Drosophila 神经肌肉接头（NMJ）定量分析：一种评估突触形态与功能的方法

摘要

来源：Castells-Nobau, A. 等 两种用于高通量、多参数定量分析的算法 黑腹果蝇 神经肌肉接头形态学. J. Vis. Exp. (2017).

果蝇神经肌肉接头（NMJ）被用作研究突触形态与功能的模型。本视频介绍了研究人员用于表征 NMJ 的若干重要特征。示例方案展示了一种能够自动完成这些定量分析的软件。

方案

本方案节选自 Castells-Nobau 等两种用于高通量、多参数定量分析的算法 果蝇 N神经肌肉接头形态学， 视频实验杂志. (2017).

1. 图像处理前的准备工作

1. 执行 果蝇 如前所述，制备三龄游走幼虫（L3）的敞口书状样本。
2. 共免疫标记 果蝇 使用两种标记物组合对NMJ终末进行分析：Dlg-1或Hrp与Brp联合使用 "果蝇 神经肌肉接头形态计量学"，以及Syt或Csp与Brp共同用于分析 "果蝇 神经肌肉接头终末支形态测量".
   注意： 同一物种的抗体可通过抗体偶联试剂盒（如 Zenon Alexa 标记试剂盒）对其中一种抗体预先标记来实现联合使用。
3. 使用选定的显微镜对神经肌肉接头终末进行成像， 例如， 荧光显微镜（可选ApoTome）或共聚焦显微镜
   1. 获取NMJ终末的双通道图像序列。
      1. 调整显微镜设置，使通道1采集用Dlg-1（或Hrp、Syt、Csp）免疫标记的NMJ终末，通道2采集用Brp免疫标记的NMJ终末。
      2. 可选地，使用宏分析单通道图像（仅用一种抗体免疫标记突触的图像）。图像中的神经肌肉接头（NMJs）仅用 Dlg-1 或 Hrp 进行免疫标记，用于分析 "果蝇 神经肌肉接头形态计量学"，或 Syt 或 Csp 用于 "果蝇 神经肌肉接头终末支形态测量".
         注意： 仅使用抗Brp抗体进行免疫染色无法分析突触。
   2. 将获得的图像导出为单独的 .tiff 文件。如果图像未按指定方式采集，在运行宏之前需先反转通道顺序。

2. 软件要求与安装

1. 从以下网站下载宏："Drosophila NMJ Morphometrics" 和 "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics"：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1。
2. 将光标移至文件夹 "Macros update 1"，点击出现的选项 "view"，该文件夹内容的列表将显示出来。此文件夹包含宏 "Drosophila NMJ Morphometrics" 和 "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics"。
   注意：两个宏均兼容 Fiji 1.4 版本，该版本也提供在同一文件夹中。这些宏可能无法在较新版本上运行。请使用提供的 1.4 版本。即使计算机上已安装较新版本的 Fiji，启动此版本也无任何问题。
3. 点击 "Download all"。文件夹内容将以 .zip 文件形式下载到计算机。解压缩下载的文件。
4. 将 Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm 和 Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm 文件复制到 Fiji.app/plugins/ 目录中。重新启动程序后，这些宏将出现在 Plugins 下拉菜单的底部。

3. 运行子宏 "Convert to Stack" 以创建 NMJ 图像的 Z 投影和超堆栈

1. 通过在工具栏中选择“插件”，然后在下拉菜单中选择 "Drosophila NMJ Morphometrics"，启动图形界面。
2. 在宏的图形界面中定义 "Unique File String" 设置。
   注意： 显微镜软件在将图像堆栈保存为单独的 '.tiff 文件时，会使用一个识别标识来组织各平面和通道。输入的唯一文件字符串必须指定软件分配给第一通道第一平面的标识（重要：需标明最低的平面和通道编号）。
3. 仅选择子宏 "Convert to stack"，然后点击 "ok"，并选择图像所在的文件夹。如果选择的是包含多个子文件夹的主目录，则主目录及子文件夹中所有符合唯一文件字符串条件的单独 '.tiff 文件都将被处理。
   1. 如果 z 堆栈仅包含一个通道，请选中 "Channel 1 only" 复选框。
4. 注意每个 NMJ 图像将默认生成两个新文件，分别命名为 stack_image_name 和 flatstack_image_name。仅保存这些堆栈（stack）和展平堆栈（flatstack）文件用于后续分析。此时可删除原始的 .tiff 文件序列，以减少存储空间需求并避免潜在的错误来源。

4. 运行子宏 "Define ROI" 以勾画目标NMJ终末区域

1. 启动图形界面 "果蝇 神经肌肉接头形态计量学".
2. 仅选择复选框 "定义感兴趣区域" 并按压 "好的" 并选择存储名为 flatstack_name 的图像的主目录，然后按 "选择". 亚宏观 "定义感兴趣区域" 自动搜索所选主目录内的所有子文件夹。
3. 当第一个投影打开时，选择 "徒手选择" 工具栏中的工具。
4. 使用鼠标绘制一个仅包含目标完整神经肌肉接头终末的选区，然后单击 "好的" 在窗口中 "定义末端"宏将继续执行下一个投影。
5. 勾画下一个感兴趣区域（ROI），并重复此步骤直至所有感兴趣区域均被定义。该ROI图像文件命名为 "roi图像名称"将与已处理图像生成的堆栈图像和投影图像存储在同一目录中。该子宏的输出结果为二值图像，其中感兴趣区域（ROI）以白色显示，背景为黑色。

5. 运行子宏 "Analyze" 以量化 NMJ 终末特征

1. 转到工具栏，选择 "插件" 并使用：
   "果蝇神经肌肉接头形态计量学" 在分析使用抗-Dlg-1 或抗-Hrp（通道 1）与抗-Brp（通道 2）进行免疫标记的突触时，或 "果蝇神经肌肉接头突触小结形态计量学" 在分析使用抗Syt或抗Csp抗体（通道1）与Brp（通道2）进行免疫标记的突触时。
   1. 当需要分析单通道图像堆栈时（结构通道 Dlg-1 或 HRP） "果蝇神经肌肉接头形态计量学"，或 Syt 或 Csp 用于 "果蝇神经肌肉接头突触小结形态计量学")，选中该复选框 "仅通道1".
2. 调整待分析图像的对应比例尺。
   1. 如果图像中一个像素对应 2.5 µm，则设置 Scale-Pixels = 1，Scale-Distance in µm = 2.5。若上述两项均保持为 0，则神经肌肉接头（NMJ）的面积、周长、长度和最长分支长度将以像素数量表示。
3. 如有需要，调整该宏的默认分析设置。仅当子宏 "分析" 此前运行时结果不理想（参见本节末尾及第6节，了解如何优化设置的说明）。
4. 选择复选框 "分析" 和 "等待" 并按压 "好的".
   1. 选择 "等待" 运行子宏时勾选复选框 "分析" 在双通道图像上进行。否则，由于计算机容量有限，可能导致活性区计数出现错误。
5. 作为一个新窗口 "选择一个目录" 打开，选择图像所在的目录，然后按 "选择"该宏将分析主目录中存储的所有图像，并在适用情况下分析后续文件夹中的图像（使用执行前述子宏生成的三个文件：stack_image_name、flatstack_image_name 和 roi_image_name）。该宏会逐个连续处理每幅图像。每幅图像堆栈的处理可能需要数分钟时间（具体取决于计算机性能）。
6. 运行宏后，注意每个被分析的突触将在父文件夹中生成一个名为 res_image_name 的新图像文件。定量测量结果将被存储为 "results.txt" 文件。
7. 检查所有结果图像，以发现并排除存在分割错误的图片。可能的分割错误在下文中有详细描述。 表1，以及如何调整设置以避免这些错误的建议。存在此类分割错误的结果图像已在示例中提供 图1.
   注意： 当使用用户界面中默认设置运行宏时，宏评估与人工评估相比，准确率约为95%。

6. 调整图像的宏设置

1. 当超过 5% 的图像出现分割错误时，尝试不同的算法以确定/选择最适合图像的宏设置。
2. 调整滚动球半径值
   注意： 滚动球半径功能用于减去图像的背景。在使用荧光显微镜获取的图像上进行操作和/或图像具有高背景噪声时，此功能至关重要。减去背景有助于宏的自动阈值步骤对 NMJ 终末进行适当的分割。
   1. 选择由子宏 "Convert to stack" 生成的三个 NMJ stack_image_name 图像。选择能够代表整个图像数据集的图像。
   2. 在工具栏中，选择 Image | Color | Split channels。将创建两个图像堆栈，分别代表通道 1 和通道 2，并保存它们。
   3. 打开属于通道 1 的图像堆栈，该通道对应于 Dlg-1、Hrp、Syt 或 Csp 免疫标记。
   4. 通过在工具栏中选择 "Process"，然后在下拉菜单中选择 "Subtract Background…" 来运行 "Subtract background" 滤波器。
   5. 在弹出窗口中点击预览复选框，并将滚动球半径调整为最适合图像的值。"Rolling ball radius" 设置应调整至能增强突触与背景之间对比度的数值（见 图 2A'）。
      1. 参见 图 2 中的示例。在面板 A 中，部分突触的灰度水平与背景相同；而在 图 2 的面板 A' 中，将 "Rolling ball radius" 设置为 500 时，突触与背景之间的对比度显著增强。
   6. 在工具栏中选择 Image | Stack| Z-projection 创建 z 投影，选择投影类型 = 最大强度，并保存结果图像。当确定了合适的滚动球半径值后，使用相同的滚动球半径值对剩余的代表性图像运行 "Subtract background" 算法。创建 Z 投影并保存（可保存至任意目录）。
      注意： 对于 8 位或 RGB 图像，滚动球半径值应至少等于图像中不属于背景的最大对象的半径。对于 16 位和 32 位图像，半径应与像素值范围成反比。
3. 确定将使用的不同自动阈值
   1. 打开上一步（6.2.6）中保存的 Z 投影图像，选择 Image | Adjust | AutoThreshold | Try all。
   2. 所有不同的自动阈值算法将以二值化阈值结果图像的形式显示，据此确定最适合图像的算法。
      1. 稍后运行宏时，应相应地更改宏设置中的阈值。
      2. 使用更严格的阈值（如 "RenyiEntrophy" 或 "Moments"）作为 NMJ 轮廓的阈值，使用更宽松的阈值（如 "Li"）来确定 NMJ 骨架，使用 "Huang" 来确定活性区。当图像非常清晰且背景极少或无背景时，可使用 "Huang" 作为 " NMJ 轮廓阈值。否则，图像分割后可能会缺失部分突触。
      3. 参见 图 2B 中的示例。绿色框突出显示的自动阈值可实现突触的适当分割。红色框突出显示了一些不合适的阈值（在高倍镜下检查突触）。在后者中，要么突触的部分缺失，要么包含了部分背景。
4. 确定小颗粒的最大尺寸
   注意： 此功能将从分析中排除由 NMJ 轮廓阈值和骨架阈值检测到的所有小于 "small particles setting" 中定义值的颗粒。该值以像素为单位。此功能作为噪声滤波器，在所获图像中存在大量非均匀背景（如晶体/灰尘）时非常有用。
   1. 打开第 6.2.6 步中保存的 Z 投影图像，并通过 Analyze | Set Scale 设置比例以检测像素数量。应用以下设置：像素距离 = 1，已知距离 = 1，像素纵横比 = 1，长度单位 = 像素，然后点击 "Ok"。点击工具栏中的 "Oval selection" 工具。
   2. 使用鼠标绘制一个紧密包围免疫染色中存在但不属于 NMJ 的单个颗粒的选择区域。Windows 用户按 Ctrl+m，Mac 用户按 cmd+m。将打开一个结果窗口，显示所选颗粒的面积（以像素数表示）。
   3. 对图像中存在的多个伪影重复上述步骤数次，以确定最大的污染颗粒/伪影面积。该值即为稍后运行宏时在设置中应设定的值。运行宏时，将 "Small Particles Size" 设置为观察到的最小颗粒尺寸再增加 25% 的余量。
   4. 参见 图 2D 中的示例。检测到的最大晶体面积为 112 像素。在使用宏处理此图像时，"Small particles size" 设置应设为 125 - 150。
5. 确定最小突触小结尺寸
   注意： 此功能将从分析中排除由 NMJ 轮廓阈值检测到的所有小于设定值的突触小结。该值以像素为单位。
   1. 按照第 6.4 节所述的相同步骤操作，但此次绘制一个包围 NMJ 终末中最小突触小结的选择区域。选择所测突触小结中对应于最小面积的值。该值即为稍后运行宏时在最小突触小结尺寸设置中应设定的值。
6. 定义 "Maxima noise tolerance" 值
   1. 为确定宏的 "Find maxima noise tolerance" 值，打开第 6.2.2 节中保存的通道 2 Z 堆栈。
   2. 转到弹出菜单中的插件选项卡，选择 Process | Maximum(3D)，当 maximum_image_name 出现时（可能需要几分钟），关闭原始图像堆栈。
   3. 选择 Maximum…_image_name（新获得的图像堆栈），然后选择 Plugins | Process | Minimum (3D)，当新的图像 Minimum of Maximum…_image_name 出现时，关闭 Maximum… _image_name 堆栈。
   4. 在工具栏中，选择 Process | Find maxima…。将打开一个名为 "Find maxima…" 的新窗口。点击复选框 "Preview point selection…"，并在 "Noise tolerance" 框中填入宏的默认设置值 50。最大值点将以小十字的形式在图像中标出。
      1. 如果观察到过多的标注活性区（即不在活性区上方、不在所选堆栈平面焦点上的十字，或在背景中检测到的假活性区），则增加 "Noise tolerance" 值。
         1. 另一方面，如果观察到活性区标注不完整（即焦点上的活性区未被识别），则降低 "Maxima noise tolerance" 值。继续尝试不同的值，直到十字能准确地标记焦点上的活性区为止。将此值填入 "Find maxima noise tolerance" 中。
         2. 参见 图 2C 中的示例。检测到过多的活性区。在 图 2C' 中，当增加 "Maxima noise tolerance" 值后，仅检测到焦点上的活性区。
   5. 使用之前所有步骤中定义的设置，对第 5.1 步中选择的代表性图像运行子宏 "Analyze"。
7. 调整 Brp- puncta 的下限和上限阈值
   1. 请注意，按照第 6.6 步运行宏后，将出现一个名为 2_active_zone_stack_image_name 的新文件。在此图像堆栈中，由 "Find maxima" 功能检测到的活性区在每个平面上以白点表示。
   2. 通过将该文件拖放到工具栏中打开，并选择 Image | Stack | Z-project | 投影类型 = Sum slices。将获得 2_active_zone_stack_image_name 的投影图像。
   3. 选择 Image | Adjust | Threshold。将打开一个名为 "Threshold" 的新窗口。滑动上限滑块，选择一个阈值，使得所有期望的焦点/Brp 阳性斑点均以红色显示。
      注意： 如果阈值设置过低，将计数过多的活性区；如果设置过高，则会遗漏部分活性区。
      1. 参见 图 2E 中的示例。当阈值设为 400 时，大多数活性区（表示为 1 像素焦点）未包含在分割中，因为它们未以红色突出显示（图 2E）。当阈值设为 50 时，所有活性区均以红色突出显示（图 2E'）。
   4. 将此值定义为下限阈值。"Upper puncta threshold" 保持为最大值。
   5. 使用本节所有先前步骤中定义的设置，重新运行子宏 "Analyze" 处理代表性图像。仔细评估生成的图像文件，确保分割正确完成。若未达到要求，请根据分割错误的性质重新调整设置（图 1，表 1）。

结果

图1：不恰当宏分割结果的示例。 运行“Drosophila NMJ Morphometrics”或“Drosophila NMJ Bouton Morphometrics”后的结果图像。部分突触末端未被包含在黄色轮廓线内（A）。背景部分被错误地包含在黄色轮廓线所定义的突触末端区域内（B）。蓝色骨架线延伸超出突触末端范围（C - D）。检测到的活性区数量过多（E - E'）。部分活性区未被分析检测到（G - G'）。在突触外区域检测到活性区（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<strong>免疫染色</strong>			稀释比例
小鼠抗Discs large 1抗体	发育研究杂交瘤库	AFFN-DLG1-4D6	1/25（使用Zenon Alexa Fluor 528标记试剂盒进行标记）
兔抗辣根过氧化物酶抗体	Jackson IR	323-005-021	1/500
兔抗突触素相关蛋白抗体	由Hugo Bellen惠赠		Jan-00
小鼠抗半胱氨酸串蛋白抗体	发育研究杂交瘤库	DCSP-1(ab49)	1/10（使用Zenon Alexa Fluor 528标记试剂盒进行标记）
小鼠抗Bruchpilot抗体	发育研究杂交瘤库	nc82	Jan-50
山羊抗小鼠Alexa Fluor 488抗体	Life technologies	A11029	1/200
山羊抗兔Alexa Fluor 568抗体	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 小鼠IgG1标记试剂盒	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher	P36930
<strong>仪器</strong>
共聚焦显微镜或荧光显微镜	Leica SP5
蔡司Axio imager显微镜
计算机	Mac或Pc
<strong>软件</strong>
FIJI