Drosophila 幼虫挖掘与穿隧实验：一种评估果蝇幼虫组织缺氧的方法

摘要

来源：Qiang, K. M. 等。一种用于检测黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫缺氧的掘穴/钻孔实验方法。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了一种检测缺氧的方法 果蝇 通过评估幼虫的钻孔和穿隧能力来区分幼虫。利用该技术，研究人员可以区分因缺氧而受影响的幼虫与具有发育缺陷的幼虫。本示例方案展示了该检测的设置方法。

方案

本方案节选自 Qiang et al.，《一种用于检测黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫缺氧的掘穴/钻道实验方法》， J. Vis. Exp. (2018)。

1. 幼虫的制备

1. 在开始实验前两到三天，按照 Wieschaus 和 Nusslein-Volhard 的方法设置所需实验组和对照组的杂交组合（每组至少20只雌蝇和10只雄蝇），使用50 mL聚丙烯烧杯和含有葡萄琼脂的6.0 cm一次性培养皿，使用前在琼脂表面涂抹酵母糊。将果蝇置于避光条件下室温培养，直至使用。
2. 葡萄琼脂配方——在1 L玻璃烧杯中加入100 mL冷冻的100%葡萄汁浓缩液、350 mL去离子水、5 mL冰醋酸和13 g D. melanogaster 琼脂。微波炉加热，每次1–2分钟，中间搅拌，直至琼脂完全溶解。溶液稍冷却几分钟后，加入10 mL 10%（w/v）尼泊金（对羟基苯甲酸甲酯）的95%乙醇溶液。混匀后，每块培养皿加入7 mL，室温下静置凝固并干燥3–4小时。用塑料袋封装后于4 °C保存。
3. 酵母糊配方——7 g干酵母与10 mL去离子水混合，用刮刀搅拌至均匀一致。
4. 定时收集卵以获得实验组和对照组幼虫。使用新的、涂有酵母糊的葡萄琼脂培养皿，在早晨时段于室温避光条件下收集卵4小时。移除该4小时收集的卵板，并更换为新的培养皿。将收集有卵的培养皿在25 °C下过夜培养至次日下午，此时大多数幼虫已孵化。收集这些一龄幼虫，并用于后续实验设置。

2. 建立检测板

1. 检测板的制备。每次实验运行需准备五个实验组平板，每板放置10只实验幼虫，同时准备五个对照组平板，每板放置10只对照幼虫。使用直径1.5 cm的打孔器从每个平板中取出琼脂中心部分，形成用于放置食物的孔洞。将酵母糊（0.8–0.9 g）填入孔中，并用刮刀轻轻拍压，使其形成填满孔洞的小丘状。
2. 琼脂平板的制备——在2 L玻璃烧杯中加入700 mL去离子水和16 g D. melanogaster 琼脂，微波加热5分钟。从微波炉中取出后，用玻璃棒搅拌，使未溶解的琼脂进入溶液。加入17.5 mL 10%（w/v）尼泊金溶于95%乙醇的溶液，混匀，然后继续以每次30秒的间歇微波加热并搅拌，直至所有琼脂完全溶解。冷却一至两分钟，随后用移液器将15 mL等份液体转移至10 cm塑料培养皿中。静置使琼脂凝固，盖上皿盖，并在室温下干燥数小时或过夜。将平板密封于塑料袋中，保存于18 °C环境中。
   注意1：为避免因过度干燥导致尼泊金在平板表面析出结晶，建议在制备后数日内使用平板。如有必要，可在结晶处滴加数微升95%乙醇使其重新溶解。
   注意2：不同批次的琼脂可能存在凝胶性能差异。干燥后的琼脂平板应质地坚实，具有足够弹性，以便使用打孔器制作食物孔洞时能完整取出一个干净的琼脂圆片（见上文）。
3. 在检测平板中放置幼虫。通过机械压力使塑料微型刮勺的尖端弯曲，并将尖端蘸取少量酵母糊，以提供"粘附力"，便于拾取幼虫。逐个挑取一龄幼虫，将其放置在靠近食物小丘的琼脂平板上。对实验组和对照组基因型均需至少准备五个重复平板，每板10只幼虫。完成后，盖上皿盖并标记每个平板，将平板（盖子朝上）置于室温下的暗处（本实验室为22 °C）。

3. 监测检测板

1. 每天在解剖显微镜下检查培养皿，记录位于食物表面或琼脂表面的幼虫数量。注意观察是否有明显死亡或濒死的幼虫。注意幼虫进入三龄期时是否出现钻入琼脂基质的现象。记录蛹开始形成的日期，并注意是否存在任何蛹的异常情况。持续每日观察，直至所有幼虫死亡或完成化蛹。
2. 用弯曲的解剖针小心地将蛹从培养皿中取出，并转移至葡萄培养皿中。如需要，可继续监测蛹的发育情况，以确定有多少蛹羽化为成虫。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
干酵母
冷冻葡萄汁浓缩液	Welch's		可在大多数大型超市购买
冰醋酸	Sigma-Aldrich	320099
果蝇培养基琼脂	Apex Bioresearch Products	66-103
对羟基苯甲酸甲酯	Apex Bioresearch Products	20-658
仪器
50 ml 聚丙烯烧杯
6.0 cm 一次性培养皿	Falcon	08757100B
10 cm 一次性塑料培养皿	E+K Scientific	EK-24104
塑料微型刮勺	Corning Incorporated	3012
弯头解剖针	Nasco	S08848MH
体视显微镜			任何具有 10–30 倍放大功能的显微镜