Drosophila 护理细胞的显微注射：一种细胞内递送方法

摘要

来源：Catrina, I. E. 等 在活细胞中可视化与追踪内源性 mRNA 黑腹果蝇 卵室. 视频实验杂志 (2019).

由于体积较大且结构相对简单，果蝇（Drosophila）的护卵细胞非常适合用于活细胞成像研究。本视频介绍了一种将外源性化合物通过显微注射导入细胞的方法，其中展示的实验方案以荧光寡核苷酸探针——即分子信标（molecular beacons, MBs）为例，用于可视化内源性mRNA转录本。

方案

本实验方案节选自 Catrina et al., 在活体 Drosophila melanogaster 卵室中可视化与追踪内源性 mRNA, J. Vis. Exp. (2019)。

1. 用于活细胞成像的分子信标设计

1. 使用以下方法折叠目标 RNA 序列，以预测 mRNA 目标序列的二级结构 "RNA 形式" 来自 mfold 服务器http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
   1. 以 FASTA 格式粘贴或上传目标序列，选择 5% 或 10% 的次优结构（分别表示折叠自由能位于最小自由能 MFE 值的 5% 或 10% 范围内的结构），并相应调整计算折叠结构的最大数量（例如，10% 次优时设为较大值）。
      注意： 在设计分子信标（MBs）时纳入次优的二级结构，可识别出靶标mRNA中比仅基于最小自由能（MFE）结构预测结果更灵活或更刚性的区域....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
荧光分光光度计	Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon	n/a	光子计数型荧光分光光度计
石英比色皿	Fireflysci（原 Precision Cells Inc.）	701MFL
Dumont #5 镊子	World Precision Instruments	501985	细长镊子对于分离单个卵室至关重要
卤碳油 700	Sigma-Aldrich	H8898
盖玻片 No.1 22 mm × 40 mm	VWR	48393-048
体视显微镜	Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.	n/a
CO2 果蝇麻醉垫	Genesee Scientific	59-114
Tris-HCl pH 7.5	Sigma-Aldrich	1185-53-1
氯化镁	Sigma-Aldrich	7791-18-6
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
转盘共聚焦显微镜	配备 Yokogawa CSU 10 转盘的 Leica DMI-4000B 倒置显微镜 Leica Microsystems Inc.	n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD 相机	Hamamatsu	n/a
PatchMan NP 2 显微操作器	Eppendorf Inc.	920000037
FemtoJet 微注射仪	Eppendorf Inc.	920010504
注射针：Femtotips II	Eppendorf Inc.	930000043
上样吸头：20 μL Microloader	Eppendorf Inc.	930001007
显微盖玻片 No. 1 或 1.5，22 mm × 40 mm	VWR	48393-026; 48393-172
干酵母	任意杂货店	n/a
计算机，> 20 GB RAM			尽管大多数计算机均可进行数据处理，但更高配置的设备可显著提升处理速度