基因组修饰筛选：在果蝇中识别CRISPR生成突变体的方法

Abstract

资料来源：杜，洛杉矶等人 ，通过基因组编辑在 果蝇 中生成组织特异性二元转录系统的有效策略。 J. 维斯 (2018).

这段视频描述了一种识别转基因果蝇的筛选方法，其基因组使用CRISPR-Cas9进行了修改。CRISPR-Cas9是一种强大的基因组编辑工具，它彻底改变了科学家操纵生物体基因组的方式。在示例协议中，我们将看到如何识别 CRISPR 生成的突变体，其中插入交易激活序列取代了无分支（bnl）基因的第一个外出，从而创建一个bnl基因特定驱动系bnl-LexA。

Protocol

本协议摘自 Du等人，一个有效的策略，通过基因组编辑，J. Vis. Exp. （2018） 在果蝇中生成组织特定的二元转录系统。

1. 飞行遗传学和筛选（图1和图2）

1. 当注射的胚胎发育成成人时，将每只G₀ 苍蝇交叉到平衡器苍蝇。为包含目标等位基因的染色体选择合适的平衡器。
2. 麻醉F1后代从每个G0交叉在CO₂ 垫上，并随机挑选10-20雄性在立体显微镜下。如 图2所示，将它们单独交叉到平衡器女性。
3. 当F2幼虫孵化时，从每个十字架上挑选单一的F1父亲，并使用单飞基因组DNA制备方案提取gDNA：
   1. 准备 gDNA 提取缓冲区：10 mM 特里斯-Cl pH 8.2、1 mM EDTA、25m NaCl，在室温下存储。准备20毫克/mL蛋白酶K库存溶液，并储存在冰箱里。
   2. 将每只苍蝇放入 1.5 mL 微型离心管中，并给管子贴上标签。保持在-80°C冰柜过夜。
   3. 准备含有200微克/mL最终浓度蛋白酶K的gDNA萃取缓冲器的新鲜工作量。
      注意：不要为此步骤使用旧缓冲区。
   4. 用装有 50μL 压扁缓冲器的移液器尖端将每只苍蝇挤压 10–15 s，无需分配液体。将剩余的缓冲区分配到管中并混合均好。在 37 °C 孵化 20–30 分钟。
   5. 将管放入 95 °C 热块中 1~2 分钟，以激活蛋白酶 K。
   6. 在 10，000 x g下旋转 5 分钟。将准备储存在 4 °C 以进行进一步的 PCR 分析。
4. 使用相同的方法准备gDNA从nos-Cas9苍蝇，这是一个负控制。执行基于PCR的三步屏幕，以识别正确的"结束"HDR（图1，图3）使用每个F1男性的gDNA作为模板^5。在以下 PCR 反应系统中使用 1μL 的 DNA 准备：10 μL 的 2 倍 PCR 主混合染料，每个引物的 1μL（10 μM）、1μL 的 DNA 模板和 7 μL 的 ddH₂O。
5. 如图3A所示，使用引物 fwd1 和 rev1 执行 PCR 以筛选插入或替换是否存在：使用fwd2和rev2引物执行PCR，以验证3'区域的插入或更换;使用引座 M13F 和 rev3 执行 PCR 以检查"结束"HDR（表 1C）。
6. 保持飞行线与确认的结束HDR和建立平衡的股票从F2一代。再次飞向平衡器，以消除其他染色体上任何意外的突变。

Results

图1：CRISPR/Cas9介质基因组编辑的工作流程概述，以生成二进制转录系统。 指示每个步骤所需的大致时间。 请单击此处查看此图的更大版本。

图2：CRISPR筛选和建立基因组编辑的飞行线的基因交叉计划的例证。 在遗传交叉中，R 代表第³ 染色体上的编辑等位基因。 MKRS （Tp （3：3） MRS， M （3） 76A [1] 卡尔 [1] ry [...

Materials