幼虫体壁制备：一种用于观察完整感觉神经元及其相关表皮细胞的方法

摘要

来源：Tenenbaum, C. M., Gavis, E. R. 去除 果蝇 用于感觉神经元和表皮细胞免疫荧光分析的幼虫鱼片肌肉组织. J. Vis. Exp. (2016).

本视频介绍了如何制备用于观察感觉树突分支（da）神经元及其相关表皮细胞的幼虫肌片。该方案详细展示了如何在保留细胞形态的前提下，从体壁上剥离肌肉组织，从而改善免疫染色效果，使原本难以观察的da神经元和表皮细胞更清晰可见。

方案

本方案节选自 Tenenbaum 和 Gavis 的研究《用于感觉神经元和表皮细胞免疫荧光分析的幼虫肌组织中 Drosophila 的去除方法》，发表于《视觉实验杂志》（J. Vis. Exp.，2016 年）。

注意： 肌肉去除的操作步骤（图1) 是对先前所述制备幼虫肌片方法的改进。肌肉去除前后步骤仅作简要概述，读者可参考 Brent 之前的研究工作。 等，J. Vis. Exp. (2009) 和 Karim 与 Moore， 视频实验杂志 （2011）以获取更详细的描述。

1. 在冷盐溶液中解剖幼虫

1. 配制冷的 HL3.1 生理盐水或无 Ca²⁺ 的 HL3.1 生理盐水工作液（表 1）。将幼虫置于硅胶弹性体培养皿中，加入足够覆盖皿底的冷盐水即可。
   注意：我们建议在幼虫解剖过程中尝试使用无 Ca²⁺ 的 HL3.1 生理盐水与标准 HL3.1 生理盐水进行比较。在无钙条件下，幼虫肌肉收缩显著减少，因此在无 Ca²⁺ 的 HL3.1 生理盐水中解剖时，幼虫肌片更易于操作。然而，我们发现肌肉收缩可在肌肉与表皮之间产生间隙，有助于镊子插入这些组织之间，同时最大限度降低对表皮的损伤风险。因此，使用标准 HL3.1 生理盐水可能更有利于保持表皮和 da 神经元的完整性。两种盐水均可获得良好结果，具体选择由使用者决定。
2. 将幼虫腹面朝上放置。幼虫腹面可通过腹部的齿带识别，背面则可通过从头端到尾端走向的主要幼虫气管识别。沿前后方向拉伸幼虫，并用昆虫针将其头部和尾部固定在硅胶弹性体解剖皿上。使用精细解剖剪沿腹中线剪开，从一端开始逐步向另一端推进。
   注意：此方向可保留常被研究的背部 da 神经元簇。
3. 幼虫被剪开后，将四个角固定在解剖皿上，如同打开一本书。用镊子夹取并移除包括中枢神经系统、肠道和气管在内的内部器官。调整昆虫针位置，使肌片绷紧但不过度拉伸。
   注意：肌肉在体壁的节段边界处固定。尽管肌肉覆盖了大部分体壁，但在背中线附近的一个狭窄区域则无肌肉分布。

2. 肌肉去除

1. 找到幼虫的背侧中线，此处无肌肉组织。将一把镊子的一个尖端置于肌肉组织下方，使其以尽可能扁平的方向插入。
2. 从体节前缘附近的背侧中线开始，小心地将镊子尖端在肌肉与表皮之间滑动，注意尽量减少镊子与表皮的接触。
3. 向上提起镊子，以断开肌肉与体壁在一个锚定点的连接。对其他感兴趣的半体节重复此操作。
   注意：本方案旨在优化每个da神经元树突区域后部的保存。若需保存树突区域的前部，最好从每个体节的后端插入镊子尖端。
4. 重新调整昆虫针的位置，使幼虫展开组织在各个方向上被最大程度拉伸。
5. 将仍固定在解剖皿中的展开组织用预冷的新鲜配制的含4%多聚甲醛的PBS溶液固定25分钟。
6. 用PBS清洗5次。
7. 用镊子小心地从其余锚定点剥离肌肉组织，注意尽量减少与表皮的接触。
8. 取下固定针，将展开组织从解剖皿转移至1.5 ml微量离心管中。后续所有洗涤、封闭及免疫荧光染色步骤均按照Karim和Moore，J. Vis. Exp. (2011)中所述方法进行。

结果

图1：肌肉去除操作流程示意图。 将一条幼虫解剖后固定于硅胶弹性解剖盘上。为去除肌肉组织，使用一把镊子的一个尖端从体节边界附近的背侧中线处插入肌肉与表皮细胞层之间（2.2）。向上拉动镊子，以切断肌肉与体壁之间的连接（2.3）。对目标体节重复此操作，随后用甲醛固定幼虫（2.5）。固定完成后，使用镊子将残留的肌肉组织与体壁分离（2.7 - 2.8）。图中橙色表示幼虫的角质层和表皮，绿色表示IV类da神经元，红色表示肌肉。图（2.2）和（2.7）中的插图为单个幼虫半体节的横截面示意图。请点击此处查看该图的放大版本。<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dumont #5 镊子	Electron Microscopy Sciences	72701-D
微型剪刀，8 cm，直头，5 mm 刀片，0.1 mm 尖端	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒	Dow Corning	3097358-1004	用于解剖板
Austerlitz 昆虫针，0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 光源	Artisan Technology Group	62792-4