筛选基因组修饰：一种在Drosophila中鉴定CRISPR诱导突变体的方法

摘要

来源：Du, L. 等 一种高效构建组织特异性双元转录系统的方法 黑腹果蝇 通过基因组编辑. 视频实验杂志 (2018).

本视频介绍了一种用于鉴定基因组经CRISPR-Cas9技术修饰的转基因果蝇（Drosophila）的筛选方法。CRISPR-Cas9是一种强大的基因组编辑工具，彻底改变了科学家操控生物体基因组的方式。在本示例方案中，我们将学习如何鉴定通过CRISPR技术产生的突变体，其中一段转录激活序列的插入取代了branchless（bnl）基因的第一个外显子，从而构建出针对bnl基因的特异性驱动品系bnl-LexA。

方案

本实验方案节选自 Du et al.，《利用基因组编辑技术在Drosophila中高效构建组织特异性双元转录系统》，《J. Vis. Exp.》（2018年）。

1. 果蝇遗传学与筛选（图1和图2）

1. 当注射的胚胎发育为成体后，将每条单个的G₀ 将果蝇与平衡染色体果蝇杂交。为含有目标等位基因的染色体选择合适的平衡染色体。
2. 对每对G0代杂交所得的F1代子代，用CO₂进行麻醉₂ 垫板并在体视显微镜下随机选取10-20只雄蝇。将每只雄蝇分别与平衡染色体雌蝇杂交，如图所示 图2.
3. 当F2幼虫孵化后，从每个杂交组合中挑选出单个F1父本，并按照单只果蝇基因组DNA提取方案提取gDNA：
   1. 制备基因组DNA提取缓冲液：10 mM Tris-Cl pH 8.2，1 mM EDTA，25 mM NaCl，室温保存。配制20 mg/mL蛋白酶K储存液，置于冷冻保存。
   2. 将每只果蝇放入一个1.5 mL微量离心管中，并标记管子。在-80 °C冰箱中保存过夜。
   3. 配制含有终浓度为 200 µg/mL 蛋白酶 K 的基因组 DNA 提取缓冲液新鲜工作液。
      注意：此步骤请勿使用陈旧的缓冲液。
   4. 用含有50 μL裂解缓冲液的移液器吸头按压每只果蝇10–15秒，期间不排出液体。将剩余缓冲液排入离心管中并充分混匀。37 °C孵育20–30分钟。
   5. 将离心管置于95 °C加热块中加热1–2分钟，以灭活蛋白酶K。
   6. 以 10,000 x g 离心 5 分钟 g将制备样品于4 °C保存，以备后续PCR分析。
4. 使用相同的方法从 a 中提取基因组 DNA nos-Cas9 果蝇，作为阴性对照。采用三步法PCR筛选以鉴定正确的 "末端" HDR（图1, 图3使用每只F1代雄性个体的基因组DNA（gDNA）作为模板⁵使用1 μL DNA样品进行以下PCR反应体系：10 μL含染料的2x PCR预混液，1 μL正向引物（10 μM），1 μL反向引物（10 μM），1 μL DNA模板，以及7 μL ddH₂O。₂O.
5. 如图所示 图3A，使用引物fwd1和rev1进行PCR以检测插入或替换的存在；使用引物fwd2和rev2进行PCR以从3'区域验证插入或替换；使用引物M13F和rev3进行PCR以检测 "末端在" HDR（高动态范围）表 1C).
6. 将确认发生末端外切同源定向修复（ends-out HDR）的果蝇品系与平衡染色体果蝇杂交，从F2代建立平衡品系。再次与平衡染色体果蝇回交，以去除其他染色体上可能存在的非预期突变。

结果

图 1：利用 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑构建双元转录系统的工作流程概览。 图中标注了每一步骤所需的大致时间。 请点击此处查看该图的放大版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	分子生物学
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	分子生物学
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	分子生物学
UltraPure 无 DNase/RNase 水	ThermoFisher Scientific	10977-023	分子生物学
引物	IDT-DNA		PCR
蛋白酶K	ThermoFisher Scientific	25530049	分子生物学
含染料（红色）的2x PCR预混液	Sydlab	MB067-EQ2R	分子生物学
MKRS/TB6B	Kornberg lab		果蝇品系
CO2工作站	Genesee Scientific	59-122WCU	果蝇操作
体视显微镜	Olympus	SZ-61	果蝇操作
微型离心管匀浆杵	Fisher-Scientific	03-421-217	基因组DNA提取