从细胞系生成球状体:一种三维 （3D） 细胞培养方法

1. 结直肠癌细胞系产生球状体

1. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS;25 cm² 培养瓶为 5 mL，75 cm² 培养瓶为 10 mL）洗涤 HCT 116（稳定转导以表达分化簇 19 （CD19） 和绿色荧光蛋白 （GFP））细胞单层。加入胰蛋白酶（25 cm² 培养瓶为 0.5 mL，75 cm² 培养瓶为 1 mL），并在 37 °C 下孵育细胞 5 分钟。
2. 在显微镜下检查细胞脱离，并使用完整的 Roswell Park Memorial Institute 160 培养基 （RPMI 1640） 中和细胞解离酶（RPMI 1640 + 10% FCS + 庆大霉素;25 cm² 培养瓶为 10 mL，75 cm² 培养瓶为 20 mL）。
3. 以 500 x g 离心细胞悬液 5 分钟。使用移液管去除上清液，然后用 5 mL RPM1 1640 完全培养基上下吹打数次以重悬。
4. 在兼容的细胞计数器上使用台盼蓝排除法对细胞进行计数。
5. 以 500 x g 离心细胞悬液 5 分钟。使用移液管去除上清液，并在 RPMI 培养基中重悬，以获得 5 x 10³个细胞/mL。
6. 在室温下 1 小时内，用 100 μL/孔的 100 μg/mL 聚-L-赖氨酸 （PLL） 的 PBS 溶液包被 96 孔圆底板。用 PBS 洗涤两次，然后让板干燥。
7. 将细胞悬液转移至无菌储液槽中，并使用多通道移液器将 200 μL/孔分配到 PLL 涂层的 96 孔圆底板中。
8. 将板转移到培养箱内的自动成像设备中（37 °C，5% CO 2,95% 湿度）。
9. 登录采集软件，选择"计划采集"|"启动"添加船只"|"按计划扫描"|"创建船只:新建"。
10. 选择 Scan Type: Spheroid（扫描类型:Spheroid）。选择感兴趣的通道:相位 + 明场（跟随球体生长）、绿色（跟随肿瘤信号，采集时间 300 毫秒）和红色（跟随细胞凋亡，采集时间 400 毫秒）。
    1. 选择所需的放大倍率:10 倍。
    2. 选择印版型号及其在抽屉中的位置。选择要成像的孔的位置。输入实验的描述:名称、单元格类型、单元格数量。
11. 对于分析设置，选择 Defer Analysis Until Later。右键单击时间轴，然后选择 设置选定的扫描组间隔选项，然后将 添加扫描间隔 设置为 4 小时，将 总共 设置为 24 小时。设置所需的开始时间（在自动成像仪中孵育后至少 1 小时）。
12. 通过登录成像软件，每 2 天检查一次球体的生长情况。
    1. 选择 View Recent Scans 选项，然后双击所需的实验。在图像通道面板中选择 Brightfield，然后使用 Measure image features 工具测量球体的直径。球体需要 6 天才能达到所需的尺寸:直径 0.5 mm。第 4 天每孔添加 50 μL 完全 RPMI 培养基，以限制培养基蒸发效应。