包埋成年 Drosophila 头部于石蜡中：为组织学制备组织样本

摘要

来源：Sunderhaus, E. R., Kretzschmar, D. 大规模组织学定量分析神经退行性变 果蝇 .视频实验杂志 (2016).

本视频介绍了如何使用颈圈法将Drosophila头部包埋于石蜡中，该技术用于制备果蝇头部以进行连续切片。石蜡切片可用于脑部解剖结构的组织学检查以及神经退行性病变的评估。本方案展示了如何在一次制备过程中同时处理多只果蝇，从而提高时间效率并最大限度减少实验误差。

方案

本方案节选自 Sunderhaus 和 Kretzmar, 大规模组织学定量分析神经退行性变 果蝇, 视觉实验杂志. (2016).

1. 将头部固定在套环上并进行石蜡包埋

注意：固定过程中的所有步骤均应在通风橱中进行。甲基苯甲酸酯虽无健康风险，但具有强烈特殊气味，若不在通风橱中操作，气味可能令人难以忍受。

1. 在麻醉果蝇之前，配制50 mL Carnoy溶液：将15 mL氯仿和5 mL冰醋酸加入30 mL 99%乙醇中（切勿将氯仿与冰醋酸直接混合）。将溶液倒入底部平坦的玻璃容器（如结晶皿）中，确保颈圈能够平放并完全浸没于溶液中。
2. 使用CO₂或乙醚麻醉果蝇。
3. 用镊子将果蝇（大多数颈圈可穿入最多20只）从颈部穿入颈圈中。注意使所有果蝇头部朝向一致，如图1A所示，并操作轻柔，避免损伤头部或眼睛。
4. 随机穿入一些sine oculis果蝇（箭头所示，图1A），以便在切片中易于识别果蝇的排列顺序。此外，若实验果蝇眼色较浅或为白色，可在其间穿入若干红眼果蝇（如野生型），以确保有足够的色素用于染色。若使用多个颈圈，需在记录表上记录每只果蝇的顺序及其对应的颈圈编号。
5. 完成一个颈圈后，将其放入已配制好的Carnoy溶液中固定3.5–4小时。
6. 将Carnoy溶液倒入指定的废液容器中，开始乙醇洗涤步骤。倾倒时应缓慢进行，以免扰动容器中颈圈的位置。
7. 用99%乙醇洗涤颈圈两次，每次30分钟。
8. 用100%乙醇洗涤颈圈1小时。务必按时更换洗涤液，防止过度脱水。
9. 将颈圈置于甲基苯甲酸中，在室温下过夜。用Parafilm密封容器，防止甲基苯甲酸挥发。
10. 将甲基苯甲酸倒入通风橱内的适当一次性容器中，加入预先配制的1:1低熔点（56–57 °C）石蜡与甲基苯甲酸混合液。此后，颈圈需始终置于65 °C恒温箱中，以防止石蜡凝固。
11. 将甲基苯甲酸与石蜡混合液倒入适当的一次性容器中，然后将保持在65 °C的熔融纯石蜡倒入颈圈上。
12. 30分钟后更换石蜡，至少重复此步骤5次。总共应进行至少6–8次石蜡浸润。
13. 完成浸蜡后，将颈圈放入橡胶冰格盘中，冰格大小应与颈圈相近。倒入熔融石蜡，完全覆盖颈圈，过夜使其凝固（尽量避免产生气泡）。
14. 从冰格盘中取出含有颈圈的石蜡块。用刀片将石蜡块与颈圈分离，轻轻掰下颈圈。果蝇头部将保留在石蜡块中，而身体部分则留在颈圈内。石蜡块可在室温下保存。
15. 清洁颈圈时，将其在65 °C的脱蜡剂中浸泡以去除残留石蜡，轻柔刷洗后用乙醇冲洗，即可重复使用。

结果

图1：石蜡连续切片。 A) 利用套环法，可将实验组和对照组果蝇作为同一样本处理，将其穿入同一个套环中。插入无眼的sine oculis果蝇用于定位（箭头所示）。B) 示意图显示果蝇头部在套环中的排列方向。C) 本图中，载玻片上切片从左至右排列来自不同果蝇头部的切片，而从上至下则为同一果蝇头部的连续切片。本例中，第3个位置插入了sine oculis果蝇（箭头所示）。切片经切割后，被洗过的荧光眼色素染色。A图中的比例尺=5 mm，C图中的比例尺=0.5 mm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
颈圈	Genesee Scientific	TS 48-100	我们使用的是定制颈圈，由一整块金属制成，而非像Genesee公司的产品那样由多层构成。
用于包埋的橡胶冰格盒	家用商店		可通过粘贴附加壁来按需调整尺寸
结晶皿	Fisher Scientific Company	08-762-3
乙醚	Fisher Scientific Company	E138-1
乙醇	Decon Laboratories Inc.	2701
氯仿	Fisher Scientific Company	C298-500
冰醋酸	Fisher Scientific Company	A38-212
苯甲酸甲酯	Fisher Scientific Company	M205-500	气味明显——请在通风橱中使用！
低熔点石蜡	Fisher Scientific Company	T565	确保在65 °C水浴中额外保持熔融状态