果蝇神经肌肉接头 （NMJ） 定量:一种评估突触形态和功能的方法

该协议摘自 Castells-Nobau 等人，果蝇 N欧洲肌肉连接形态高通量和多参数定量的两种算法，J. Vis. Exp. （2017）。

1. 图像处理前的要求

1. 如前所述，对第三龄游荡幼虫 （L3） 进行果蝇开书制备。
2. 使用两种标记物的组合对果蝇 NMJ 末端进行共免疫标记:Dlg-1 或 Hrp 与 Brp 一起用于"果蝇 NMJ 形态计量学"分析，以及 Syt 或 Csp 与 Brp 一起用于"果蝇 NMJ Bouton 形态计量学"分析><。 注意:来自同一物种的抗体可以通过使用抗体偶联试剂盒（如 Zenon Alexa 标记试剂盒）预标记一个抗体来组合。
3. 使用所选显微镜对 NMJ 终端进行成像，例如荧光（带或不带 ApoTome）或共聚焦显微镜。
   1. 获取 NMJ 终端的 2 通道图像堆栈。
      1. 调整显微镜设置，使通道 1 获得用 Dlg-1（或 Hrp、Syt、Csp）免疫标记的 NMJ 末端，通道 2 获得用 Brp 免疫标记的 NMJ 末端。
      2. 或者，使用宏分析单通道图像（用单个抗体免疫标记的突触）。用 Dlg-1 或 Hrp 唯一免疫标记的 NMJ 成像，用于"果蝇 NMJ 形态计量学"的分析，或用 Syt 或 Csp 进行"果蝇 NMJ Bouton 形态计量学"><的分析。 注意:无法分析仅用抗 Brp 免疫染色的突触。
   2. 将获取的图像导出为单独的 .tiff 文件。如果未按指示获取宏，请在运行宏之前反转通道顺序。

2. 软件要求和安装

1. 从以下网站下载宏:"果蝇 NMJ 形态计量学"和"果蝇 NMJ Bouton 形态计量学":https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1。
2. 将光标移动到文件夹 "Macros update 1" ，然后单击出现的选项 "view"。将出现一个包含此文件夹内容的列表。该文件夹包含宏 "Drosophila NMJ Morphometrics" 和 "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics><"。 注意:这两个宏都与 Fiji 1.4 版兼容，该版本也在同一文件夹中提供。宏可能无法在最新版本上运行。请使用提供的 1.4 版本。启动此版本没有问题，即使在具有较新斐济版本的计算机上也是如此。
3. 点击"全部下载"。文件夹内容将作为 .zip 文件下载到计算机。解压缩下载的文件。
4. 将 Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm 和 Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm 文件复制到 Fiji.app/plugins/ 目录。重新启动程序时，宏将出现在 Plugins 下拉菜单的底部。

3. 运行子宏 "Convert to Stack" 以创建 NMJ 图像的 Z 投影和超堆栈

1. 通过选择工具栏中的 Plugins 启动图形界面，然后在下拉菜单中选择 "Drosophila NMJ Morphometrics"。
2. 在宏的图形界面中定义"唯一文件字符串"设置。
   注意:显微镜软件在将堆栈存储为单独的 .tiff 文件时，使用识别签名来组织平面和通道。输入的唯一文件字符串设置需要指定软件分配给第一个通道的第一个平面的签名（重要提示:需要注明最低平面和通道号）。
3. 仅选择子宏"Convert to stack"，然后单击"ok"并选择图像所在的文件夹。如果选择了具有多个子文件夹的主目录，则将处理主目录和子文件夹中与唯一文件字符串条件匹配的所有单个 '.tiff 文件。
   1. 如果 z 堆栈仅包含一个通道，请选中"仅通道 1"框。
4. 请注意，每个 NMJ 图像将显示两个新文件，默认称为 stack_image_name 和 flatstack_image_name。仅存储这些 stack 和 flatstack 以供进一步分析。此时可以删除 .tiff 文件系列，从而最大限度地减少所需的存储容量并避免潜在的错误源。

4. 运行子宏 "Define ROI" 来描述感兴趣的 NMJ 终端

1. 启动"果蝇 NMJ 形态计量学"的图形界面。
2. 仅选中"定义 ROI"复选框，然后按"确定"，然后选择存储flatstack_name图像的主目录，然后按"选择"。子宏 "Define ROI" 自动搜索所选主目录中的所有子文件夹。
3. 当第一个投影打开时，选择工具栏中的"Freehand selections"（手绘选择）工具。
4. 使用鼠标绘制一个仅包含感兴趣的完整 NMJ 终端的选择，然后在 "Define terminal" 窗口中单击 "OK"。宏将继续进行下一个投影。
5. 描述下一个 ROI 并重复，直到定义所有 ROI。名为 "roi_image_name" 的 ROI 图像文件将存储在与之前为每个处理图像生成的堆栈和投影图像相同的目录中。此子宏的输出是黑色背景上白色的 ROI 的二进制图像。

5. 运行子宏 "analyze" 量化 NMJ 终端特征

1. 转到工具栏，选择"插件"并使用:
   当分析用抗 Dlg-1 或抗 Hrp（通道 1）和抗 Brp（通道 2）免疫标记的突触时，"果蝇_NMJ_Morphometrics"，或当分析用抗 Syt 或抗 Csp（通道 1）和 Brp（通道 2）免疫标记的突触时，"果蝇_NMJ_Bouton_Morphometrics"。
   1. 当要分析一个通道图像堆栈时（结构通道 Dlg-1 或 HRP 用于"Drosophila_NMJ_Morphometrics"，或 Syt 或 Csp 用于"果蝇_NMJ__Bouton_Morphometrics"），请选中"仅通道 1"框。
2. 调整与要分析的图像相对应的比例。
   1. 如果图像中的一个像素对应于 2.5 μm，则表示 Scale-Pixels = 1，以 μm 为单位的 Scale-Distance = 2.5。如果两个设置都保留为 0，则 NMJ 面积、周长、长度和最长分支长度将以像素数表示。
3. 如果需要，请调整宏的默认分析设置。仅当子宏 "Analyze" 之前运行的结果不令人满意时，才执行调整（有关如何优化设置的说明，请参阅本节末尾和第 6 节）。
4. 选中 "Analyze" 和 "Wait" 复选框，然后按 "OK"。
   1. 在 2 通道图像上运行子宏 "Analyze" 时，选中 "Wait" 复选框。否则，由于计算机容量有限，可能会发生活动区域计数错误。
5. 当打开新窗口 "Choose a Directory" 时，选择图像所在的目录，然后按 "select"。宏将分析存储在主目录和后续文件夹（如果适用）中的所有图像（使用执行前一个子宏的三个文件:stack_image_name、flatstack_image_name 和 roi_image_name）。宏单独和连续地处理每个图像。每个映像堆栈可能需要几分钟时间（具体取决于计算机容量）。
6. 运行宏后，请注意，将在父文件夹中为存储的每个分析突触创建一个名为 res_image_name 的新图像文件。定量测量值将存储为 "results.txt" 文件。
7. 检查所有结果图像以检测并排除具有分割错误的图片。表 1 描述了可能的分割错误，并提供了如何调整设置以避免这些错误的建议。具有这种分割误差的结果图像在 图 1.
   中作为示例提供 注意:当使用用户界面中观察到的默认设置运行宏时，将宏评估与手动评估进行比较时，准确率约为 95%。

6. 根据图像调整宏设置

1. 当超过 5% 的图像显示分割错误时，请探索不同的算法来定义/选择最适合图像的宏设置。
2. 调整滚动球半径值
   注意:滚动球半径函数减去图像的背景。当处理在荧光显微镜上采集的图像和/或图像具有高背景噪声时，此功能至关重要。减去背景将有助于宏的自动阈值步骤产生 NMJ 终端的适当分割。
   1. 选择子宏"Convert to stack"（转换为堆栈）生成的三个 NMJ stack_image_name图像。选择代表图像数据集的图像。
   2. 在工具栏中，选择 Image |颜色 |拆分通道。将创建两个图像堆栈，一个分别表示通道 1，另一个表示通道 2 并保存它们。
   3. 打开属于通道 1 open 的图像堆栈，对应于 Dlg-1、Hrp、Syt 或 Csp 免疫标记。
   4. 通过在工具栏中选择"Process"，然后在下拉菜单中选择"Subtract Background..."来运行过滤器"Subtract background"。
   5. 单击弹出窗口中的预览复选框，并将滚动球半径调整为最适合图像的值。应将"滚动球半径"设置调整为增加突触和背景之间对比度的值（参见图 2A'）。
      1. 有关示例，请参见 图 2。在图 A 中，突触的某些部分显示出与背景相同的灰度，而在 图 2 图 A' 中，500 的"滚动球半径"导致突触和背景之间形成强烈对比。
   6. 通过在工具栏中选择 Image |堆栈|Z 投影，选择 Projection type = Max Intensity 并保存生成的图像。当定义了滚动球半径的适当值后，对具有相同滚动球半径值的其余代表性图像运行"减去背景"算法。创建 Z 投影并保存它们（在任何目录中）。
      注意:8 位或 RGB 图像的滚动球半径值应至少与图像中不属于背景的最大对象的半径一样大。对于 16 位和 32 位图像，半径应与像素值范围成反比。
3. 确定将使用的不同自动阈值
   1. 打开上一步 （6.2.6） 中保存的 Z 投影，然后选择图像 |Adjust |自动阈值 |尝试所有功能。
   2. 由于二进制阈值结果图像将与所有不同的自动阈值算法一起显示，因此请确定最适合图像的算法。
      1. 稍后运行宏时，请相应地更改宏设置中的阈值。
      2. 使用更严格的阈值（如 "RenyiEntrop" 或 "Moments"） 作为 NMJ 轮廓阈值，使用更宽松的阈值（如 "Li" 来确定 NMJ 骨架，使用 "Huang" 来确定活动区）。当图像非常清晰且几乎没有背景时，请使用"Huang"作为"NMJ 轮廓阈值"。否则，图像分割后突触的某些部分可能会丢失。
      3. 有关示例，请参见 图 2B。突触的适当分割是通过绿色框突出显示的自动阈值获得的。一些不合适的阈值示例用红框突出显示（在高放大倍率下检查突触）。在后者中，突触的一部分缺失或背景的一部分被包括在内。
4. 确定小颗粒的最大尺寸
   注意:此功能将从分析中排除 NMJ 轮廓阈值和骨架阈值检测到的小于"小颗粒设置"中定义值的所有颗粒。此值以像素为单位定义。此功能用作噪声过滤器，当获得的图像中存在高速率的非均匀背景（例如晶体/灰尘）时非常有用。
   1. 打开在步骤 6.2.6. 中保存的 Z 投影，并通过 Analyze |设置 Scale。应用以下设置:距离（像素） = 1，已知距离 = 1，像素纵横比 = 1，长度单位 = 像素，然后按"确定"。单击工具栏中的 "Oval selection" 工具。
   2. 使用鼠标在免疫染色中存在但不属于 NMJ 的单个颗粒周围绘制一个选择。按 Ctrl+m 对于 Windows 用户，按 cmd+m 对于 Mac 用户。将打开一个结果窗口，指示所选粒子的区域（以像素数为单位）。
   3. 对图像中存在多个伪影重复上一步数次，以确定最大的污染颗粒/伪影区域。这将是稍后运行宏时要在设置中设置的值。运行宏时，将 "Small Particles Size" 设置为观察到的最小粒径 pus 25% 的边际。
   4. 有关示例，请参见 图 2D。检测到的最大晶体的面积为 112 像素。使用宏处理此图像时，"小颗粒大小"设置应设置为 125 - 150。
5. 确定最小胸针大小
   注意:此功能将从分析中排除 NMJ 轮廓阈值检测到的小于定义值的所有钮扣。此值以像素为单位定义。
   1. 按照第 6.4 节中描述的相同步骤进行作，但在这种情况下，围绕 NMJ 终端中存在的最小钮扣进行选择。选择对应于被测钮扣的最小钮扣的最小区域。这是稍后运行宏时要在 minimum bouton size 设置中设置的值。
6. 定义 "Maxima noise tolerance" 值
   1. 要定义宏的 "Find maxima noise tolerance" 值，请打开保存在第 6.2.2 节中的通道 2 Z 堆栈。
   2. 转到弹出菜单中的 plugins 选项卡，选择 Process |Maximum（3D），当maximum_image_name出现时（可能需要几分钟），关闭原始图像堆栈。
   3. 选择 Maximum..._image_name（新获取的图像堆栈），然后选择 插件 |流程 |Minimum （3D），当新图像出现 Minimum of Maximum..._image_name 时，将关闭 Maximum... _image_name堆栈。
   4. 在工具栏中，选择 Process |查找 maxima....将打开一个新窗口 "Find maxima..."（查找最大值...）。单击复选框 "Preview point selection..." 并使用默认宏设置 50 填充 "Noise tolerance" 框。最大点将在图像中表示为小十字。
      1. 如果观察到过多的带注释的活动区域，即不在所选堆栈平面上未聚焦的活动区域之上的交叉，或在后台检测到虚假的活动区域，请增加"噪声容差"值。
         1. 另一方面，如果观察到未完全注释的活动区域，即无法识别焦点中的活动区域，请减小"最大噪声容限"值。按照此过程继续尝试不同的值，直到十字正确标记焦点活动区域。用此值填充 "Find maxima noise tolerance" 。
         2. 有关示例，请参见 图 2C。检测到的活动区域过多。在 图 2C' 中，当增加"最大噪声容限"值时，仅检测到焦点上的活动区域。
   5. 对步骤 5.1 中选择的代表性图像运行子宏 "Analyze"，并使用前面所有步骤中定义的设置。
7. 调整 Brp-puncta 阈值下限和上限阈值
   1. 请注意，在根据步骤 6.6 运行宏后，将出现一个名为 2_active_zone_stack_image_name 的新文件。在此图像堆栈中，"查找最大值"功能检测到的活动区域由每个平面中的白点表示。
   2. 通过将该文件拖放到工具栏中来打开此文件，然后选择 Image |堆栈 |Z 项目 |投影类型 = Sum slices。将获得2_active_zone_stack_image_name的投影。
   3. 选择图像 |Adjust |门槛。将打开一个新窗口 "Threshold"。滑动上方栏以选择一个阈值，其中，所有所需的焦点/Brp 阳性点都以红色显示。
      注意:如果阈值设置得太低，则将计算超出的活动区域。如果设置得太高，则会错过一小部分活动区域。
      1. 有关示例，请参见 图 2E。当阈值设置为 400 时，大多数活动区域（符号化为 1 像素焦点）不包括在分割中，因为它们没有以红色突出显示（图 2E）。当阈值设置为 50 时，所有活动区域都以红色突出显示（图 2E'）。
   4. 将此值定义为最小阈值。将 "Upper puncta threshold" 保留为最大值。
   5. 使用本节前面所有步骤中定义的设置，对代表性图像重新运行子宏 "Analyze"。严格评估生成的图像文件，并确保正确进行分割。如果不是这种情况，请根据分割误差的性质重新调整设置（图 1，表 1）。

图 1:不适当的宏分割结果示例。运行"果蝇 NMJ 形态计量学"或"果蝇 NMJ Bouton 形态计量学"后的结果图像。突触末端的一部分不包括在黄色轮廓 （A） 中。部分背景由黄色轮廓 （B） 包含在突触末端。蓝色骨架线延伸到突触末梢 （C - D） 之外。检测到的活动区域过多 （E - E'）。某些活动区域仍未被分析检测到 （G - G'）。在突触外检测到活动区 （F）。不正确的钮扣分割（仅适用于运行果蝇 NMJ Bouton 形态计量学时）、错过钮扣 （H） 或分割 （I） 检测到过多的钮扣。作为背景一部分的颗粒（如晶体或尘埃）包含在分割 （J） 中。表 1 中提供了如何更改设置以避免这些错误的信息。请点击这里查看此图的较大版本。

图 2:宏设置调整示例及其对图像分割的影响。（A） 当"滚球半径"设置为 20 （A） 或 500 （A'） 时，减去 Dlg-1 免疫标记突触的背景预览，在 ApoTome 的荧光显微镜上成像。（B） 输出运行 Image |Adjust |自动阈值 |尝试所有图像说明:由 16 种不同的自动阈值算法获得的图像分割。（C） 在 50 （C） 和 500 （C'） 处设置"噪声容差"时，"查找最大值"预览;分段检测到的活动区域由一个小叉号标记。（D） 在共聚焦显微镜上成像，测量用抗 Hrp 免疫标记的突触图像背景中出现的"小颗粒"。（E） 从 2_active_zone_stack_ima-ge_name 获得的"Sum slices"投影。阈值设置为 400 （E） 和 50 （E'）。请点击这里查看此图的较大版本。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 分割 观察到的误差 例 必需的调整 NMJ 面积和周长
（在结果图像中由黄色轮廓表示） 突触末端的一部分要么不包括在内
在黄色轮廓或部分背景中
包含在以黄色轮廓勾勒的突触末端中。 图 2A-B 调整 'Rolling Ball Radius' 值。
参见 6.1 节。 调整 'NMJ 轮廓阈值'.
参见 6.2 节。 NMJ 长度相关参数
（由结果图像中的蓝色骨架线表示） 蓝色骨架线要么延伸到 beyond 之外，要么
不存在于整个突触末端。 图 2C-D 调整 'Rolling Ball Radius' 值。
参见 6.1 节。 调整 'NMJ 轮廓阈值'.
参见 6.2 节。 Brp 阳性点
（由结果图像中的点表示） 检测到的活动区域过多。 图 2E-E' 减小"查找最大噪声容限"值。
参见 6.5 节。 Brp 阳性点
（由结果图像中的点表示） 分析会遗漏活动区域。 图 2G-G' 增加"查找最大噪声容限"值。
参见 6.5 节。 降低 'Brp-puncta 下限阈值'.
参见 6.6 节。 Brp 阳性点
（由结果图像中的点表示） 检测到活动区域伪影
突触末梢外。 图 2F 调整"活动区阈值"第 6.2 节。 提高 'Brp-puncta 下限阈值'.
参见 6.6 节。 小颗粒 颗粒，如晶体或灰尘，属于
的背景似乎包含在
分割。 图 2J 选中"移除小颗粒"框。
参见 6.3 节。 确定小颗粒的最大粒径。
参见 6.3 节。 布顿分割 钮扣分割错误
（仅适用于果蝇 NMJ Bouton 形态学;
不要使用果蝇 NMJ 形态计量学进行钮扣分割）。 图 2H-I 调整 'NMJ 轮廓阈值'.
参见 6.1 节。 确定"最小钮扣大小".
参见 6.4 节。

表 1:宏可能产生的图像分割中不同类型错误的故障排除指南。下表描述了宏生成的不同类型的图像分割错误。这些可以很容易地在结果图像中检测到。图 1 显示了每种错误类型的示例。在表格的 "adjustments section" 中，突出显示了需要调整的设置，用户被引用了第 6 节的关键子步骤，该子步骤描述了如何调整这些设置。