Drosophila 护理细胞的显微注射：一种细胞内递送方法

摘要

来源：Catrina, I. E. 等 在活细胞中可视化与追踪内源性 mRNA 黑腹果蝇 卵室. 视频实验杂志 (2019).

由于体积较大且结构相对简单，果蝇（Drosophila）的护卵细胞非常适合用于活细胞成像研究。本视频介绍了一种将外源性化合物通过显微注射导入细胞的方法，其中展示的实验方案以荧光寡核苷酸探针——即分子信标（molecular beacons, MBs）为例，用于可视化内源性mRNA转录本。

方案

本实验方案节选自 Catrina et al., 在活体 Drosophila melanogaster 卵室中可视化与追踪内源性 mRNA, J. Vis. Exp. (2019)。

1. 用于活细胞成像的分子信标设计

1. 使用以下方法折叠目标 RNA 序列，以预测 mRNA 目标序列的二级结构 "RNA 形式" 来自 mfold 服务器http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
   1. 以 FASTA 格式粘贴或上传目标序列，选择 5% 或 10% 的次优结构（分别表示折叠自由能位于最小自由能 MFE 值的 5% 或 10% 范围内的结构），并相应调整计算折叠结构的最大数量（例如，10% 次优时设为较大值）。
      注意： 在设计分子信标（MBs）时纳入次优的二级结构，可识别出靶标mRNA中比仅基于最小自由能（MFE）结构预测结果更灵活或更刚性的区域，从而优化适用于活细胞成像的MBs整体设计。
   2. 选择一个 "立即就业" 对于长度为800个核苷酸（nt）的mRNA靶标，或 "批量作业" 对于长度在801至8,000 nt之间的mRNA。保存 "ss-count" 以纯文本文件格式保存。
2. 使用 "ss-count" 步骤1.1中获得的文件作为输入 PinMol 程序（https://bratulab.wordpress.com/software/）并设置所需参数，以设计针对该mRNA靶标的多个MBs（参见描述使用的教程 PinMol 项目在 https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
   1. 通过进行BLAST分析确定所选分子信标（MBs）的特异性：使用 "blastn" 使用适当的数据库（例如，用于 oskar mRNA特异性的MBs使用 "refseq-rna" 数据库和 黑腹果蝇 生物体
   2. 确定mRNA靶标的任何组织特异性表达（例如，用于 oskar mRNA Flybase> 高通量表达数据> FlyAtlas解剖微阵列或modENCODE解剖RNA测序； http://flybase.org/reports/FBgn0003015）并与任何阳性BLAST结果进行比较，排除显示 >与其他在目标组织/细胞中表达的mRNA具有50%的序列同源性。
3. 选择适合现有显微镜设备的荧光团和淬灭剂组合，用于活细胞成像（例如 Cy5/BHQ2）。

2. 亚甲蓝的合成、纯化与表征

1. 使用实验室内部合成与纯化方法，如先前所述 布拉图，分子生物学方法（2006），或由商业供应商提供的服务，合成并纯化一至五个MB（见上述注释），标记方案如下：[5'(荧光团)-(C3或C6连接臂)-(2'-O-甲基MB序列)-(淬灭剂)3']。使用反相高效液相色谱法（HPLC）纯化分子信标（MBs），可自行完成或委托商业供应商进行。
   注意： 用于自动探针合成的磷酸亚胺必须具有2'-O-甲基核糖核苷酸修饰。也可使用交替的锁核酸（LNA）和2'-O-甲基化修饰以增强较短分子信标（MB）与其靶标mRNA之间杂交体的稳定性。
2. 合成与靶向RNA区域序列匹配的DNA寡核苷酸，使其与分子信标（MBs）的探针区域互补，用于 体外 表征（见步骤 2.3 至 2.5；上述注释）。通过在 DNA 目标序列的两端各添加四个位于目标 mRNA 序列中的额外核苷酸，以最大化分子信标（MB）与 DNA 寡核苷酸目标模拟物的杂交。
   注意： 使用体外合成的RNA靶标替代互补DNA寡核苷酸，可对分子信标（MB）检测靶序列的效率进行更严格的表征。
3. 单独对分子信标（MB）进行热变性，测定其熔解温度（Tm），并确认MB在生理温度下呈现预期的发夹结构。我们观察到的Tm值介于60至90 °C之间。
4. 在DNA寡核苷酸靶标存在下对分子信标（MB）进行热变性，并如前所述测定MB与DNA靶标杂交体的熔解温度（Tm） 布拉图，分子生物学方法（2006）MB:DNA 杂交体的 Tm 值应介于 55 至 60 °C 之间。
5. 在体外进行与相应DNA寡核苷酸靶标的杂交反应，并按照此前所述方法，测定分子信标（MB）与DNA杂交形成的效率，于生理温度下进行。 布拉图，分子生物学方法（2006）理想的DNA靶标类似物应具有快速的杂交动力学，然而，某些分子信标（MBs）虽然与DNA靶标的杂交效率较低，但在体外和/或体内与靶标mRNA的杂交性能可能更优。

3. 卵室的解剖与显微注射前的制备

1. 将新孵化且已交配的雌蝇用新鲜的酵母糊喂养2-3天。
2. 在CO₂麻醉垫上麻醉果蝇，使用精细镊子（Dumont #5）将1-2只雌蝇转移至盖玻片上的一滴700号卤代烷油中。
3. 使用一对镊子，在体视显微镜下将果蝇背侧朝上摆放。于腹部后端做一小切口，轻轻挤压使一对卵巢排入油滴中。
4. 将卵巢移至新盖玻片上的油滴中。用一把镊子轻轻夹住一个卵巢，同时用另一把镊子夹除卵管中最年轻的发育阶段。oskar mRNA在卵子发生中期（发育阶段>7）及之后被主动定位于特定区域，而较年轻的卵室（发育阶段<7）更难注射，且存活时间较短。缓慢向下拖动盖玻片，使单个卵管或卵室分离并垂直排列。通过移除卵管链中不需要的发育阶段，进一步分离单个卵室。
   注意：确保分离后的单个卵室不会在油中漂浮，并牢固附着于盖玻片表面。这对显微注射的成功以及后续成像至关重要。

4. 将微滴注射至卵室的护卵细胞中

1. 配制分子信标（MB）溶液，使用一种分子信标（例如 osk2216Cy5），或两种靶向不同mRNA且标记有光谱可区分荧光染料的MB混合物（例如 osk2216Cy5 和 drongo1111Cy3）。每种MB在杂交缓冲液（HybBuffer，含50 mM Tris-HCl - pH 7.5，1.5 mM MgCl₂）中的浓度为200–300 ng/µL。₂ 以及100 mM NaCl）。在HybBuffer中，若四种标记相同荧光染料的分子信标（MBs）靶向同一mRNA，每种浓度为200 ng/µL（例如osk82、osk1236、osk2216），则在显微注射加样前应立即离心MB溶液。
2. 选择物镜。建议使用40倍油镜来寻找合适的卵室并进行显微注射。
3. 将带有解剖后卵室的盖玻片固定于显微镜载物台上。调整物镜至对焦位置，找到一个处于中期至晚期发育阶段且方向适合显微注射的卵室（即其前后轴（AàP轴）与注射针尖垂直，便于将物质注入靠近卵母细胞的近端滋养细胞内）。
4. 将约 1 µL 的 MB 溶液（见步骤 1.1）吸入针头（商用或自制）中，并连接至显微注射仪。用于显微注射时 D. melanogaster 卵室，调整针头方向（参见 材料表以一定角度 <45° 调整为显微镜载物台角度（例如 30°），以避免刺穿多个滋养细胞。
5. 设置注射器的注射压力为500–1,000 hPa，补偿压力为100–250 hPa（参见 材料表).
6. 缓慢移动载物台，使视野中出现一个不含卵室的油滴区域。
7. 使用显微操作仪操纵杆，轻轻将针头插入油滴中，并将针尖移至视野边缘对焦。
8. 执行“清洁”功能，以排出针尖的空气，并确保针头有液体流出。
9. 将针头移至初始位置，聚焦于待显微注射的卵室，然后重新聚焦针头并将其置于卵室边缘附近。
10. 精细调节物镜的Z轴位置，使分隔卵泡细胞与滋养细胞的膜结构处于焦点清晰状态。
11. 将针头插入滋养细胞并注射2-5秒。
12. 轻轻取出针头，并将其缩回至初始位置。
13. 将物镜切换至所需放大倍数（60-63倍或100倍），聚焦于卵室，开始图像采集。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
荧光分光光度计	Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon	n/a	光子计数型荧光分光光度计
石英比色皿	Fireflysci（原 Precision Cells Inc.）	701MFL
Dumont #5 镊子	World Precision Instruments	501985	细长镊子对于分离单个卵室至关重要
卤碳油 700	Sigma-Aldrich	H8898
盖玻片 No.1 22 mm × 40 mm	VWR	48393-048
体视显微镜	Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.	n/a
CO2 果蝇麻醉垫	Genesee Scientific	59-114
Tris-HCl pH 7.5	Sigma-Aldrich	1185-53-1
氯化镁	Sigma-Aldrich	7791-18-6
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
转盘共聚焦显微镜	配备 Yokogawa CSU 10 转盘的 Leica DMI-4000B 倒置显微镜 Leica Microsystems Inc.	n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD 相机	Hamamatsu	n/a
PatchMan NP 2 显微操作器	Eppendorf Inc.	920000037
FemtoJet 微注射仪	Eppendorf Inc.	920010504
注射针：Femtotips II	Eppendorf Inc.	930000043
上样吸头：20 μL Microloader	Eppendorf Inc.	930001007
显微盖玻片 No. 1 或 1.5，22 mm × 40 mm	VWR	48393-026; 48393-172
干酵母	任意杂货店	n/a
计算机，> 20 GB RAM			尽管大多数计算机均可进行数据处理，但更高配置的设备可显著提升处理速度