Drosophila melanogaster 寿命实验方案：生成生存曲线以鉴定果蝇寿命差异

摘要

来源：Bovier, T. F. 等人 检测内分泌干扰的方法 黑腹果蝇. J. Vis. Exp. (2019).

科学家使用黑腹果蝇（Drosophila）寿命实验方案来测量不同实验条件对果蝇寿命的影响，并在此过程中生成生存曲线，以量化实验结果。本示例方案描述了该检测方法在研究不同浓度的内分泌干扰物化学物质（EDC）（如17-α-乙炔雌二醇（EE2））对寿命影响中的应用。

方案

本方案节选自 Bovier 等 检测内分泌干扰的方法 黑腹果蝇， J. Vis. Exp. (2019).

1. 食物制备

1. 用于果蝇品系保种及幼虫生长，使用含3%干酵母粉、10%蔗糖、9%预煮玉米粉、0.4%琼脂的玉米粉培养基，以下简称玉米粉培养基（CM）。
   1. 将30 g酵母加入100 mL自来水中，煮沸并持续沸腾15分钟。
   2. 另取900 mL自来水，充分混合90 g预煮玉米粉、100 g蔗糖和4 g琼脂。
   3. 将上述溶液煮沸，调低火力，持续搅拌并煮5分钟。
   4. 5分钟后，加入热的酵母溶液，继续小火加热15分钟。
   5. 关闭热源，使溶液冷却至约60 °C。
   6. 加入5 mL/L的10%对羟基苯甲酸甲酯乙醇溶液，充分混匀，静置10分钟。
      注意：需谨慎控制对羟基苯甲酸甲酯的用量，因其浓度过高可能对幼虫具有致死作用。
   7. 将培养基分装至小管或瓶子中：每支果蝇管（25 mm × 95 mm）分装8 mL，每支果蝇管（22 mm × 63 mm）分装3 mL，每瓶果蝇瓶（250 mL）分装60 mL。
   8. 用纱布覆盖管口，在室温（RT）下干燥24小时后储存。
   9. 通过调整琼脂用量和/或冷却/干燥时间，实验性地校准CM培养基的合适稠度和含水量。
      注意：未加塞、装盒并包裹的培养管在4 °C下可稳定保存约15天。
2. 对于果蝇成虫，使用含10%干酵母粉、10%蔗糖、2%琼脂的培养基，以下简称成虫培养基（AM）。
   1. 将10 g干酵母粉、10 g蔗糖和2 g琼脂加入100 mL蒸馏水中，充分混合。
   2. 使用微波炉将该混合物煮沸两次，每次间隔3分钟，或持续加热至琼脂完全溶解。
   3. 当溶液冷却至60 °C时，加入5 mL/L的10%对羟基苯甲酸甲酯乙醇溶液，充分混匀后分装至管中（每管10 mL）。
   4. 用纱布覆盖管口，在室温（RT）下干燥24小时后储存。
      注意：未加塞、装盒并包裹的培养管在4 °C下可稳定保存约15天。

2. 果蝇 EDC 给药

1. 配制适当浓度的储备液：将选定的EDC溶于合适的溶剂中。对于EE2（分子量296.403），取1.48 g溶于10 mL 100%乙醇中，配制成0.5 M的储备液，并于-80 °C保存。
   注意：环境内分泌干扰物（EDC）被视为环境污染物，操作时应采取适当防护措施。
2. 用10%乙醇水溶液（v/v）稀释EE2储备液，获得100 mM的溶液。随后在玉米粉培养基（CM培养基）中进行进一步稀释（0.1 mM、0.5 mM和1 mM），从最低浓度开始，并确保各处理组中溶剂的最终浓度一致。对照组小瓶中仅加入相同体积的溶剂。
   注意：建议尽可能降低溶剂的最终浓度，同时注意乙醇在果蝇培养基中的终浓度不应超过2%。
3. 在玉米粉培养基凝固前，将含有适当稀释度的选定EDC的溶液加入其中，使用食物处理器充分混匀，分装10 mL至各小瓶中，覆盖棉纱布，室温下静置干燥16小时后使用。
   注意：该培养基应在配制完成后立即使用。
4. 成虫饲养时，分别用10%乙醇水溶液（v/v）配制不同工作浓度的EE2溶液（10 mM、50 mM和100 mM），并将每种溶液各100 µL均匀涂布于AM培养基表面，以获得目标浓度的EE2（0.1 mM、0.5 mM和1 mM）。对照组仅使用相同体积的溶剂。
   注意：也可将含有适当稀释度的选定EDC的溶液加入少量AM培养基中（置于50 mL锥形管内），充分涡旋混匀后，取1 mL涂布于AM小瓶表面。
   1. 小瓶覆盖棉纱布，在室温下轻轻振荡条件下干燥12–16小时，随后立即使用。
      注意：干燥过程需根据实验条件优化，因其受环境湿度影响。

3. 果蝇的饲养

1. 使用遗传背景稳定的同源品系（如 Oregon R），并在实验室中连续培养多代。
2. 将果蝇饲养于湿度和温度可控的培养箱中，在 25 °C 条件下采用 12 小时光照：12 小时黑暗的自然光周期，培养基为含 CM 食物的试管。
3. 每次实验均使用处于室温（RT）条件下的试管。

4. 寿命实验方案

1. 准备20个果蝇小瓶，每瓶放入8只雌性和4只雄性，置于25 °C下培养，每瓶加入10 mL CM培养基。
2. 4天后弃去果蝇，并将小瓶重新放回培养箱。
   注意：这些果蝇可用于重新起始培养，以获得其他年龄同步的果蝇群体。
3. 第9天的傍晚，从小瓶中移除所有新羽化的果蝇，并将小瓶放回培养箱。
   注意：少数成虫最早可在第9天开始羽化；弃去这些早期羽化的个体，有助于收集最大数量的同步化果蝇，避免因选择早期羽化个体而引入偏差。
4. 16–24小时后，将两种性别的成年果蝇（1日龄）分别转移至装有AM培养基的250 mL瓶中，共分为四组：其中三组分别添加不同浓度的EDC，另一组仅添加溶剂对照。如有需要，可在次日再收集一批果蝇。
5. 将果蝇维持在25 °C下培养2–3天，使其完成交配。
   注意：转移至AM培养基小瓶的当天记为成虫期的第一天。
6. 2–3天后，在轻度CO₂麻醉条件下，按性别将每组果蝇分为两组，并将每种性别的个体随机均分为每个处理组5个小瓶，每瓶20只果蝇，每种性别每种处理最终设置3个重复，每个重复包含5个平行小瓶。
   注意：操作时应分批处理少量果蝇，以避免因长时间暴露于CO₂麻醉而导致潜在的健康问题。
7. 建立一个寿命记录电子表格，通过从上一次转移时的存活果蝇数中减去死亡果蝇数，自动计算每次转移时的存活数量。
8. 每隔3天在同一时间将果蝇转移至含有相应培养基的新小瓶中，并检查死亡情况。
   注意：转移过程不得使用麻醉，以免对果蝇寿命产生长期负面影响。
   1. 每次转移时，记录果蝇的年龄及死亡果蝇数量。
      注意：存活果蝇数量将在电子表格中自动计算，但仍建议进行目视核对。在转移过程中意外逃逸或死亡的果蝇不应计入统计。注意避免将被带入新小瓶的死果蝇重复计数，应在电子表格中注明此情况。
   2. 重复步骤4.8和4.8.1，直至所有果蝇死亡。
9. 针对每个处理组，绘制如图1所示的生存曲线，以展示果蝇在任一特定时间点的生存概率。
10. 对每个果蝇处理组进行三次独立实验，每次实验使用100只新羽化的果蝇。
11. 制作一个表格，记录各组的平均寿命（每组所有果蝇的平均存活天数）、半数死亡时间（达到50%死亡率所需的天数）以及最大寿命（达到90%死亡率所需的最长天数）。
12. 计算各处理组相对于对照组的百分比差异。
13. 进行统计学分析，比较不同处理组之间的差异。

结果

图1：寿命曲线。 左侧为一个代表性数据表，记录了在整个实验期间，处理组（培养基 + EDC [0.05 mM EE2]）和对照组（培养基 + 溶剂）果蝇每3天的死亡数量。各组的平均寿命通过MATRIX SUM.PRODUCT计算得出；与对照组相比，处理组的平均寿命缩短。右侧显示了雄性果蝇饲喂含EE2（0.05 mM）培养基或仅含乙醇（对照组）的典型生存曲线。处理组果蝇的存活曲线下降更为迅速，且出现较早的拐点。请点击此处查看此图的放大版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
17α-乙炔雌二醇	Sigma	E4876-1G
果蝇培养基用琼脂	BIOSIGMA	789148
玉米粉	CA' BIANCA
果蝇培养管	BIOSIGMA	789008	25 mm × 95 mm
果蝇培养管	BIOSIGMA	789009	29 mm × 95 mm
果蝇培养管	Kaltek	187	22 mm × 63 mm
乙醇	FLUKA	2860
玻璃瓶			250 mL 瓶
玻璃小瓶	Microtech	ST 10024	平底管 100 × 24
Instant Success 酵母	ESKA		粉末酵母
对羟基苯甲酸甲酯	SIGMA	H5501
带LED光源的体视显微镜	Leica		S4E
蔗糖	HIMEDIA	MB025
手持式搅拌机 Pimmy	Ariete		食物处理器