果蝇挖洞和隧道试验:一种评估果蝇幼虫组织缺氧的方法

该协议摘自 Qiang 等人，用于检测黑腹果蝇幼虫缺氧的挖洞/隧道测定，J. Vis. Exp. （2018）。

1. 幼虫的制备

1. 在开始测定前两天或更长时间，按照 Wieschaus 和 Nusslein-Volhard 的描述，在产蛋培养皿中设置所需的实验和对照组合（至少 20 只雌性和 10 只雄性）的杂交，但使用 50 mL 聚丙烯烧杯和 6.0 cm 一次性培养皿含有葡萄琼脂，并在使用前涂抹酵母糊。将苍蝇放在室温下避光的产蛋盘中，直到需要为止。
2. 葡萄琼脂配方 – 将 100 mL 冷冻 100% 浓缩葡萄汁、350 mL 脱碘水、5 mL 冰醋酸和 13 g 黑腹果萪琼脂混合在 1L 玻璃烧杯中。微波 1-2 分钟，两次之间搅拌，直到琼脂全部溶解。将溶液冷却几分钟，然后加入 10 mL 10% （w/v） 的 Nipagen（对羟基苯甲酸甲酯）的 95% 乙醇溶液。混合，然后将每板 7 mL 移液到一次性 6.0 cm 培养皿中，凝胶并在室温下干燥 3-4 小时。在 4 °C 下储存在塑料袋中。
3. 酵母糊配方 – 7 g 干酵母、10 mL 去离子水，用刮刀混合至均匀稠度。
4. 定时收集卵以产生实验和对照幼虫。使用新的、涂有酵母的葡萄板，在室温下收集鸡蛋，在早晨的黑暗中放置 4 小时。取出这些 4 小时的收集板并更换为新板。将收集板在25°C下孵育4小时过夜，直到第二天下午，此时大多数幼虫已经孵化。收集这些第一龄幼虫并使用它们来设置实验。

2. 设置检测板

1. 制备检测板。对于单次分析，准备 5 个检测板，每个板 10 个实验幼虫和 5 个板，每个板 10 个对照幼虫。使用 1.5 厘米的软木蛀虫从每个盘子上去除琼脂的中心核心，为食物创建一个孔。将酵母糊 （0.8 - 0.9 g） 放入孔中，用刮刀轻轻拍打，使孔堆填满。
2. 琼脂板制备 — 将 700 mL 去离子水与 16 g 黑腹果萪琼脂混合在 2L 玻璃烧杯中，微波 5 分钟。从微波炉中取出，用玻璃棒搅拌，将未溶解的琼脂加入溶液中。在 95% 乙醇中加入 17.5 mL 10% （w/v） Nipagen，混合，然后继续微波加热 30 秒，然后搅拌，直到所有琼脂完全溶解。冷却一两分钟，然后将 15 mL 等分试样移液到 10 cm 塑料培养皿中。让琼脂凝胶化，用盖子盖住板，让它们在室温下干燥几个小时或过夜。将板储存在 18 °C.
   的密封塑料袋中 注 1:为避免由于过度干燥而在板表面形成 Nipagen 晶体，请在制备后几天内使用板。如有必要，可以通过在晶体上滴入几微升 95% 的酒精来重新溶解><晶体。 注 2:不同批次的琼脂可以具有不同的胶凝特性。干燥的凝胶板应触感坚硬且具有足够的弹性，以便在使用软木蛀虫创建食物孔时可以去除干净、完整的琼脂圈（见上文）。
3. 在测定板中设置幼虫。使用机械压力使塑料微刮刀的尖端弯曲，并将尖端浸入酵母糊中，以提供"粘合剂"来拾取幼虫。单独捡起第一龄幼虫，并将它们放在靠近食物堆的琼脂板上。为实验和对照基因型准备至少 5 个 10 只幼虫的复制板。完成后，盖上每个板的盖子并贴上标签，并将板（盖子面朝上）放在室温下的黑暗空间（在我们的实验室中为 22 °C）。

3. 监测检测板

1. 每天在解剖显微镜下检查平板，并记录食物顶部或琼脂表面的幼虫数量。注意任何可见的死亡或垂死的幼虫。注意何时以及是否随着幼虫进入第三龄而进入琼脂基质。记下蛹开始形成的日期并注意任何蛹异常。继续每日观察，直到所有幼虫都死亡或化蛹。
2. 用弯曲的挑逗针小心地从盘子中取出蛹，然后转移到葡萄盘上。如果需要，继续监测蛹以确定有多少 eclose 为成虫。