斑马鱼心电图（ECG）：一种评估心脏功能的微创检测方法

摘要

来源：Zhao, Y., 等. 成年斑马鱼的活体表面心电图记录. J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了如何在斑马鱼上进行心电图（ECG 或 EKG）测量，该检测用于记录心脏的电活动。

方案

本方案节选自 Zhao 等, 在体 内 成年斑马鱼的体表心电图 视频实验杂志 (2019).

本研究中的所有实验均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行。本研究中的所有动物实验方案均经加州大学洛杉矶分校机构动物护理和使用委员会批准。

1. 麻醉诱导

1. 准备浸入式麻醉以控制疼痛并使鱼类固定，避免在心电图（ECG）数据采集过程中产生运动伪影。大多数实验室使用浸入式三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，MS-222）。
   1. 配制0.4%三卡因储备液：将以下成分加入带螺旋盖的棕色玻璃瓶中：400 mg三卡因粉末、98 mL双蒸水和2 mL 1 M Tris（pH 9）。根据需要使用1 N NaOH或1 N HCl调节pH至7.0。
   2. 配制三卡因终浓度浸入液时，应根据斑马鱼的年龄、体型、代谢状态、品系、疾病模型、科研目标及操作持续时间，确定合适的最低有效浓度。
   3. 如有必要，开展三卡因浓度-反应研究，从推荐浓度168 mg/L（或0.0168%）⁹开始上下滴定，以在3分钟内达到麻醉第4级，同时尽可能减少心肺毒性。例如，在本研究中，将12–18月龄的野生型AB斑马鱼浸入0.02–0.04%三卡因溶液，可在3分钟内诱导达到第4级麻醉。
      注：在第4级麻醉状态下，鱼类完全丧失平衡能力与肌张力，鳃盖运动频率降低。
   4. 如有需要，可咨询机构动物护理与使用委员会（IACUC）的兽医，以获得关于麻醉剂选择及其给药途径是否合适的进一步指导。
2. 将成年斑马鱼浸入含有已预先确定且经IACUC批准的最低浓度三卡因溶液（例如本研究中为0.02–0.04%）的培养皿中，使其在3分钟内进入第4级麻醉状态（图1）。
   1. 对于需存活的ECG实验方案，应尽可能缩短ECG记录时间（少于10分钟）。若ECG记录时间少于15分钟，则无需维持麻醉。
   2. 对于持续数小时的长时间ECG记录，应使用长效肌肉注射型麻痹剂，并配合口腔灌注系统以保证充足的水合与氧合。

2. 心电图导联放置

1. 当斑马鱼维持在4级麻醉状态达3秒后，立即使用钝头镊子将鱼转移到湿润海绵的切口中，使其腹面朝上，以便放置心电图导联电极（图2）。
2. 轻柔地将三个心电图导联电极插入鱼体肌肉组织，深度约为1 mm，以在额状面建立双极导联，该导联方向与心脏主轴的左尾侧-右头侧方向平行。
3. 将正极（红色）电极置于动脉球水平的腹侧中线位置，即位于连接两侧鳃盖下缘的假想线上方1–2 mm处（图2A）。
4. 将负极（黑色）电极置于正极后方，并向左侧偏移0.5–1.0 mm，其距离应大于成年斑马鱼心室的最大心尖-心底长度（图2A）。
5. 将参考电极（绿色）置于尾部靠近肛门区域。
   注意： 由于不同个体斑马鱼的心脏主轴存在一定差异，为最大化R波和T波的振幅，应通过反复试验进行小幅度、系统性的调整来优化导联位置。例如，每次仅调整一个电极（正极或负极），并在改变方向前沿某一特定方向逐步调整，避免在随机方向上进行无规律的变动。

3. 心电图记录

1. 打开心电图数据采集程序。从下拉菜单中选择合适的范围、低通和高通参数。例如，本实验所用的活体心电图记录系统采用以下设置时，可为正常成年斑马鱼提供稳定且满意的心电信号信噪比：范围 "2 mV"，低通 "120 Hz"，高通 "0.03 s"。
2. 点击 开始 按钮，以 1 kHz 的采样率开始连续无间断的心电图记录。
3. 为优化导联位置以获得最大信噪比，在每次心脏记录的首次尝试后，立即点击 停止 按钮暂停心电图记录，并查看心电图波形。要判断成年斑马鱼心电图是否正常，需确认以下四个验证标准均满足（图3）：
   1. 标准1：确保所有心电波形（P波、QRS波群和T波）清晰可辨且易于观察。
   2. 标准2：确保P波为正向波。
   3. 标准3：确保QRS波群的净振幅为正（即R波振幅大于Q波与S波振幅之和）。
   4. 标准4：确保T波为正向波。
4. 若预期为正常心电图，但未满足上述四项标准，则根据需要调整电极位置（可优先尝试调整负极），直至满足全部四项验证标准。
5. 若预期T波正常，但T波幅度过小，应调整电极位置以最大化T波振幅。
6. 在优化导联位置后继续心电图记录，并保存心电图扫描数据以供后续分析。

4. 麻醉复苏

1. 心电图记录结束后，小心移除电极，避免损伤斑马鱼。将斑马鱼转移至新鲜、充氧且不含三卡因的鱼水中。
2. 为促进麻醉后的恢复，使用巴斯德移液管用力向鳃部喷水，直至鱼恢复规律的鳃运动或开始游动。
3. 监测斑马鱼是否完全从麻醉中恢复（通常需1-2分钟），以斑马鱼能够直立游泳至少5秒为判断标准。

结果

图1：微创体内心电图记录方案。 示意图展示了进行体内心电图检测的四个关键操作步骤：诱导麻醉、放置心电图导联电极、记录心电图以及分析心电图数据。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：心电图导联电极放置位置。 三根29号带颜色编码...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养皿	Fisher Scientific	FB087571	100 mm x 20 mm
杜蒙特镊子	Fine Sciense Tools	11253-20	0.1 x 0.06 mm
FE136 动物生物放大器	AD Instruments	FE231
虹膜镊	Fine Sciense Tools	11064-07	0.6 x 0.5 mm
LabChart 8 Pro	AD Instruments		含心电图模块的软件
动物生物放大器用针电极	AD Instruments	MLA1213	29 号
塑料一次性移液管	Fisher Scientific	13-669-12	6 英寸，1.2 mL
PowerLab 4/35	AD Instruments	4//35
三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）	Sigma	E10521-10G	MS-222