Drosophila 神经肌肉接头（NMJ）定量分析：一种评估突触形态与功能的方法

摘要

来源：Castells-Nobau, A. 等 两种用于高通量、多参数定量分析的算法 黑腹果蝇 神经肌肉接头形态学. J. Vis. Exp. (2017).

果蝇神经肌肉接头（NMJ）被用作研究突触形态与功能的模型。本视频介绍了研究人员用于表征 NMJ 的若干重要特征。示例方案展示了一种能够自动完成这些定量分析的软件。

方案

本方案节选自 Castells-Nobau 等两种用于高通量、多参数定量分析的算法 果蝇 N神经肌肉接头形态学， 视频实验杂志. (2017).

1. 图像处理前的准备工作

1. 执行 果蝇 如前所述，制备三龄游走幼虫（L3）的敞口书状样本。
2. 共免疫标记 果蝇 使用两种标记物组合对NMJ终末进行分析：Dlg-1或Hrp与Brp联合使用 "果蝇 神经肌肉接头形态计量学"，以及Syt或Csp与Brp共同用于分析 "果蝇 神经肌肉接头终末支形态测量".
   注意： 同一物种的抗体可通过抗体偶联试剂盒（如 Zenon Alexa 标记试剂盒）对其中一种抗体预先标记来实现联合使用。
3. 使用选定的显微镜对神经肌肉接头终末进行成像， 例如， 荧光显微镜（可选ApoTome）或共聚焦显微镜
   1. 获取NMJ终末的双通道图像序列。
      1. 调整显微镜设置，使通道1采集用Dlg-1（或Hrp、Syt、Csp）免疫标记的NMJ终末，通道2采集用Brp免疫标记的NMJ终末。
      2. 可选地，使用宏分析单通道图像（仅用一种抗体免疫标记突触的图像）。图像....

结果

图1：不恰当宏分割结果的示例。 运行“Drosophila NMJ Morphometrics”或“Drosophila NMJ Bouton Morphometrics”后的结果图像。部分突触末端未被包含在黄色轮廓线内（A）。背景部分被错误地包含在黄色轮廓线所定义的突触末端区域内（B）。蓝色骨架线延伸超出突触末端范围（C - D）。检测到的活性区数量过多（E - E'）。部分活性区未被分析检测到（G - G'）。在突触外区域检测到活性区（.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<strong>免疫染色</strong>			稀释比例
小鼠抗Discs large 1抗体	发育研究杂交瘤库	AFFN-DLG1-4D6	1/25（使用Zenon Alexa Fluor 528标记试剂盒进行标记）
兔抗辣根过氧化物酶抗体	Jackson IR	323-005-021	1/500
兔抗突触素相关蛋白抗体	由Hugo Bellen惠赠		Jan-00
小鼠抗半胱氨酸串蛋白抗体	发育研究杂交瘤库	DCSP-1(ab49)	1/10（使用Zenon Alexa Fluor 528标记试剂盒进行标记）
小鼠抗Bruchpilot抗体	发育研究杂交瘤库	nc82	Jan-50
山羊抗小鼠Alexa Fluor 488抗体	Life technologies	A11029	1/200
山羊抗兔Alexa Fluor 568抗体	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 小鼠IgG1标记试剂盒	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher	P36930
<strong>仪器</strong>
共聚焦显微镜或荧光显微镜	Leica SP5
蔡司Axio imager显微镜
计算机	Mac或Pc
<strong>软件</strong>
FIJI