从细胞系生成球状体：一种三维（3D）细胞培养方法

摘要

来源：Dillard, P. 等。CAR T 细胞介导的类球体杀伤实验。J. Vis. Exp. (2018)。

类球体是一种三维细胞培养模型，与二维细胞培养单层模型相比，能够更准确地模拟细胞的生存环境。在本示例实验方案中，我们将看到科研人员利用结直肠癌细胞系生成类球体，并通过活细胞成像技术追踪类球体的生长过程。

方案

1. 结直肠癌细胞系类球体的生成

1. 用磷酸盐缓冲液（PBS；25 cm² 培养瓶用 5 mL，75 cm² 培养瓶用 10 mL）洗涤 HCT 116（稳定转导表达分化簇 19（CD19）和绿色荧光蛋白（GFP））细胞单层。加入胰蛋白酶（25 cm² 培养瓶加 0.5 mL，75 cm² 培养瓶加 1 mL），于 37 °C 孵育 5 分钟。
2. 在显微镜下检查细胞脱落情况，并用完全 Roswell Park Memorial Institute 1640 培养基（RPMI 1640）（RPMI 1640 + 10% FCS + 庆大霉素；25 cm² 培养瓶用 10 mL，75 cm² 培养瓶用 20 mL）中和细胞解离酶。
3. 将细胞悬液在 500 x g 下离心 5 分钟。用移液器吸除上清液，并用 5 mL 完全 RPMI 1640 培养基反复吹打数次重悬细胞。
4. 使用台盼蓝排斥法在兼容的细胞计数仪上计数细胞。
5. 将细胞悬液在 500 x g 下离心 5 分钟。用移液器吸除上清液，并用 RPMI 培养基重悬，使细胞浓度为 5 × 10³ 个细胞/mL。
6. 在室温下用 PBS 中含 100 µg/mL 多聚-L-赖氨酸（PLL）溶液以每孔 100 µL 包被 96 孔圆底板，孵育 1 小时。用 PBS 洗涤两次，让平板自然干燥。
7. 将细胞悬液转移至无菌储液槽中，使用多通道移液器将 200 µL/孔的细胞悬液加入已包被 PLL 的 96 孔圆底板中。
8. 将平板转移至培养箱内的自动成像装置中（37 °C，5% CO₂，95% 湿度）。
9. 登录采集软件，依次选择 计划采集 | 启动添加容器 | 按计划扫描 | 创建容器：新建。
10. 选择扫描类型：球体。选择感兴趣的通道：相差 + 明场（用于监测球体生长）、绿色（用于监测肿瘤信号，采集时间 300 ms）和红色（用于监测细胞凋亡，采集时间 400 ms）。
    1. 选择所需放大倍数：10x。
    2. 选择平板型号及其在抽屉中的位置。选择需要成像的孔位。输入实验描述信息：名称、细胞类型、细胞数量。
11. 在分析设置中，选择 延迟分析至后续进行。右键单击时间轴，选择 设置选定扫描组间隔选项，并将 每隔 设为 4 小时， 总共 设为 24 小时。设置期望的开始时间（至少在自动成像装置中孵育 1 小时后）。
12. 每隔 2 天登录成像软件检查球体生长情况。
    1. 选择 查看最近扫描 选项，双击目标实验。在图像通道面板中选择 明场 ，然后使用 测量图像特征 工具 测量球体的直径。球体通常需要 6 天达到所需大小：直径 0.5 mm。在第 4 天每孔补充 50 µL 完全 RPMI 培养基，以减少培养基蒸发的影响。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	批号： RNBG7037
75 cm² 培养面积培养瓶	VWR	430639	批号： 2218002
75 cm² 培养面积培养瓶	VWR	734-2705	批号： 3718006
胰蛋白酶-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	批号： SLBTO777
RPMI 1640 培养基，含 L-谷氨酰胺，10 × 500 mL	Life Technology (Gibco)	21875-091	批号： 1926384
庆大霉素	Thermo Fischer	15750060	批号： 1904924A
台盼蓝溶液，0.4%	Thermo Fischer	15250061	批号： 1886513
96 孔圆底板	VWR	734-1797	批号： 33117036
X-VIVO 15 培养基，含庆大霉素、L-谷氨酰胺、酚红，1 L	BioNordika	BE02-060Q	批号： 8MB036
试剂储液槽	VWR	89094-672	批号： 89094-672
15 mL 离心管	VWR	734-1867	批号： 19317044
胎牛血清	Gibco	10500064	批号： 08Q3066K
HCT 116 结直肠癌细胞系	ATCC	CCL-247	-
Incucyte S3	Essen Bioscience