双光子激光诱导神经损伤：一种在Drosophila幼虫中观察轴突变性与再生的方法

摘要

来源：Li, D. 等。一种用于研究周围和中枢神经系统神经再生的 Drosophila 体内 损伤模型。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫中进行轴突双光子激光消融的技术，以及诱导损伤并成像损伤部位的示例实验方案。

方案

本方案节选自 Li et al. 的研究《用于研究周围和中枢神经系统神经再生的 Drosophila 体内 损伤模型》，发表于《视觉化实验杂志》（J. Vis. Exp.，2018年）。

1. 双光子损伤与共聚焦成像

1. 显微镜设置
   注意：本实验使用配备双光子激光器的共聚焦激光扫描显微镜，但其他具有类似配置的系统也可满足要求。双光子激光（930 nm）用于造成损伤，氩离子激光（488 nm）用于GFP的共聚焦成像。
   1. 每次实验开始时，打开双光子激光器和/或共聚焦激光器以及显微镜，启动成像软件。
   2. 对于双光子损伤，设置以下参数，使用930 nm（1,950 mW）双光子激光对GFP进行成像：
      1. 选择线扫描模式，将针孔完全打开，将激光强度提高至约20%（390 mW）。
      2. 选择512 × 512作为帧扫描尺寸，使用最大扫描速度（通常像素驻留时间为0.77 µs），确保平均次数为1，位深度为8位。
      3. 将增益设为约750，偏移设为0。
      4. 将此预设实验方案保存为2P GFP 930 Ablation，以便在后续实验中重复使用。
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结果

图1：外周中da神经元轴突再生表现出类别特异性。（A和B）显示幼虫位置的示意图。（C）III类da神经元的示意图。（D）III类da神经元ddaF的轴突，使用19-12-Gal4、UAS-CD4-tdGFP、repo-Gal80/+标记，未能再生。（E）IV类da神经元的示意图。（F）IV类da神经元v'ada的轴突，使用ppk-CD4-tdGFP/+标记，能够越过损伤部位再生。（D和F）红线表示轴突长度，绿色虚线标记细胞体与轴突汇聚点（DCAC）之间的距离。蓝色圆点标记轴突汇聚点。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙醚，ACS级试剂，无水	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 油	Genesee Scientific	59-133
丙酸	J.T.Baker	U33007
盖玻片：矩形	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm × 22 mm
Zeiss LSM 880 激光扫描显微镜	Zeiss
Zen 软件	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent