化学干燥法：扫描电子显微镜（SEM）生物样品制备

摘要

来源：Koon, M. A. 等。用于扫描电子显微镜（SEM）形态学分析的原核与真核生物化学干燥制备方法。J. Vis. Exp. (2019)。

扫描电子显微镜（SEM）是一种用于观察生物样品表面特征的有力工具。然而，样品的正确制备对于获得高质量图像至关重要。本视频重点介绍完整成年果蝇（Drosophila）进行SEM观察前的脱水和干燥步骤。

方案

本方案节选自 Koon et al.， 《利用化学干燥法为扫描电子显微镜（SEM）形态学分析制备原核与真核生物》， J. Vis. Exp. （2019年）。

1. 准备与固定

1. 准备 Drosophila melanogaster（果蝇）。
   1. 使用100%二氧化碳麻醉成年果蝇。将麻醉后的成年果蝇（约10至30只）放入一个小的塑料螺口小瓶或1.5 mL离心管中。
   2. 将麻醉后的果蝇浸入1 mL固定液（1.25%戊二醛，0.1 M磷酸缓冲液，pH 7.2）中，在4 °C下固定2小时（或过夜）。如果果蝇漂浮在固定液表面，可加入几滴2.5%聚乙二醇叔辛基苯基醚以降低固定液的表面张力，使组织完全浸没。用玻璃移液管移除固定液。

2. 清洗与脱水

1. 清洗并脱水 Drosophila melanogaster（果蝇）。
   1. 在1.5 mL微量离心管中，用1 mL 0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.2）于室温下清洗固定后的样品三次，每次10分钟。使用玻璃移液管去除每次清洗液时，注意不要将果蝇一并吸出。
   2. 使用梯度乙醇系列对样品进行脱水处理，在微量离心管中每次加入1 mL乙醇，处理10分钟。乙醇浓度依次为：25%、50%、75%、80%、95%、100%。使用玻璃移液管去除乙醇时，注意不要将果蝇一并吸出。
   3. 脱水完成后，保留样品于1.5 mL微量离心管中，加入足量的100%乙醇刚好浸没样品，随后进行干燥处理。

3. 干燥

1. 使用六甲基二硅氮烷（HMDS）进行化学干燥。
   1. 将100%乙醇溶液替换为HMDS与100%乙醇按1:2比例配制的溶液，处理20分钟。再将1:2溶液替换为HMDS与100%乙醇按2:1比例配制的溶液，处理20分钟。随后将2:1溶液替换为100% HMDS，处理20分钟。重复上述步骤一次。
      注意：HMDS易燃，且为急性毒性物质（经皮途径）。操作HMDS时应在化学通风橱内进行，并佩戴适当个人防护装备，包括手套、实验服和眼部防护装置。
   2. 若样品置于1.5 mL微量离心管中，将其转移至一次性铝制称量皿中。转移至铝制称量皿后，用足量新鲜的100% HMDS替换原有HMDS，以完全覆盖样品为宜。
   3. 将样品转移至装有新鲜干燥剂（5–6 cm深）的塑料或玻璃非真空干燥器中，并置于化学通风橱内。或者，也可将样品直接置于化学通风橱中，在容器上加盖松动的盖子（如盒子），以防止碎屑落入样品。让样品干燥12至24小时。

4. 封片

1. 安装 黑腹果蝇 （果蝇）
   1. 在铝制样品台底部贴上标签，以标明其上方所放置的样品。
      在解剖显微镜下，使用精密镊子将干燥的果蝇放置在固定于样品台顶部的粘性胶带或碳导电胶带上所需的位置。
   2. 涂抹银导电胶， 即，使用银漆涂抹在载片的外缘。用牙签将银漆与果蝇连接，以确保导电性。注意避免银漆接触需要成像的区域。
   3. 将样品台放入样品台存放盒中，并将打开的样品台存放盒置于干燥器内。让银漆干燥至少3小时，或过夜以获得最佳效果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
503号银导电胶	Electron Microscopy Sciences	12686-15
铝制称量皿	Fisher Scientific	08-732-100
铝制样品台（12 mm）	Electron Microscopy Sciences	75210
铝制样品台（25 mm）	Electron Microscopy Sciences	75186
粘贴标签	Electron Microscopy Sciences	76760
导电碳粘贴标签	Electron Microscopy Sciences	77825
聚乙二醇叔辛基苯基醚（Triton X-100）	VWR	97062-208
Hitachi 3400N-II 扫描电子显微镜	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	该公司似乎已不再销售此型号