Drosophila 雄性附属腺解剖：一种分离次级细胞的方法

摘要

来源：Immarigeon, C., 等. 一种基于流式细胞分选的果蝇雄性附属腺次级细胞RNA分离方案. J. Vis. Exp. (2019).

本视频介绍了从雄性果蝇中解剖副腺的方法，并展示了一个将分离的腺体解离为单细胞悬液的示例。

方案

本方案节选自 Immarigeon 等一种基于流式细胞术的方案，用于从附属细胞中分离RNA 果蝇 雄性附属腺体， 视频实验杂志 (2019).

1. 溶液与材料准备

1. 配制以下溶液。
   1. 配制含血清培养基（SSM）：在Schneider's Drosophila 培养基中添加10%热灭活胎牛血清和1%青霉素-链霉素。
   2. 分装1×胰蛋白酶酶溶液（例如TrypLE Express酶），并于室温保存。
   3. 分装木瓜蛋白酶溶液［50 U/mL］（储存于-20 °C，仅解冻一次）。
   4. 配制1×磷酸盐缓冲液（PBS，室温储存）。
2. 准备多个经火焰拉圆的移液器吸头，用于附腺的物理解离。
   注意：操作附腺时应使用低吸附性吸头，因其容易粘附于未经处理的塑料表面。火焰拉圆处理可缩小吸头开口并使边缘更光滑，从而在肽酶消化后实现有效的组织解离，同时避免细胞膜剪切损伤。
   1. 用锋利刀片切下一支200 µL吸头，并轻轻在火焰上过火，使其尖端变圆，开口更宽且光滑，便于后续2.7步骤操作。
   2. 将多个1,000 µL吸头的开口在火焰附近快速通过不到一秒，以缩小其开口。轻微旋转吸头以避免过度熔化或堵塞。根据开口大小从窄到宽进行分类，可通过测定吸液速度来判断。建议先用少量附腺样本测试最窄吸头的解离效率。
      注意：这些吸头对机械振荡至关重要。高质量的火焰拉圆吸头可在保持细胞活力的同时实现完全解离。因此，每次实验结束后需用清水彻底清洗这些吸头以供重复使用，从而确保每日实验间解离效果的可重复性。

2. 附属腺体的解剖

1. 将20至25只雄性Drosophila放入玻璃培养皿中，置于冰上。
2. 在SSM中解剖1只雄蝇。取出其生殖道，并将副腺成对分离，仅保留射精管，去除其他所有组织。
   注意：需去除睾丸，因为释放的精子可能形成团块，干扰解离过程。同时去除射精囊，因其漂浮时会增加操作难度。
3. 用镊子将副腺转移至室温下盛有SSM的玻璃板中。重复步骤2.2–2.3共20次，以获得一批20对副腺置于SSM中。
   注意：这些步骤应在15至20分钟内完成。副腺应呈现健康状态，且腺体周围肌肉层的蠕动应可见。可使用荧光显微镜监测GFP表达。
4. 将副腺转移至1x PBS中，在室温下洗涤1–2分钟。
   注意：为获得更好的解离效果，必须用PBS冲洗副腺。但此步骤时间应尽量缩短，因细胞在PBS中会出现应激反应；解离后的次级细胞在PBS中会迅速肿胀并死亡。
5. 将20 µL木瓜蛋白酶[50 U/mL]加入180 µL 1x胰蛋白酶溶液中，配制成解离液（按比例放大或缩小：每只雄蝇使用9 µL胰蛋白酶和1 µL木瓜蛋白酶）。用镊子将副腺转移至该溶液中。
6. 将副腺远端（含次级细胞）与近端部分分离。用精细镊子牢固夹住腺叶中部，并用第二把镊子的尖端将其切断。去除副腺的近端部分及射精管，以提高解离效率并减少细胞分选时间。
   注意：从20对副腺中分离远端部分约需15至20分钟，肽酶消化过程因此将在室温下开始。
7. 完成所有腺体尖端的分离后，使用步骤1.2.1中准备的特制200 µL移液枪头，将腺体尖端转移至1.5 mL离心管中。枪头应宽大、圆润，并在操作前润湿。
   注意：吸取副腺组织时，枪头必须预先用适当溶液（胰蛋白酶溶液或SSM）润湿（为此目的，各准备一管上述溶液）。每次更换样本前应仔细冲洗枪头，避免交叉污染。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于解剖的双目显微镜
带光源的双目显微镜（用于GFP观察）
本生灯
1.5 mL塑料微量离心管	Eppendorf
精细解剖镊
胎牛血清	Gibco	10270-106	使用前需热灭活
解剖用玻璃培养皿
冰桶
P1000移液器	Gilson
P20移液器	Gilson
P200移液器	Gilson
木瓜蛋白酶（Papain）			50U/mL储备液
PBS缓冲液			自行配制
青霉素-链霉素溶液	Gibco	15070-063
Schneider’s 果蝇培养基	Gibco	21720-001
Tipone 1250 μL带刻度吸头	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μL斜面吸头	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express酶	Gibco	12604013