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Abstract

来源:Koemans， TS 等人 果蝇求偶条件反射作为学习和记忆的衡量标准。J. Vis. Exp.（2017 年）。

该视频介绍了一种经典的条件反射测定，用于测试果蝇的学习和记忆，称为求偶条件反射。该测定基于在被不接受的预配对雌性拒绝后雄性求偶的减少。示例协议显示了可用于评估短期和长期记忆的程序设置。

Protocol

此协议摘自 Koemans 等人，果蝇求偶条件反射作为学习和记忆的衡量标准，J. Vis. Exp. （2017）。

注意:在下面概述的协议中，描述了收集、训练和测试的一个重复。为了测试结果的可重复性，这些步骤应平行重复，多天，并与不同的果蝇组一起重复（表1）。该方案基于从鸡蛋到成虫的 10 天生命周期，这在 25 °C、70% 湿度和 12 小时光照/黑暗循环的恒定条件下饲养果蝇时是正常的。该方案的所有方面都假设条件在整个测定中保持不变。时间表示为培养箱中灯亮起前 （BLO） 或灯亮起后 （ALO） 的小时数，因为可以根据研究人员喜欢的一天中的时间方便地进行设置。仅使用 CO₂ 气体进行初始收集幼稚雄性果蝇和收集预先交配的雌性果蝇。该求偶条件反射协议由以下步骤组成:

1. 建立预先交配的雌性收藏培养物
2. 建立收集男性测试对象的培养物
3. 房屋街区的准备
4. 建立用于生产标准化预配母头的配套瓶
5. 男性测试对象的集合
6. 训练
7. 测试
8. 视频数据分析与统计

1. 建立预先交配的雌性收藏培养物

1. 准备 powerfood。将 0.8% （w/v） 琼脂、8% （w/v） 酵母、2% （w/v） 酵母提取物、2% （w/v） 蛋白胨、3% （w/v） 蔗糖、6% （w/v） 葡萄糖、0.05% （w/v） MgSO₄ 和 0.05% （w/v） CaCl₂ 在水中煮沸 15 分钟。让溶液冷却至 70 °C，然后加入 0.05% （w/v） 对羟基苯甲苯（注意:有毒）和 0.5% （v/v） 丙酸（注意:毒性）。搅拌充分混合，同时进一步冷却至 50 °C，以获得均匀的溶液。
2. 在食物在室温下凝固之前，向每个 175 mL 塑料瓶中加入 ~50 mL 的 Powerfood。让食物进一步冷却。用塞子盖上样品瓶。
   注意:Powerfood 是一种专门用于生产大量果蝇的食品混合物，可能是通过诱导产卵。Powerfood 不用于生产用于行为分析（第 2 步）的雄性果蝇，因为非典型饮食和潜在的拥挤可能会影响发育。
3. 在第 -11 天（表 1），在 Powerfood 小瓶中开始 5-20 次野生型培养，其中大约 60-100 只果蝇（雄性和雌性混合）;这些将在步骤 4 中用于生产标准化的预交雌性。向每个小瓶中加入滤纸，以增加幼虫可以化蛹的面积;这将增加可以闭合的苍蝇数量。
4. 在整个实验中定期重复步骤 1.1-1.3，以获得足够的新封闭果蝇作为”建立用于生产标准化预交配雌性的交配瓶”（步骤 4）的输入。

2. 为男性测试对象的集合建立文化

1. 按照步骤 1.1 和 1.2 所述，准备由 0.5% （w/v） 琼脂、2.75% （w/v） 酵母、5.2% （w/v） 玉米粉、11% （w/v） 糖、0.05% （w/v） 甲基对苯甲苯和0.5% （v/v） 丙酸在水中制成的普通食物。用飞行瓶塞盖上 175 mL 塑料样品瓶。
2. 在第 -10 天（表 1），将大约 10-20 只雄性和大约 30-75 只处女雌性（材料/设备表）放入每个装有正常食物的 175 mL 小瓶中。添加滤纸以增加化蛹的表面积并最大限度地提高生产率。
3. 每个基因型建立 3 到 6 个 175 mL 样品瓶，以获得所需数量的测试对象男性。
   注意:可能需要更多的样品瓶，具体取决于所需基因型的生产率。

3. 住宅区的准备 （图 2A）

1. 在微波炉中融化每个外壳块大约 50 mL 的 powerfood，或新鲜制备。
2. 使用多分液器移液器将 500 μL Powerfood 添加到 96 孔平底模块的每个孔中。
3. 让食物在室温下凝固。
4. 用 PCR 胶膜覆盖块，并用针头每孔至少打 4 个孔，为果蝇提供新鲜空气。
为了
5. 能够打开每个孔，请使用剃须刀片在每行之间纵向切割粘合膜。将木块一端的薄膜保持完整。
6. 块可在 4 °C 下储存长达 2 天。
   注意:使用前让模块重新平衡至室温。

4. 建立用于生产标准化预配母猪的交配瓶

1. 在第 -1 天，在 2-5 小时 BLO 下从预先交配的雌性收集培养物中取出并丢弃所有成年野生型果蝇。
2. 使用抽吸器（图 2B）以 2 至 3 小时的间隔（例如，在 30 分钟、2.5 小时和 5 小时 ALO 处）从这些小瓶中收集果蝇，并将它们放入补充有少量酵母糊和滤纸的新 powerfood 小瓶中。
3. 为避免拥挤并促进最佳交配氛围，每个新样品瓶的转移苍蝇数量不要超过 150-200 只。通过提供至少 25% 的雄性来确保所有雌性的交配。确保配对样品瓶中有足够的母细胞以适应实验的大小。
   注意:由于这是协议中的关键步骤，因此请确保仅将新鲜封闭的果蝇，而没有老苍蝇、幼虫或蛹转移到新的交配瓶中。
4. 将这些”交配瓶”孵育四天，以便有足够的时间让所有雌配。

5. 男性测试对象的集合

1. 在第 1 天（表 1）的 2-3 小时 BLO 中，使用 CO₂ 从雄性收集瓶中去除所有成年果蝇（步骤 2），但在接下来的几个小时内让更多果蝇关闭。
2. 在接下来的 5-6 小时内，使用 CO₂ 每 20-30 分钟去除一次新封闭的果蝇，并使用吸气器将每个雄性放入住房块的单独孔中（步骤 3）（图 2B）。
3. 用粘性 PCR 膜重新密封孔。
   注意:这是协议中的关键步骤。应经常收集雄性。收集的雄性应在接近羽斑时隔离在住宅区，此时它们表现出苍白的色素沉着和半透明腹部中存在胎粪。
   注意:轻柔地使用吸气器可以转移苍蝇;然而，不适当的使用会给果蝇带来压力，导致检测结果的差异（参见讨论）。
4. 目标是每种基因型最多收集 48 只雄性。这为分析幼稚和训练有素的条件所需的最大雄性数量提供了少量过剩，从而允许在以后的转移步骤中造成一些损失。

6. 训练

1. 使用 CO₂ 从交配瓶中取出果蝇（步骤 4.2），并将预先配对的雌性与雄性分开。
2. 使用抽吸器，将单个麻醉的预配对母猪添加到新住房块的一排中的每个孔中。
3. 使用抽吸器，在没有麻醉的情况下，将个体幼稚雄性从步骤 5.2 中设置的住房块转移到包含预先配对的雌性的井中。雄性放入孔中后，立即用胶膜重新密封;不要让雄性逃跑。
   注意:利用雄性苍蝇的自然”负趋向性”行为，将雄性苍蝇从吸气器转移到住房区。
4. 重复步骤 6.2-6.3，直到建立足够的男性 – 女性对。理想情况下，每个基因型建立 24 对，一个外壳块的两整行。将剩余的幼稚雄性留在步骤 5.2 中设置的原始住房块中。
5. 在训练期间，保持雄性-雌性对不受干扰（表 2，图 1B）.
   注意:在此期间，雄性会求爱并被预先怀孕的雌性拒绝。对于 learning 和 STM，训练时间为 1 h，对于 LTM，训练时间为 7-9 h。
6. 通过使用抽吸器轻轻地将雄性与预先配对的女性分开来结束训练（表 2，图 1B）;不要使用麻醉。将分离的雄性放在新的住房区中。
7. 使用抽吸器将所有幼稚的男性从步骤 5.2 中设置的住房块轻柔且无需麻醉地转移到新的住房块。
   注意:此步骤对于 STM 和学习是可选的，但对于 LTM 非常重要，因为苍蝇被额外安置 24 小时以测试 LTM。
8. 对于 STM 和 LTM，在测试前（步骤 7），让雄性分别休息 1 小时和 ~24 小时（表 2，图 1B）。
9. 为了学习，立即测试训练有素和天真的男性（第 7 步）。

7. 测试

1. 使用 CO₂ 从交配小瓶（步骤 4.2）中收集果蝇，并将预先配对的雌性与雄性分开。
2. 让雌性在含有正常食物的小瓶中从麻醉中恢复至少 1 小时。
3. 提前安装录像机 （图 2C），以便在测试开始前准备好所有设备。
4. 根据学习、STM 和 LTM 的不同时间表开始测试（表 2，图 1B）。在学习训练后立即进行测试，在 STM 训练后 1 小时，在 LTM 训练后 24 小时进行测试。
5. 使用吸气器，轻轻地将一只雄性从休息的住房区或训练的住房区（如果正在测试学习）（步骤 6.7，训练;步骤 6.8，天真）转移到隔板关闭的求偶场的一半（图 2D;建筑平面图见文件 S1><）。 注意:使用自然的”负趋地性”行为应该足以将雄性果蝇从吸气器转移到求偶领域。
6. 快速但轻轻地将入口孔移动到下一个竞技场，然后重复步骤 7.5，直到所有 18 个竞技场都包含一名雄性。
7. 使用抽吸器，在没有 CO₂ 的情况下，将一个预先配对的女性（在步骤 7.2 中收集）添加到所有 18 个竞技场的另一半。
8. 小心地将求偶室放在相机下方，井口朝下（图 2C）。
9. 移除竞技场的隔板，以允许雄性和预先配对的雌性之间直接互动。
10. 立即开始记录行为至少 10 分钟。
    注意:当使用双摄像头设置时，可以在重叠的时间范围内并行记录两个求偶板，以最大限度地提高效率。
11. 使用手持式真空吸尘器清空求偶场所，并在重新使用之前让求偶室通风。
12. 重复步骤 7.4-7.11，直到完成所有基因型和条件（即幼稚和训练）的测试。

8. 视频数据分析与统计

1. 计算求偶指数 （CI），定义为每只雄性苍蝇在测试期的前 10 分钟内求偶的时间百分比><。 注意:这可以通过观察刻板印象的求爱行为（图 1A）或使用计算机软件自动量化求爱行为来手动完成。
   注意:建议在三天内分析每种病症 40-60 名男性，以获得足够的统计功效并判断 CI 数据的一致性。
2. 计算学习指数 （LI），定义为与幼稚男性相比，受过训练的男性的平均 CI 减少的百分比 （LI =（CI_幼稚 –_CI训练）/ CI_幼稚）。评估每天测试的 LI，并将其与根据所有测试天数的总和计算的累积 LI 进行比较。
3. 制作一个单独的两列选项卡数据文件，标题为 “Genotype” 和 “CI><"。 注意:这些标题区分大小写。每个 CI 的基因型名称必须由基因型描述、下划线和训练条件组成（例如，genotype_N 和 genotype_LTM 等，其中 N = 幼稚，LTM = 长期记忆;示例见补充文件 S2）。此注释是必不可少的，因为函数 analearn 将根据 “Genotype” 列中第一个下划线后的字符来识别训练有素的和幼稚的苍蝇。
4. 使用 analearn R 脚本（补充文件 S3）执行随机化测试，以判断来自不同基因型的 LI 值之间差异的统计显着性。
   1. 将脚本（补充文件 S3）源代码化到 R 中，该脚本定义了一个名为”analearn”的函数。
      注意:函数定义为:analearn <- function（nboot = 10,000， naivelevel = 'N'， refmutation = NA， datname = NA， header = TRUE， seed = NA， writeoutput = TRUE）。
   2. 通过在 R 命令行中输入 “analearn（）” 并通过弹出窗口选择要分析的数据文件（在步骤 8.3 中生成）来启动该函数。
   3. 通过输入相应的数字并按 enter.
      来选择参考突变，即对照基因型 注意:选择参考基因型后，该脚本需要几秒钟来执行 10,000 次 bootstrap 重复。
   4. 观察输出表（表 3），其中包含基因型、学习条件（即学习、STM 或 LTM）、平均 CI 幼稚、训练的平均 CI、LI、对照的 LI 与实验条件的 LI 之间的差异 （LI dif）、LI dif 的 95% 置信区间的下限 （LL） 和上限 （UL）， 以及指示没有显著差异的概率的 p 值。
      注意: analearn 将在数据文件所在的目录中存储一个输出文本文件。但是，输出表也会显示在 R-Studio 控制台中。默认名称是根据提供的数据文件的名称构建的。
   5. analearn 函数中有几个参数可用于更改函数的默认设置以调整 bootstrapping 的参数。
      注意:”nboot”定义 bootstrap 复制的数量，默认设置为 10,000。此值可以更改为任何大于零的整数。表 5 列出了几个可用于更改函数默认设置的参数。但是，不建议使用通过少量 bootstrap 仿行生成的数据。

Representative Results

Materials

<em>P{KK101437}VIE-260B</em>	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
<em>P{KK108109}VIE-260B</em>	–	–	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
<em>w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)</em>	–	–	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	–	–	Any sharp will do
Needle	–	–	0.8 mm diameter
Aspirator	–	–	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	–	–	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	–	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
<strong>Name</strong>	<strong>Company</strong>	<strong>Catalog Number</strong>	<strong>Comments</strong>
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	–
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–
Yeast paste	–		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	–
Corn flour	de Molen	–
Sugar	de Molen	–
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–