M9缓冲液和漂白液的配制配方。

...

M9 缓冲液（1 L）
dH₂O	1,000 mL
NaCl	5 g
KH₂PO₄	3 g
Na₂HPO₄	6 g

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm；60 mm 培养皿	Kord-Valmark Labware Products	2900; 2901
15 mL 圆锥形离心管	Corning	430791
50 mL 圆锥形离心管	Corning	430829
琼脂	Fisher Scientific	BP1423-2
蛋白胨（Bacto peptone）	BD; Bacto	211677
胰蛋白胨（Bacto tryptone）	BD; Bacto	211705
酵母提取物（Bacto yeast extract）	BD; Bacto	212705
次氯酸钠溶液（漂白剂）	通用
二水合氯化钙（CaCl2·2H2O）	Fisher Scientific	C79-500
胆固醇	Fisher Scientific	C314-500
去离子水（dH2O）
玻璃巴斯德吸管	Krackeler Scientific	6-72050-900
七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O）	Fisher Scientific	BP213-1
磷酸氢二钾（K2HPO4）	Fisher Scientific	BP363-1
磷酸二氢钾（KH2PO4）	Fisher Scientific	P285-500
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-10
氢氧化钠（NaOH）	Fisher Scientific	BP359-500
无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）	Fisher Scientific	BP332-1