Drosophila 求偶条件化：一种检测果蝇学习与记忆能力的方法

摘要

来源：Koemans, T. S. 等. 果蝇求偶条件化作为学习与记忆的测量方法. J. Vis. Exp. (2017)。

本视频介绍了一种经典的条件化检测方法，用于测试学习与记忆能力 果蝇称为求偶条件化。该检测基于雄性果蝇在被不接受交配的已交配雌蝇拒绝后，其求偶行为减少的现象。示例方案展示了一种可用于评估短期和长期记忆的实验操作流程。

方案

本方案节选自 Koemans 等, 黑腹果蝇 求偶条件化作为学习与记忆的评估方法 视频实验杂志 (2017).

注意： 下文所述方案仅描述了一次完整的收集、训练和测试过程。为检验结果的可重复性，应在不同日期平行重复进行多次实验，并使用多组独立的果蝇（表1）。本方案基于果蝇从卵到成虫约10天的生活周期，在25 °C、70%湿度及12小时光照/12小时黑暗循环的恒定条件下饲养时，此周期属正常情况。本方案所有步骤均假设实验期间环境条件保持恒定。时间以光照开启前（BLO）或光照开启后（ALO）的小时数表示，以便根据研究人员习惯的每日操作时间进行设定。仅在初次收集未经交配的雄性果蝇以及收集已交配雌蝇时使用CO₂气体。本项求偶条件化实验方案包含以下步骤：

1. 建立已交配雌性个体收集培养系
2. 建立雄性受试个体收集培养系
3. 准备饲养模块
4. 建立交配小瓶以生产标准化的已交配雌性个体
5. 雄性受试个体的收集
6. 训练
7. 测试
8. 视频数据分析与统计

1. 建立交配后雌性果蝇收集培养体系

1. 制备果蝇培养基（powerfood）。将0.8% (w/v) 琼脂、8% (w/v) 酵母、2% (w/v) 酵母提取物、2% (w/v) 蛋白胨、3% (w/v) 蔗糖、6% (w/v) 葡萄糖、0.05% (w/v) MgSO₄ 和 0.05% (w/v) CaCl₂ 溶于水中，煮沸15分钟。待溶液冷却至70 °C后，加入0.05% (w/v) 对羟基苯甲酸甲酯（注意：有毒）和0.5% (v/v) 丙酸（注意：有毒）。继续搅拌并冷却至50 °C，以获得均匀的溶液。
2. 在培养基于室温凝固前，向每个175 mL塑料瓶中加入约50 mL果蝇培养基。让培养基进一步冷却。用封口塞封闭瓶口。
   注意：果蝇培养基是一种专门配制的营养混合物，旨在大量繁殖果蝇，可能通过促进产卵实现。在行为学分析所用雄蝇的培养（步骤2）中不使用该培养基，因为非典型饮食和潜在的拥挤可能影响其发育。
3. 在第-11天（表1），在果蝇培养基瓶中接种5-20管野生型果蝇，每管约60-100只（雌雄混合），用于步骤4中标准化交配雌蝇的制备。每瓶中加入一张滤纸，以增加幼虫化蛹的表面积，从而提高羽化果蝇的数量。
4. 在整个实验过程中定期重复步骤1.1-1.3，以获得足够数量的新羽化果蝇，作为"建立用于制备标准化交配雌蝇的交配瓶"（步骤4）的输入材料。

2. 建立用于收集雄性受试者的培养体系

1. 按步骤 1.1 和 1.2 所述，制备正常食物：在水中加入 0.5% (w/v) 琼脂、2.75% (w/v) 酵母、5.2% (w/v) 玉米粉、11% (w/v) 蔗糖、0.05% (w/v) 对羟基苯甲酸甲酯和 0.5% (v/v) 丙酸。用果蝇培养瓶塞封闭 175 mL 塑料瓶。
2. 在第 -10 天（表 1），将约 10–20 只雄蝇与约 30–75 只雌性 virgin 蛹（材料/设备表）放入每个装有正常食物的 175 mL 培养瓶中。添加一张滤纸以增加化蛹表面积，并提高繁殖效率。
3. 每种基因型建立三至六个 175 mL 培养瓶，以获得所需数量的测试雄性个体。
   注意： 所需培养瓶数量可能更多，具体取决于目标基因型的繁殖能力。

3. 饲养模块的制备（图2A）

1. 用微波炉将每个饲养板中的约 50 mL powerfood 熔化，或新鲜配制。
2. 使用多通道移液器，向 96 孔平底板的每个孔中加入 500 µL powerfood。
3. 在室温下让食物凝固。
4. 用 PCR 黏性封膜覆盖板孔，并用针头在每个孔上至少扎 4 个孔，以向果蝇提供新鲜空气。
5. 为便于打开每个孔，使用剃刀刀片沿每行之间纵向切割黏性封膜，但保留板的一端封膜完整。
6. 饲养板可在 4 °C 下保存最多 2 天。
   注意：使用前需将饲养板恢复至室温。

4. 建立交配管以生产标准化的已交配雌性果蝇

1. 在第 -1 天，在成虫羽化后 2-5 小时内，从预先交配的雌性果蝇收集培养管中移除并丢弃所有成年野生型果蝇。
2. 使用移液器（图 2B）以 2 至 3 小时为间隔（例如，在羽化后 30 分钟、2.5 小时和 5 小时）从这些培养管中收集果蝇，并将其转移至新的加有少量酵母糊和滤纸的 powerfood 培养管中。
3. 为避免过度拥挤并营造最佳交配环境，每个新培养管中转移的果蝇数量不应超过 150–200 只。为确保所有雌性果蝇均能交配，需提供至少 25% 的雄性果蝇。同时确保交配管中有足够数量的雌性果蝇，以满足实验规模的需求。
   注意： 此步骤是本实验方案的关键环节，务必确保仅将新羽化的果蝇转移至新的交配管中，不得混入任何老果蝇、幼虫或蛹。
4. 将这些"交配管"培养四天，以确保所有雌性果蝇均有充足时间完成交配。

5. 雄性受试者的采集

1. 在第1天（表1），于出蛹后2-3小时，使用CO₂将雄性收集管中的所有成虫移除（步骤2），但在接下来的几小时内允许更多果蝇羽化。
2. 在接下来的5-6小时内，每隔20-30分钟使用CO₂移除新羽化的果蝇，并用吸虫器将每只雄蝇转移至饲养板的独立孔中（步骤3）（图2B）。
3. 用粘性PCR封膜重新密封各孔。
   注意：此步骤是本实验方案的关键。应频繁收集雄蝇；收集的雄蝇应在羽化后不久即隔离于饲养板中，此时果蝇体色较浅，半透明的腹部可见粪便残留物（meconium）。
   注意：正确轻柔地使用吸虫器可实现果蝇的转移；操作不当则会令果蝇产生应激，导致实验结果出现变异（见讨论部分）。
4. 每种基因型目标收集最多48只雄蝇。此数量略高于分析 naïve 和训练后状态所需的最大雄蝇数，可弥补后续转移过程中的损耗。

6. 培训

1. 使用 CO₂ 将果蝇从交配小瓶（步骤 4.2）中移出，并将已交配雌蝇与雄蝇分离。
2. 使用吸虫器，将一只麻醉后的已交配雌蝇加入新饲养板中某一行的每个孔内。
3. 使用吸虫器且不进行麻醉，将一只未经交配的雄蝇从步骤 5.2 建立的饲养板中转移至含有已交配雌蝇的孔中。雄蝇放入孔内后，立即用粘性封膜重新密封；防止雄蝇逃逸。
   注意： 利用雄蝇自然的"负趋地性"行为，通过吸虫器将其转移至饲养板中。
4. 重复步骤 6.2–6.3，直至建立足够数量的雌雄配对。理想情况下，每种基因型建立 24 对，即一个饲养板的两整行。将剩余的未经交配雄蝇保留在步骤 5.2 建立的原始饲养板中。
5. 在训练期间内保持雌雄配对不受干扰（表 2，图 1B）。
   注意： 在此期间，雄蝇会求偶但被已交配雌蝇拒绝。对于学习和短期记忆（STM），训练时间为 1 小时；对于长期记忆（LTM），训练时间为 7–9 小时。
6. 使用吸虫器轻轻将雄蝇与已交配雌蝇分离以结束训练（表 2，图 1B）；不要使用麻醉。将分离后的雄蝇放入新的饲养板中。
7. 使用吸虫器，轻柔地且不进行麻醉，将所有未经交配的雄蝇从步骤 5.2 建立的饲养板转移至新的饲养板。
   注意： 此步骤对于短期记忆（STM）和学习是可选的，但对于长期记忆（LTM）非常重要，因为果蝇需要额外饲养 24 小时以检测长期记忆。
8. 对于短期记忆和长期记忆，分别让雄蝇休息 1 小时和约 24 小时（表 2，图 1B）后再进行测试（步骤 7）。
9. 对于学习测试，立即对训练过的和未经训练的雄蝇进行测试（步骤 7）。

7. 测试

1. 从交配小瓶（步骤 4.2）中收集果蝇，使用 CO₂₂ 将已交配的雌性与雄性分开。
2. 让雌性果蝇在含有正常食物的小瓶中恢复麻醉状态至少1小时。
3. 提前安装好录像设备（图2C)，以便在测试开始前准备好所有设备。
4. 根据学习、短期记忆（STM）和长期记忆（LTM）的不同时间线开始测试（表 2, 图1B）。学习测试在训练后立即进行，短期记忆（STM）测试在训练后1小时进行，长期记忆（LTM）测试在训练后24小时进行。
5. 使用移液器，将一只雄性果蝇从静息饲养板或训练饲养板（若测试学习能力，则步骤6.7为已训练组，步骤6.8为未训练组）轻柔转移至交配行为观测装置的一侧，此时隔板应处于关闭状态（图2D；建筑规划详见文件S1。
   注意： 天然物质的使用 "负向地性" 行为应足以将雄性果蝇从吸虫器转移到求偶实验区。
6. 迅速但轻柔地将入口孔移至下一个区域，重复步骤7.5，直至所有18个区域各包含一只雄性个体。
7. 使用移液器且不使用 CO₂，将一只已交配的雌性个体（在步骤7.2中采集）加入其余9个实验区域中。
8. 将交配行为观察室小心地置于显微镜下，使孔洞开口朝下（图2C).
9. 移除实验区域的隔板，使雄性与已交配雌性能够直接接触。
10. 立即开始记录行为，持续至少10分钟。
    注意： 使用双相机设置时，可对两个求偶实验板进行时间重叠的并行记录，以最大化实验效率。
11. 使用手持式真空吸尘器清空求偶实验区域，并在重新使用前让求偶室通风。
12. 重复步骤7.4-7.11，直至完成所有基因型和条件的测试（即， 幼稚型和训练型）已完成。

8. 视频数据分析与统计

1. 计算求偶指数（CI），即在测试期的前10分钟内，每只雄性果蝇进行求偶行为所占的时间百分比。
   注意： 这可以通过观察典型的求偶行为手动完成（图1A或使用计算机软件对求偶行为进行自动化定量分析。
   注意： 建议每个条件分析40-60只雄性个体，持续三天，以获得足够的统计效力并评估CI数据的一致性。
2. 计算学习指数（LI），定义为训练雄性个体的平均CI相较于幼稚雄性个体的百分比下降值（LI = (CI_幼稚的 – CI_训练好的）/ CI_幼稚的). 评估每次测试日的刺激指数（LI），并将其与所有测试日合并计算的累积刺激指数（LI）进行比较。
3. 创建一个独立的两列标签数据文件 "基因型" 和 "CI" 作为标题。
   注意： 这些标题区分大小写。每个CI的基因型名称必须由基因型描述后跟下划线及训练条件组成例如， 基因型_N 和基因型_LTM 等，其中 N 代表未受训练（naïve），LTM 代表长期记忆（long term memory）；示例见补充文件 S2）。该注释至关重要，因为 analearn 函数将根据第一个下划线后出现的字符来识别已训练和未受训练的果蝇。 "基因型" 柱
4. 使用 analearn R 脚本（补充文件 S3）对不同基因型的 LI 值差异进行随机化检验，以判断其统计学显著性。
   1. 将脚本（补充文件 S3）导入 R，该脚本定义了一个名为 "analearn"
      注意： 函数定义为：analearn <- 函数(nboot = 10,000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE)
   2. 通过输入启动该函数 "analearn()" 在R命令行中，通过弹出窗口选择待分析的数据文件（该文件在步骤8.3中生成）。
   3. 通过输入相应的编号并按回车键，选择作为对照基因型的参考突变。
      注意： 选择参考基因型后，该脚本需耗时数秒以完成10,000次自助重复分析。
   4. 观察输出表格（表3），其中包含基因型、学习条件（即，学习、短期记忆（STM）或长期记忆（LTM）、对照组平均CI值（mean CI naïve）、训练组平均CI值（mean CI trained）、学习指数（LI）、对照组与实验组之间学习指数的差值（LI dif）、LI dif的95%置信区间下限（LL）和上限（UL），以及 p-值，表示不存在显著差异的概率。
      注意： analearn 将在数据文件所在的目录中存储一个输出文本文件。然而，输出表格也会显示在 R-Studio 控制台中。默认文件名将根据所提供的数据文件名称生成。
   5. analearn 函数中有多个参数可用于更改函数的默认设置，以调整自举法的参数。
      注意： "nboot" 定义了自举重复次数，默认设置为 10,000。该值可更改为任意大于零的整数。表 5 列出了可用于修改函数默认设置的若干参数。然而，不建议使用自举重复次数较少时生成的数据。

结果

图1：求偶指数的测定及实验总体设计。（A）展示雄性果蝇对雌性果蝇典型求偶行为的图像。图中显示求偶行为的不同阶段：定向（I）、跟随（II）、振翅（伸展）与拍打（III）、舔舐（IV）以及试图交配（V）。（B）训练与测试时间相对于培养箱光周期的示意图，以小时为单位标注。训练时间用实心条形表示，短期记忆（STM）与长期记忆（LTM）的休息期用虚线表示，测试起始点用箭头表示。请注意，LTM的测试时间在训练后的第二天。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<em>P{KK101437}VIE-260B</em>	VDRC	101437	60100 遗传背景下的 Dhat 基因 RNAi
<em>P{KK108109}VIE-260B</em>	-	-	60100 遗传背景下的对照 RNAi（由 K. Keleman 惠赠）
<em>w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)</em>	-	-	全神经元驱动品系
植物组织培养容器	VWR	960177	175 mL 塑料瓶
折叠滤纸	Whatman	10311643	用于扩大果蝇化蛹面积的滤纸
平底板（96孔）	Qiagen	19579	用于放置培养块
MicroAmp 透明粘性封膜	Applied Biosystems	4306311	用作平底板的PCR封膜盖
剃须刀片	-	-	任何锋利刀片均可
针头	-	-	直径 0.8 mm
吸虫器	-	-	用剪刀将 1 mL 移液枪头剪成两段。将枪头较细的一端作为果蝇入口插入约 80 cm 长的软管中。为防止果蝇进入软管，可在枪头与软管之间塞入普通棉絮或小片网状纱布。枪头的另一段可用作软管末端的吹气口。
求偶行为观察室	-	-	文件 S1 可使用指定的 CAD 软件打开
摄像机	Sony	-	摄像机规格：>400 万像素，全高清
对于手动定量分析，任何简单的视频录制设备均有可能生成足够清晰的视频以准确观察求偶行为。对于自动定量分析，不同软件可能有不同的要求，若计划采用自动分析方法，用户应对此进行充分调研。
<strong>名称</strong>	<strong>公司</strong>	<strong>目录编号</strong>	<strong>备注</strong>
强化培养基
琼脂	Sigma	A7002
酵母粉	Bruggeman	-
酵母提取物	MP biomedicals	0210330391
蛋白胨	Sigma	P6838
蔗糖	Sigma	S9378
葡萄糖	Sigma	G7021
MgSO₄	Sigma	M2643
CaCl₂	Merck	1023780500
对羟基苯甲酸甲酯（注意）	Sigma	H5501
丙酸（注意）	Sigma	P1386
去矿物质水	-
酵母糊	-		酵母颗粒与水按 1:1 比例混合
名称	公司	目录编号	备注
普通培养基
琼脂	MP biomedicals	215017890
酵母粉	bruggeman	-
玉米粉	de Molen	-
糖	de Molen	-
对羟基苯甲酸甲酯（注意）	Sigma	H5501
丙酸（注意）	Sigma	P1386
去矿物质水	-