Drosophila 幼虫成虫盘解剖：一种观察发育中上皮组织的方法

摘要

来源：Morimoto, K. 和 Tamori, Y. 肿瘤的诱导与诊断 果蝇 成虫盘上皮. 视频实验杂志 (2017).

在对Drosophila成虫盘进行染色时，通常先进行粗略解剖，使成虫盘暴露但仍与身体相连。染色完成后，再分离出目标成虫盘并进行封片。本示例方案演示了翅成虫盘的解剖与封片操作流程。

方案

本方案节选自 Morimoto 和 Tamori, 肿瘤的诱导与诊断 果蝇 成虫盘上皮 视频实验杂志 (2017).

1. 幼虫解剖

1. 使用木棒或钝头镊子收集游走期三龄幼虫，在荧光体视显微镜下通过合适的荧光标记（例如，EGFP）鉴定其基因型，并将其放入含有PBS（磷酸盐缓冲液）的解剖皿中。
2. 用2 mL塑料移液管吸取PBS清洗幼虫。
3. 用一把镊子夹住幼虫中部，用另一把镊子将虫体撕成两半。
4. 用一把镊子夹住前半段的口钩，用另一把镊子将口部推向虫体，使虫体外翻。
5. 用镊子去除唾液腺或脂肪体等不需要的组织。

2. 固定与抗体染色

1. 将解剖得到的幼虫体前半部分（包括翅成虫盘）转移至1.5 mL塑料离心管中，加入1 mL固定液（含4%甲醛的PBS），于室温避光、轻柔旋转条件下固定10分钟。
   注意：甲醛具有毒性并可能致癌。操作时应穿戴防护手套和防护服，避免皮肤接触。
   注意：本部分所有步骤均在室温避光条件下于振荡器上进行，除非另有说明。
2. 移除固定液并弃去。用1 mL PBT（含0.3% Triton X-100的PBS）清洗组织3次，每次15分钟。
3. 移除PBT，加入1 mL PBTG（含0.2%牛血清白蛋白和5%正常山羊血清的PBT）进行封闭，于室温振荡孵育1小时，或于4 °C孵育过夜。
4. 移除PBTG，加入用PBTG适当稀释的一抗溶液（参见材料表），于4 °C振荡孵育过夜。
5. 移除一抗溶液，用1 mL PBT清洗组织3次，每次15分钟。
6. 移除PBT，加入用PBTG适当稀释的二抗溶液（1:400）。于室温振荡孵育2小时，或于4 °C孵育过夜。
7. 移除二抗溶液，用1 mL PBT清洗组织2次，每次15分钟。
8. 为染色F-肌动蛋白，移除PBT，加入用PBS适当稀释的鬼笔环肽（Phalloidin）溶液（1:40），振荡孵育20分钟。移除鬼笔环肽溶液，用1 mL PBT清洗组织2次，每次15分钟。
9. 为对核DNA进行复染，移除PBT，加入DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）溶液（含0.5 µg/mL DAPI的PBS），振荡孵育10分钟。
   注意：DAPI具有潜在致癌性。操作时应穿戴防护手套和防护服，避免皮肤接触。
10. 移除DAPI溶液，用1 mL PBT清洗组织2次，每次15分钟。
11. 用1 mL PBS于室温下清洗一次，持续10分钟。
12. 移除PBS，加入500 µL 100%甘油作为预封片介质。

3. 载玻片封片

1. 使用2 mL塑料移液管将染色的组织置于显微镜载玻片上。
2. 用镊子将组织转移到另一张载玻片上的封片剂液滴中。
3. 用一把镊子固定解剖后组织的一端，用另一把镊子轻轻剥离脑组织及眼-触角原基盘。
   注意：保留解剖得到的脑组织，并将其放置在翅成虫盘附近。脑组织可作为支撑平台，防止盖玻片压碎翅成虫盘。
4. 为分离翅成虫盘，用一把镊子固定解剖后组织的一端，用另一把镊子轻轻刮擦体壁并撕下成虫盘。
   注意：若难以找到翅成虫盘，可从后向前剥离气管，翅成虫盘通常附着于气管上。
5. 轻轻盖上盖玻片覆盖成虫盘，并用指甲油封固；于4 °C保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
磷酸盐缓冲液（PBS）	Wako	162-19321
TritonX-100	Wako	168-11805
甲醛	Wako	064-00406
牛血清白蛋白	Sigma	A7906
正常山羊血清	Sigma	G6767
封片剂，Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
DAPI	Sigma	D9542
鼠抗-Dlg 4F3	发育研究杂交瘤库	4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203	用PBTG稀释，1:40
鼠抗-MMP1	发育研究杂交瘤库	3A6B4, RRID:AB_579780	3种混合比例1:1:1，用PBTG稀释，1:40
鼠抗-MMP1	发育研究杂交瘤库	3B8D12, RRID:AB_579781	3种混合比例1:1:1，用PBTG稀释，1:40
鼠抗-MMP1	发育研究杂交瘤库	5H7B11, RRID:AB_579779	3种混合比例1:1:1，用PBTG稀释，1:40
鼠抗-atubulin	发育研究杂交瘤库	AA4.3, RRID:AB_579793	用PBTG稀释，1:100
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Molecular probes	A22283	用PBS稀释，1:40
山羊抗小鼠IgG抗体，Alexa Fluor 546	Molecular probes	A11030	用PBTG稀释，1:400
果蝇品系
sd-Gal4	Bloomington果蝇保种中心	#8609	与UAS-EGFP重组
upd-Gal4	Bloomington果蝇保种中心	#26796	与UAS-EGFP重组
UAS-lgl-RNAi	维也纳果蝇RNAi中心	#51247
UAS-scrib-RNAi	维也纳果蝇RNAi中心	#105412
UAS-RasV12	Bloomington果蝇保种中心	#64196
UAS-Yki3SA	Bloomington果蝇保种中心	#28817
hsFLP	Bloomington果蝇保种中心	#6
Act>CD2>GAL4（flip-out GAL4）	Bloomington果蝇保种中心	#4780	与UAS-EGFP重组
UAS-EGFP	Bloomington果蝇保种中心	#5428	X染色体
UAS-EGFP	Bloomington果蝇保种中心	#6658	第三染色体
UAS-Dicer2	Bloomington果蝇保种中心	#24650	第二染色体
UAS-Dicer2	Bloomington果蝇保种中心	#24651	第三染色体
vkg-GFP	Morin 等，2001		GFP蛋白捕获