味觉偏好实验：一种测量摄食行为的方法 黑腹果蝇

摘要

来源：Bantel, A. P. 和 Tessier, C. R. 成年个体味觉偏好检测 果蝇. 视频实验杂志 (2016).

本视频介绍了味觉偏好检测法，这是一种行为学方法，通过检测果蝇摄取偏好物质后腹部的颜色变化，来衡量其对不同味道的有色溶液的趋向性或回避性。本方案展示了用于测定果蝇对不同蔗糖浓度溶液偏好的实验操作流程。

方案

本方案节选自 Bantel 和 Tessier 的《成年个体味觉偏好检测方法》 果蝇， J. Vis. Exp. (2016).

1. 饥饿处理

1. 通过在标准果蝇小瓶底部放置一个用18.2 MΩ水充分浸湿的棉球来制备饥饿用果蝇小瓶。或者，也可将一小条滤纸用18.2 MΩ水充分浸湿后斜置于小瓶内。
2. 在CO₂麻醉垫上收集约100只果蝇为一组，然后将果蝇转移至已准备好的小瓶中。
   注意：使用年龄小于5天的果蝇效果最佳。然而，果蝇的确切年龄可作为实验变量加以控制，以确定味觉偏好随时间的变化。
3. 使用棉塞或泡沫塞密封小瓶。将小瓶平放在环境可控的培养箱中，保持温度为25 °C，湿度高于70%。静置培养24小时，期间不要扰动小瓶。

2. 味觉偏好实验

1. 在测试当天准备所有用于实验的味觉刺激物。
   注意： 具体使用的味觉刺激物将根据所研究的实验问题而有所不同。以下为本方案中使用的示例味觉刺激物。有关优化方法，请参见第4节。
   1. 通过混合10 µl的100 mM蔗糖溶液、13 µl红色食用色素和977 µl的18.2 MΩ水，制备对照味觉刺激物（1 mM蔗糖）。
   2. 通过混合50 µl的100 mM蔗糖溶液、10 µl蓝色食用色素和940 µl的18.2 MΩ水，制备实验味觉刺激物（5 mM蔗糖）。
2. 使用标准的100 mm × 15 mm塑料培养皿制备实验腔室，具体操作如下：
   1. 在培养皿边缘靠近12点钟位置放置3滴10 µl的对照味觉刺激物，在6点钟位置再放置3滴。确保各液滴之间的间距大致相等。
   2. 在培养皿边缘靠近3点钟位置放置3滴10 µl的实验味觉刺激物，在9点钟位置再放置3滴。确保各液滴之间的间距大致相等。
   3. 根据需要重复步骤2.2.1和2.2.2，以完成所需数量的重复实验。
3. 将一管约100只饥饿处理的果蝇轻轻倒在CO₂麻醉垫上，麻醉时间以刚好使所有果蝇完全麻醉为宜（约10秒）。用毛刷将果蝇转移至已准备好的实验腔室中央，并盖上培养皿盖。
   注意： 应避免过长的CO₂暴露时间，以缩短恢复时间并减少对摄食行为的干扰。可改用冰上麻醉（约5分钟），以避免即使短暂暴露于CO₂也可能引起的行為效应。
4. 将实验腔室放入不透明的纸板箱中。务必在纸板箱外标注所测试的实验条件和基因型。
5. 将整个装置（即步骤2.4中所述置于纸板箱内的实验腔室）放入温度为25 °C、湿度至少为70%的培养箱中，孵育2小时。
6. 对所有重复样本重复执行步骤2.3至2.5。
7. 2小时后，将仍置于纸板箱中的实验腔室直接转移至-20 °C冰箱中冷冻，直至准备进行定量分析。

3. 味觉偏好实验定量分析

1. 让单个检测室升温至室温（约 5 分钟）。
2. 在解剖显微镜下，使用毛刷或镊子根据动物腹部的颜色将其分组：红色、蓝色、紫色或无色（图 1）。
3. 记录每组动物的数量。将无色动物视为未参与检测，因此在任何计算中均不包含这些动物。
4. 根据以下公式之一计算偏好指数：
   1. 如果目标实验味质添加至红色染料中，则使用 (N_red + 0.5N_purple)/(N_red + N_blue + N_purple)。
   2. 如果实验味质添加至蓝色染料中，则调整公式为 (N_blue + 0.5N_purple)/(N_blue + N_red + N_purple)。
5. 对所有实验条件和重复组重复上述计算。

4. 味觉偏好实验的优化

1. 通过以下方法经验性地确定所用食用色素指示剂的浓度，以确保食用色素不会影响味觉检测的结果：
   1. 使用相同的基础化合物配制4种味觉刺激物（例如 5 mM 蔗糖），具体操作如步骤 2.1 所述，但省略食用色素。
   2. 向其中一种呈味物质中加入1.3%的红色食用色素。其余3种呈味物质分别用不同浓度的蓝色食用色素配制，每种置于不同的试管中（例如 0.6%、1% 和 1.3%
   3. 对每一对呈味物质完成步骤2.2至3.4：1.3%红色 vs. 0.6%蓝色；1.3%红色 vs. 1%蓝色；以及1.3%红色 vs. 1.3%蓝色。
   4. 重复步骤 4.1.1–4.1.3，使用不同百分比的蓝色食用色素，直至偏好指数平均值达到 0图2).
      注意： 作为起始点，通常将1.3%的红色食用色素与1%的蓝色食用色素结合可获得良好效果。若无法找到与1.3%染料相匹配的满意蓝色食用色素浓度，则可重复步骤4.1.1至4.1.3，使用不同浓度的红色色素并保持蓝色食用色素浓度恒定。
   5. 以相同的优化食用色素浓度分析所有待测条件。

结果

图1：味觉偏好实验结果。 图中展示了腹部着色变异的一些示例。摄入深红色染料（A）。摄入浅红色染料（B）。摄入深蓝色染料（C）。摄入浅蓝色染料（D）。当整个腹部呈现紫色着色时，记为紫色腹部（E）；或当腹部不同区域分别显示红色部分（箭头）和蓝色部分（箭）时，也记为紫色腹部（F）。请点击此处查看该图的放大版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蓝色食用色素（水、丙二醇、FD&C 蓝色 1 号和红色 40 号、丙基对羟基苯甲酸酯）	McCormick	N/A
无分隔冷冻盒（Cryo/Freezer Boxes）	Fisher	03-395-455
Dumont #5 镊子	精细科学工具公司（Fine Science Tools）	11251-20
Leica S6 E 体视变倍显微镜 0.63X-4.0X	W. Nuhsbaum 公司（W. Nuhsbaum, Inc.）	10446294
培养皿（100 mm × 15 mm）	BD Falcon	351029	若彻底清洗并干燥后可重复使用
Quick-Snap 微量管	Alkali Scientific 公司（Alkali Scientific Inc.）	C3017
红色食用色素（水、丙二醇、FD&C 红色 40 号和 3 号、丙基对羟基苯甲酸酯）	McCormick	N/A
蔗糖	IBI Scientific	IB37160