岛状检测法：一种高通量评估方法 果蝇 运动行为

摘要

来源：Eidhof, I., 等。 高通量分析运动行为的 果蝇 岛屿实验. 视频实验杂志 (2017).

本视频介绍了岛屿实验（island assay），这是一种用于研究果蝇（Drosophila）运动行为的方法。示例实验方案展示了一种适用于半自动化图像分析的实验装置。

方案

本方案节选自Eidhof 等高通量分析运动行为的 果蝇 岛状体检测 视频实验杂志 (2017).

1. 岛屿测定箱的构建

1. 准备一个由坚固材料（如聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA）制成的托盘，用于盛放一层水即 水浴）。确保材料不是白色。
   注意： 40 x 35 x 2.5 cm³ 建议使用（图1A).
2. 准备一个盒子（42 x 38 x 25 cm）³）由坚固的透明材料（如PMMA）制成，用于环绕水浴装置，防止果蝇逃逸至实验室空间。在侧面开一个孔（20 × 30 cm²）位于侧面，空间足够大，便于实验人员轻松操作装有果蝇的离心管，并将其放置到岛上（图1A).
3. 制备一个 10 x 15 x 2.5 cm 的 elevated platform³ 尺寸合适，由不透水材料（PMMA 或塑料）制成，且密封防水。
   注意： 该平台需要具有均匀的白色表面，以确保图像分析时具有良好的对比度。平台尺寸并非必须固定，但应足够大，以确保所有果蝇最初均能落在平台上，并有机会在上面爬行（图1A).
4. 通过将平台用胶水固定在浴槽中，或在平台盒内放置重物或其他较重物体，以防止在实验或拍摄过程中平台位置发生移动。

2. 软件需求与安装

1. 安装图像记录软件。
   1. 下载用于记录岛状图像序列的图像记录软件（参见材料表），并将该软件安装在计算机上。
      注意：本实验方案中描述的图像记录软件仅支持 Windows 系统。其他操作系统的替代方案已添加至材料表中。

3. 岛屿实验中待测果蝇的准备

1. 按照先前所述方法（在1-2天内），在低温或二氧化碳（CO₂）麻醉条件下收集各实验组不同发育阶段的果蝇。
   1. 每种实验条件至少准备3个样品管，每管约含15只发育阶段一致的果蝇。仅使用翅膀完整、年龄和性别相近的果蝇。
      注意： 本实验中，收集了5个样品管，每管含15只雄性果蝇，基因型分别为 w^-; Actin-Gal4/+（对照组）和 w^-; Actin-Gal4/GD11950（tefu RNAi），在羽化当天收集后培养4天，用于进行孤岛实验。RNAi品系、对照品系及Actin-gal4驱动品系均购自商业来源（见材料表）。
2. 让果蝇充分恢复，以避免麻醉剂的影响（若使用CO₂麻醉，至少恢复1天），然后在目标年龄时进行孤岛实验测试。

4. 实验设置

注意：参见图1B。

1. 在浴盘中加入少量肥皂的冷水，并将平台置于盘中央。
   注意： 肥皂可降低水的表面张力，接触水的果蝇会溺亡。这可防止在实验过程中有越来越多的果蝇飞入箱内。
2. 将透明箱放置在托盘上方，并使用光源从上方照射平台。
   注意： 照射平台主要是为了确保视频具有足够的对比度。普通的12 V LED灯即可满足此需求。
3. 将网络摄像头直接置于平台正上方（箱外），并连接至计算机。
4. 在实验开始前，在计算机上创建新文件夹以存储不同的实验数据。
   1. 参照图2A所示示例结构创建文件夹。例如，若实验设计要求测试两种基因型，每种基因型设五个重复，则首先创建一个以实验日期命名的主文件夹；在主文件夹内创建两个子文件夹（每种基因型一个）；在每个基因型文件夹内再创建五个新文件夹，每个重复对应一个文件夹。
      注意： 为便于后续分析，必须将对应于各个独立实验的图像序列保存在名称唯一的文件夹中。

5. 在界面的 "采集设备" 部分设置视频参数

1. 打开图像采集软件，在 "采集" 选项卡下，点击 "时间序列图像…”，并选择适当的网络摄像头作为 "采集设备"。
2. 将一只死亡的果蝇放置于小岛上；通过点击 "视频设置" 框来调整视频参数。滚动工具栏，调节亮度、对比度和颜色，使死亡的果蝇在白色背景上呈现为黑色（图2B）。完成调整后，点击 "确定"。

6. 在界面的 "Time-lapse" 部分设置录制和视频保存参数

1. 调整设置 "延时成像实验设置" 将实验保存为 .avi 文件。单击 "浏览…”，选择视频的存储目录，定义视频名称，然后按 "保存".
   注意： 视频文件不用于数据的定量分析；但可能有助于了解实验的整体情况。
2. 调整设置 "延时成像设置" 部分。
   1. 在压缩框中，选择 "Intel IYUV 代码" 用于视频压缩并选择 "每0.1秒采集一帧图像"，其中的 "回放速率（每秒图像数）：" 在10处。
   2. 通过点击将实验时间序列保存为 .bmp 帧 "高级……” 选择 "为每个捕获的帧创建一个 .bmp 图像". 点击 "浏览". 在 "在 AVI 视频捕获期间" 窗口（在步骤6.1中选择），单击 "打开"，然后按压 "好的".
      注意： 注意，在实验过程中，帧图像以 .bmp 文件格式存储（数据分析所必需）。程序将帧图像命名为 "A" 随后是与帧捕获序列对应的编号（例如, "A_number.bmp") (图2C). 请始终将属于不同实验的图像保存在新的文件夹中，以确保之前记录的图像序列不会被覆盖。请注意，除非在下方选择该文件夹，否则图像不会自动保存到与视频文件相同的文件夹中。 "浏览……”点击后 "高级" 盒子

7. 岛状实验与数据采集

1. 按下图像记录软件中延时图像界面的开始按钮，以启动记录。
2. 轻敲装有果蝇的实验小瓶（步骤3）2-3次，确保果蝇位于瓶底。迅速拔去瓶塞，并用力将小瓶在平台表面敲击一下，使所有果蝇同时落入平台（图1C）。
3. 约30秒后，按下 "停止" 按钮以结束记录。
   注意：如果所有果蝇均已离开平台，可提前终止记录。
4. 图像记录停止后，手动移除仍在平台上停留30秒的果蝇。
5. 在进行下一个实验记录之前，更改.bmp文件和视频的存储目标目录（参见第6节）。

结果

图 1：概述岛屿实验所需条件、实验步骤及分析流程的流程图。 （A）岛屿实验设备。（B）岛屿实验的实验设置。（C）岛屿实验。（D）使用“Drosophila Island Assay”宏处理岛屿实验数据。“Drosophila Island Assay”宏由三个子宏组成：1）生成图像栈与投影图，2）定义平台区域，3）分析。（E）使用“Island Assay Analysis”脚本进行数据处理与统计评估。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25 x 95 mm 果蝇小瓶	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 高清网络摄像头	Logitech	-	任何带 USB 接口的网络摄像头均适用。
用于固定网络摄像头的支架	-	-	-
光源灯	-	-	12 V LED 灯合适
减震垫	-	-	任何鼠标垫均可使用
孤岛实验箱	-	-	尺寸为 40×35×2.5 cm，中间开孔为 20×30 cm，透明材质。
孤岛实验浴槽	-	-	尺寸为 42×38×25 cm，非白色。
孤岛/平台	-	-	尺寸为 42×38×25 cm，均匀白色表面。
肥皂	-	-	普通洗洁精即可使用。
计算机	-	-	脚本可在 Windows 和 Mac 系统上运行
图像采集软件：HandiAvi&reg;	AZcendant&reg;	-	HandyAvi 仅兼容 Windows 系统，本文中已全面描述其使用方法。<br/> 可从以下网址下载：<a href="http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html" target="_blank">http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html</a>（版本 5.0）
图像采集软件：WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ 插件，可在 Mac 系统上作为 HandyAvi 的替代方案用于图像采集，可从以下网址下载：<br/> <a href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/</a> <br/>使用此方法时，用户必须采用本文所述的相同文件夹结构和图像采集设置，<br/> 唯一例外是：对于每个实验重复，捕获的图像堆栈应导出为 Stack.tiff 文件，并保存至<br/>对应的实验重复文件夹中。<br/>在对该数据运行“Drosophila Island Assay”宏时，“First frame identifier”设置中不应包含任何文本。