成年个体注射 果蝇 果蝇：化合物或标记物递送方法

摘要

来源：Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. 利用体内吞噬作用检测法评估果蝇Drosophila melanogaster的细胞免疫反应. J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了如何对成年活体果蝇进行注射，并提供了一个示例实验方案，其中将标记的颗粒和台盼蓝注入果蝇腹部，以检测吞噬作用。

方案

本方案节选自 Nazario-Toole 和 Wu， 评估果蝇的细胞免疫反应 黑腹果蝇，使用一个 体内 吞噬作用检测 J. Vis. Exp. (2019).

1. 准备用于注射的荧光素颗粒

1. 通过加入 990 µL 无菌 1x PBS 和 10 µL 50 mM 叠氮化钠，将 10 mg 商业可得的、用荧光素标记的灭活细菌颗粒（参见材料表）重悬至 10 mg/mL 的储存浓度。涡旋混匀。
   1. 分装为每份 8 µL 的单次使用量至 0.2 mL 离心管中，并置于避光盒内 4 °C 保存，以尽量减少光敏感性。
      注意：叠氮化钠防腐剂为可选，若将 10 mg/mL 储存液用 1 mL 无菌 1x PBS 配制后分装并储存于 -20 °C，则可省略叠氮化钠。
2. 通过混合 500 µL 注射器过滤的绿色食用色素与 9.5 mL 无菌 1x PBS，配制 10 mL 的 5% 食用色素溶液（溶于 1x PBS）。
3. 注射前洗涤颗粒以去除叠氮化钠。在 1.7 mL 离心管中混合 42 µL 无菌 1x PBS 与 8 µL 10 mg/mL 颗粒溶液。室温下以最大转速离心 2.5 分钟。
   1. 弃去上清液，加入 50 µL 1x PBS，再次以最大转速室温离心 2.5 分钟。
   2. 重复步骤 1.3 和 1.3.1 两次，共洗涤 3 次。
   3. 最后一次洗涤后，弃去上清液，并将颗粒重悬于 50 µL 含 5% 食用色素的 1x PBS 溶液中，终浓度为 1.6 mg/mL。
   4. 用铝箔包裹离心管以避光。4 °C 保存，1 周后弃用。

2. 准备注射站和果蝇

1. 准备注射垫。若需同时注射最多4种基因型的果蝇，使用实验室胶带将一个矩形的 CO₂ 果蝇操作垫均分为4个区域。在显微镜附近的实验台上，为每个垫片角落预留放置试管的区域，用于存放已排好队的果蝇试管。
2. 准备年龄一致、4至7日龄的果蝇用于注射。针对每种待测品系，将5只雄性和5只雌性转移至装有预置果蝇培养基的新试管中，并做好标记，随后置于25 °C条件下培养。
3. 设置气动注射仪（见材料表），将仪器调节至100毫秒的定时模式（通过短时气体脉冲推动液体，实现亚纳升级别体积的精确递送）。
4. 准备显微镜载玻片。裁剪1.5英寸长的电工胶带，将其粘性面向外折叠成环状，然后贴附在已标记的显微镜载玻片上。

3. 准备玻璃毛细针

1. 使用拉针仪拉制玻璃针（薄壁玻璃毛细管）。
   1. 用显微镜和千分尺固定针尖，并使用#5精细不锈钢镊子折断针尖。针尖直径约为100 µm时，足以刺穿果蝇的表皮，同时尽量减少损伤。
   2. 测量将要注入每只果蝇体内的液体体积。用含5%食用色素的无菌1×PBS溶液填充玻璃针，然后将液体排出至置于0.01 mm载物台测微尺上的一滴矿物油中。
      注意：若液滴呈球形，则其皮升级体积可通过公式 (直径)³/1910 计算。直径为100 µm的针尖在100 ms内可喷出约2 nL液体。

4. 注射果蝇

1. 用移液器将 10 µL 浓度为 1.6 mg/mL 的颗粒滴加到一小块 Parafilm 上。
   1. 将液体吸入针头，并安装至注射器喷嘴中（参见 材料表）。
   2. 用 CO₂ 麻醉果蝇，将其整齐排列在果蝇操作垫的指定区域，腹面朝上，头部朝向操作垫前方。将培养瓶放置在实验台相应的区域。
   3. 在腹部上角位置注射果蝇，使用 5 次、每次 100 毫秒的液体脉冲（总计约 10 nL）。
   4. 将注射后的果蝇转移至相应的培养瓶中，并在瓶上记录时间。于 25 °C 条件下培养。
2. 用新的针头吸取 0.4% 台盼蓝溶液。
3. 将气动注射器设置为 GATED 模式，以维持恒定气流推动液体从针头中流出。
4. 在果蝇休息 30 分钟后进行麻醉，并注射台盼蓝，直至腹部完全充盈并膨胀。
   注意：当使用 pH 敏感性染料标记的颗粒研究吞噬体成熟过程时，应让果蝇休息 1 小时，并在固定果蝇前避免注射台盼蓝。
5. 用透明胶带将果蝇固定在显微镜载玻片上，腹面朝下。将翅膀拨至果蝇身体两侧并粘附于胶带上。同时，轻轻将头部压入胶带，确保果蝇不会移动。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5430-10 PicoNozzle 试剂盒	World Precision Instruments	5430-10	用于 1.0 mm 移液管的支架
大肠杆菌（K-12 菌株）BioParticles，荧光素偶联物	Invitrogen	E2861	经灭活的大肠杆菌，标记有 FITC（荧光素）。用于检测吞噬细胞对革兰氏阴性菌的识别和摄取。（~494/~518 nm）
玻璃微电极拉制仪	David Kopf Instruments	Model 725
气动 PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	World Precision Instruments 气动 PicoPump PV820 利用差压法在注射间隙将液体保持在玻璃针头内。 用户手动控制短时气体压力脉冲以排出液体，从而实现亚纳升级别体积的递送。– 递送液体的量主要取决于两个变量：–玻璃针头开口的大小以及施加注射压力的时间。 将仪器设置为 100 ms 的“定时”模式"TIMED"。
薄壁玻璃毛细管	World Precision Instruments	TW100F-3	用于注射的针管。外径 = 1.0 mm
台盼蓝溶液（0.4%）	Sigma	T8154	用于淬灭荧光素、Alexa Fluor 或德克萨斯红标记颗粒的细胞外荧光。