双光子激光诱导神经损伤：一种在Drosophila幼虫中观察轴突变性与再生的方法

摘要

来源：Li, D. 等。一种用于研究周围和中枢神经系统神经再生的 Drosophila 体内 损伤模型。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫中进行轴突双光子激光消融的技术，以及诱导损伤并成像损伤部位的示例实验方案。

方案

本方案节选自 Li et al. 的研究《用于研究周围和中枢神经系统神经再生的 Drosophila 体内 损伤模型》，发表于《视觉化实验杂志》（J. Vis. Exp.，2018年）。

1. 双光子损伤与共聚焦成像

1. 显微镜设置
   注意：本实验使用配备双光子激光器的共聚焦激光扫描显微镜，但其他具有类似配置的系统也可满足要求。双光子激光（930 nm）用于造成损伤，氩离子激光（488 nm）用于GFP的共聚焦成像。
   1. 每次实验开始时，打开双光子激光器和/或共聚焦激光器以及显微镜，启动成像软件。
   2. 对于双光子损伤，设置以下参数，使用930 nm（1,950 mW）双光子激光对GFP进行成像：
      1. 选择线扫描模式，将针孔完全打开，将激光强度提高至约20%（390 mW）。
      2. 选择512 × 512作为帧扫描尺寸，使用最大扫描速度（通常像素驻留时间为0.77 µs），确保平均次数为1，位深度为8位。
      3. 将增益设为约750，偏移设为0。
      4. 将此预设实验方案保存为2P GFP 930 Ablation，以便在后续实验中重复使用。
   3. 对于共聚焦成像，设置以下参数，使用488 nm氩离子激光对GFP进行成像：
      1. 选择采集选项卡，然后选择Z堆栈。
      2. 在"激光器"下，开启488 nm氩离子激光器的电源。
      3. 进入通道，选择488 nm激光器，将激光功率提高至5–10%。针孔设置为1–2艾里单位（AU），增益调整为650。
      4. 在采集模式中，选择1024 × 1024作为帧扫描尺寸，使用最大扫描速度，平均次数为2，位深度为8位。
      5. 将此预设实验方案保存为GFP Imaging。
2. 幼虫乙醚麻醉与固定
   1. 在通风橱内，将一个60 mm玻璃培养皿放入15 cm塑料培养皿中。在玻璃培养皿底部折叠并放置一张滤纸，然后将葡萄汁琼脂平板置于滤纸上。向玻璃培养皿中加入乙醚，直至滤纸完全浸透且皿底残留一层液态乙醚。操作过程中始终盖上盖子。
   2. 准备一张载玻片，在中央滴加一滴卤碳油27，然后在载玻片四角各加四点真空脂，用于后续支撑盖玻片。
   3. 使用镊子夹取一只清洁的幼虫，将其放置在60 mm玻璃培养皿中的琼脂平板上。盖上玻璃培养皿盖子，等待幼虫停止活动。对于外周神经系统（PNS）损伤/成像，当幼虫尾部停止抽动时立即取出；对于中枢神经系统（CNS），需等待整个幼虫完全静止，尤其是头部节段。
      注意：乙醚暴露时间至关重要，详见讨论部分。
   4. 小心夹起麻醉后的幼虫，将其头部朝上放入载玻片的卤碳油滴中。在载玻片上加盖盖玻片，轻轻按压盖玻片，直至其接触幼虫（图1A）。
   5. 通过轻推盖玻片向左或向右滚动幼虫，调整其位置，使目标神经元/轴突/树突位于上方并最接近显微镜物镜。
   6. 对于PNS损伤，将幼虫背侧朝上固定，使两侧气管可见。然后将幼虫向左旋转约30度以损伤III类da神经元轴突（图1B和1C），旋转90度以损伤IV类da神经元轴突（图1B和1E），或旋转约30度以损伤IV类da神经元树突（图2A）。
   7. 对于CNS损伤，将幼虫完全腹侧朝上放置（图3A），使目标区域在z轴平面上最接近显微镜物镜。
3. 双光子激光损伤
   1. 将载有幼虫的载玻片置于显微镜下，用载物台上的夹片器固定。使用10X（0.3 NA）物镜找到幼虫。
   2. 在盖玻片上滴加一滴物镜油，切换至40X（1.3 NA）物镜并调整焦距。
   3. 切换至扫描模式，重新使用实验方案2P GFP 930 Ablation，确保针孔完全打开。
      注意：具体配置需根据各系统进行优化。
   4. 启动实时模式以定位目标区域（ROI），并微调设置，在适当放大倍数下获得良好的图像质量。
      注意：此步骤的目的是定位待损伤的神经元/轴突/树突，而非获取最佳质量图像。因此，应使用足以观察目标区域的最低设置，以避免过度曝光或光漂白。
   5. 停止实时扫描，使裁剪按钮可用。以静止图像作为参考图，选择裁剪功能，调整扫描窗口以聚焦于待损伤目标。
   6. 将ROI缩小至预期损伤部位的大小。例如，仅覆盖轴突或树突的宽度，以确保损伤的精确性并减少对邻近组织的损伤。如有需要，可在裁剪前对ROI进行放大，以实现更精确的损伤。
   7. 打开一个新的成像窗口，降低扫描速度并提高激光强度。激光强度的提升幅度应根据实时模式下扫描的组织荧光信号来确定。
   8. 通常，PNS损伤时双光子激光强度从25%开始，VNC损伤时为50–100%。对于PNS轴突损伤，确保激光强度约为480 mW，像素驻留时间为8.19 μs；对于VNC轴突损伤，激光强度和像素驻留时间通常分别为965–1930 mW和8.19–32.77 μs。
   9. 启动连续扫描，将光标悬停在连续按钮上。密切观察图像，一旦观察到荧光显著增强，立即停止扫描。
      注意：荧光信号的突然升高是由于损伤部位的自发荧光所致。
   10. 通过重新应用设置切换回实时模式，通过调整焦距找到刚刚靶向的区域。
       注意：成功损伤的良好标志是在损伤部位出现微小的凹坑、环状结构或局部碎片。
   11. 移动至下一个神经元，从步骤1.3.5开始重复操作，以在同一动物体内损伤多个神经元。若初始损伤不足，可重复步骤1.3.5，逐步提高激光功率和/或降低扫描速度。
       注意：若激光功率过高，损伤后的实时扫描图像中将可见较大范围的损伤区域，过度损伤可能导致幼虫死亡。
   12. 小心移除盖玻片，将受伤幼虫转移至含有酵母糊的新培养皿中进行恢复。使用镊子在琼脂平板上挖出若干小洞；或者在培养皿中制作一个琼脂岛而非使用整块琼脂，以减少幼虫爬出培养皿的可能性。
   13. 将培养皿放入60 mm培养皿中，并在其中放置湿润的滤纸（用0.5%丙酸溶液浸泡），在室温或25 °C条件下培养。
       注意：与25 °C相比，幼虫在室温（22 °C）下将额外多保持约一天的幼虫阶段。
4. 损伤后共聚焦成像
   1. 在所需时间点对受伤幼虫进行成像，使用与步骤1.2相同的麻醉和固定程序准备幼虫，然后使用共聚焦激光进行成像。
      注意：在损伤后24小时（AI）成像以确认轴突损伤，并在损伤后48小时AI（IV类da神经元）或72小时AI（III类da神经元）成像以评估再生情况。
   2. 使用10X物镜定位幼虫，然后切换至25X（0.8 NA）物镜，重新使用实验方案GFP Imaging。
   3. 点击实时按钮，找到先前损伤的同一神经元。
   4. 在实时扫描窗口中设置第一和最后一个Z平面位置，点击停止并点击开始实验以获取Z堆栈图像。
      注意：确保在采集图像时包含一个归一化点（轴突汇聚点），以便进行再生的定量分析（图1D, 1F）——此内容将在数据分析部分进一步讨论。
   5. 切换至图像处理，选择刚刚获取的图像，生成最大强度投影。同时保存Z堆栈图像和最大强度投影图像。

结果

图1：外周中da神经元轴突再生表现出类别特异性。（A和B）显示幼虫位置的示意图。（C）III类da神经元的示意图。（D）III类da神经元ddaF的轴突，使用19-12-Gal4、UAS-CD4-tdGFP、repo-Gal80/+标记，未能再生。（E）IV类da神经元的示意图。（F）IV类da神经元v'ada的轴突，使用ppk-CD4-tdGFP/+标记，能够越过损伤部位再生。（D和F）红线表示轴突长度，绿色虚线标记细胞体与轴突汇聚点（DCAC）之间的距离。蓝色圆点标记轴突汇聚点。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙醚，ACS级试剂，无水	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 油	Genesee Scientific	59-133
丙酸	J.T.Baker	U33007
盖玻片：矩形	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm × 22 mm
Zeiss LSM 880 激光扫描显微镜	Zeiss
Zen 软件	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent